CN102746992A - 一种利用污泥水解液异养培养小球藻的方法 - Google Patents

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Abstract

一种利用污泥水解液异养培养小球藻的方法，它涉及一种异养培养小球藻的方法。本发明要解决现有微藻生物柴油成本高的问题。本发明的方法：一、取生活污水处理厂的剩余污泥，超声处理；二、将污泥在转速为180r/min，温度为35℃的条件下，进行厌氧水解2~3d，调pH值至9.0，每12h进行氮气吹脱，得污泥水解液，加入除氮磷外的微量元素和其他营养元素，进行高压蒸汽灭菌，得培养液；三、按体积百分比10~20%接种小球藻，然后置于振荡培养箱中，进行培养150~180h，即完成小球藻的培养。本发明的方法能够节省小球藻的生产成本，为生物柴油的商业化生产提供廉价的原料。本发明应用于生物柴油制备领域。

Description

一种利用污泥水解液异养培养小球藻的方法
技术领域
本发明涉及一种异养培养小球藻的方法。
背景技术
化石燃料耗尽是全球关注的焦点，现有的科学技术也不能解决目前的能源需求问题。对原油的大量应用导致化石燃料价格的增加（其中运输系统是消耗主体），同时，由于温室气体排放量增加，引起了环境问题。对可再生能源的开发成为能源与环境领域的研究热点，例如太阳能、生物质能、地热、水和风能其中，生物质能。因为可再生能源的可再生性、可生物降解性、无毒性，使其成为一种非常具有潜力的能源，并且具有大量的资源来源，例如，农牧业废弃物、市政废弃物、工业废弃物、陆生和水生植物等。
目前，可以替代传统柴油的能源是生物柴油。种植陆生作物来提取生物柴油具有很大的吸引力，但是由于土地的限制因素，在理论上很难成立，因为这对经济和能源平衡发展不利（Klass,1979）。在生物能源的研究中，原料的高成本和生态-食物链系统是必须要考虑的因素。
与传统作物的油料作物种子不同，微藻可以固定高浓度工业CO2，具有更高的光合效率，更高的生物积累量，生长更快，还具有多样的代谢物，能够在开放式池塘跑道系统和密闭发酵系统中生长，而不必占用耕地和森林。另外，研究表明，某些微藻在异养条件或混合培养条件下，与自养条件相比，会生长得更快，并且会积累更多的生物量和油脂含量。所以，微藻产生物柴油成为一个研究的热点。
虽然目前国内对于微藻能源的研究很多，但是以工农业废水作为培养基的研究还是近几年才兴起的，系统全面地综述还是空白。与此同时，在我国，污泥中有机质含量约为37.18%。这些有机物质主要以蛋白和多糖等大分子物质的形式存在，在厌氧条件下，这些有机物经过厌氧微生物的水解后可以转化为小分子有机酸和甲烷等物质，这些小分子的有机物很容易被微生物利用，因此可以作为一种潜在的资源被回收利用。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有微藻生物柴油成本高的问题，而提供的一种利用污泥水解液异养培养小球藻的方法。
本发明的一种利用污泥水解液异养培养小球藻的方法是按照以下步骤进行的：一、污泥超声处理：取生活污水处理厂的剩余污泥，将污泥含水率浓缩至质量百分含量为98%~98.5%，在声能密度为5~10W/mL、脉冲比例为2:1的条件下，进行超声处理8~10min；二、污泥水解液的制取：将步骤一超声处理后的污泥在转速为180r/min，温度为35℃的条件下，进行厌氧水解2~3d，水解过程中，每12h调节一次pH值至9.0，并在氮气流量为0.3m3/h的条件下，每12h进行一次氮气吹脱，即得污泥水解液；三、向步骤二得到的污泥水解液中加入微量元素和其它营养元素，进行高压蒸汽灭菌，得培养液；四、小球藻的异养培养：将步骤三得到的培养液冷却至室温后，在超净工作台中将小球藻按体积百分比为10%~20%的接种量接种到培养液中，然后置于振荡培养箱中培养150~180h，即完成小球藻的培养；其中，步骤三中的培养液中微量元素加入量为1mL/L，培养液中其它营养元素的加入量1mL/L，培养液中污泥水解液加入量为3500~4000mg/L，步骤四中所述的培养条件为0lux、30℃和120rpm。
本发明包含以下有益效果：
本发明采用污泥水解液异养培养小球藻制备生物柴油，能够节省小球藻的生产成本，为生物柴油的商业化生产提供廉价的原料；同时使污水处理厂剩余污泥中的营养成分得到充分的利用，变废为宝，实现污泥的资源化利用。
本发明采用生活污水处理厂的剩余污泥含有丰富的营养物质，包括可利用的碳源，氮磷营养盐等。剩余污泥是指由于微生物的代谢和生物合成作用，使得曝气池中的活性污泥生物量增加，经二次沉淀池沉淀下来的污泥，其中一部分回流到曝气池供再处理污水用，多余的排放到系统之外。排放的这部分污泥称为剩余污泥。本发明即利用这部分剩余污泥，由于生活污水厂剩余污泥由菌体细胞组成，其经过厌氧水解后，均可以产生多种小分子有机酸，主要包括乙酸，丙酸，丁酸，异丁酸，戊酸和异戊酸。此外，由于生活污水厂剩余污泥中不含有工业有毒物质，其水解液可不经过脱毒处理直接用于小球藻的培养。其中异戊酸，异丁酸被用来小球藻的生长，乙酸，丙酸，丁酸，戊酸在小球藻的生长对数期和稳定期有很大消耗速率，在生长对数期用于小球的生长，在稳定期用于合成小球藻能量物质进行储存，小球藻能够很容易利用这些小分子有机酸。污泥水解液中的多糖和蛋白也会被分解，然后用于小球藻的生长和能量物质储存，污泥水解液中所含的氮磷营养元素也得到了很好的利用。
附图说明
图1为小球藻在15g/L葡萄糖SE培养基、单纯的污泥水解液和加入除氮磷外的营养物质的污泥水解液培养小球藻的生物量比较曲线图；其中，
Figure BDA00001891424100021
为15g/L葡萄糖SE培养基培养的小球藻生物量曲线，
Figure BDA00001891424100022
为加入除氮磷外的营养物质的污泥水解液培养的小球藻生物量曲线，
Figure BDA00001891424100023
为单纯污泥水解液培养的小球藻生物量曲线；
图2为小球藻在15g/L葡萄糖SE培养基、单纯的污泥水解液和加入除氮磷外的营养物质的污泥水解液培养小球藻的含油量比较曲线图；其中，
Figure BDA00001891424100024
为15g/L葡萄糖SE培养基培养的小球藻含油量曲线，
Figure BDA00001891424100031
为加入除氮磷外的营养物质的污泥水解液培养小球藻含油量曲线，
Figure BDA00001891424100032
为污泥水解液培养的小球藻生含油量曲线；
图3为污泥水解液中各组分在小球藻生长过程中的消耗曲线图；其中，为乙酸消耗曲线，
Figure BDA00001891424100034
为丙酸消耗曲线，为丁酸消耗曲线，为异丁酸消耗曲线，
Figure BDA00001891424100037
为戊酸消耗曲线，
Figure BDA00001891424100038
为异戊酸消耗曲线，
Figure BDA00001891424100039
为生物量。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式的一种利用污泥水解液异养培养小球藻的方法是按照以下步骤进行的：一、污泥超声处理：取生活污水处理厂的剩余污泥，将污泥含水率浓缩至质量百分含量为98%~98.5%，在声能密度为5~10W/mL、脉冲比例为2:1的条件下，进行超声处理8~10min；二、污泥水解液的制取：将步骤一超声处理后的污泥在转速为180r/min，温度为35℃的条件下，进行厌氧水解2~3d，水解过程中，每12h调节一次pH值至9.0，并在氮气流量为0.3m3/h的条件下，每12h进行一次氮气吹脱，即得污泥水解液；三、向步骤二得到的污泥水解液中加入微量元素和其它营养元素，进行高压蒸汽灭菌，得培养液；四、小球藻的异养培养：将步骤三得到的培养液冷却至室温后，在超净工作台中将小球藻按体积百分比为10%~20%的接种量接种到培养液中，然后置于振荡培养箱中培养150~180h，即完成小球藻的培养；其中，步骤三中的培养液中微量元素加入量为1mL/L，培养液中其它营养元素的加入量1mL/L，培养液中污泥水解液加入量为3500~4000mg/L，步骤四中所述的培养条件为0lux、30℃和120rpm。
本实施方式采用污泥水解液异养培养小球藻制备生物柴油，能够节省小球藻的生产成本，为生物柴油的商业化生产提供廉价的原料；同时使污水处理厂剩余污泥中的营养成分得到充分的利用，变废为宝，实现污泥的资源化利用。
本实施方式采用生活污水处理厂的剩余污泥含有丰富的营养物质，包括可利用的碳源，氮磷营养盐等。经过厌氧水解后，会产生很多小分子有机酸，主要包括乙酸，丙酸，丁酸，异丁酸，戊酸和异戊酸。异戊酸，异丁酸被用来小球藻的生长，乙酸，丙酸，丁酸，戊酸在小球藻的生长对数期和稳定期有很大消耗速率，在生长对数期用于小球藻的生长，在稳定期用于合成小球藻能量物质进行储存，小球藻能够很容易利用这些小分子有机酸。污泥水解液中的多糖和蛋白也会被分解，然后用于小球藻的生长和能量物质储存，污泥水解液中所含的氮磷营养元素也得到了很好的利用。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤二中所述的pH值调节采用1mol/L的NaOH进行。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一至二不同的是：步骤三中所述的高压蒸汽灭菌操作条件为：121℃，121KPa，灭菌30min。其它与具体实施方式一至二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤四中所述的接种小球藻为生长到吸光度为1～2的小球藻。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤三中所述的微量元素是由286mg/L的H3BO3、80mg/L的CuSO4·5H2O、186mg/L的MnCl2·4H2O、390mg/L的Na2MoO4·2H2O、50mg/L的Co(NO3)2·6H2O和220mg/L的ZnSO4·7H2O组成的。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤三中的其它营养元素是由75mg/L的MgSO4·7H2O，25mg/L的CaCl2·2H2O，25mg/L的NaCl和0.5mg/L的FeCl3·6H2O组成的。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤二中的污泥水解液的制取方法还包括热解法、臭氧氧化法、碱破解法或加酶强化法。
其它与具体实施方式一至六之一相同。
通过以下试验验证本发明的效果：
本试验的一种利用污泥水解液异养培养小球藻的方法是通过以下步骤进行的：一、污泥超声处理：取生活污水处理厂的剩余污泥，将污泥含水率浓缩至98.4%，在声能密度为5W/mL、脉冲比例为2:1的条件下，进行超声处理10min；二、污泥水解液的制取：将步骤一超声处理后的污泥在转速为180r/min，温度为35℃的条件下，进行厌氧水解3d，水解过程中，每12h调节pH值至9.0，并在氮气流量为0.3m3/h的条件下，每12h进行氮气吹脱，即得污泥水解液；三、将步骤二的污泥水解液调节pH值至6.8，加入除氮磷外的微量元素和其他营养物质，然后在121℃，121KPa条件下，高压锅蒸汽灭菌30min，得培养液；四、小球藻的异养培养：将步骤三得到的培养液冷却至室温后，在超净工作台中按体积百分比为15%的量接种对数生长后期，OD值在1~2的小球藻，置于振荡培养箱中，在培养条件为：0lux，30℃，120rpm的条件下，进行培养168h，即完成小球藻的培养；其中，步骤三中的培养液中微量元素加入量为1mL/L，培养液中其它营养元素的加入量1mL/L，培养液中污泥水解液加入量为3756mg/L。
本试验步骤三中所述的微量元素为286mg/L的H3BO3、80mg/L的CuSO4·5H2O、186mg/L的MnCl2·4H2O、390mg/L的Na2MoO4·2H2O、50mg/L的Co(NO3)2·6H2O、220mg/L的ZnSO4·7H2O。
本试验步骤三中的其它营养元素为75mg/L的MgSO4·7H2O，25mg/L的CaCl2·2H2O，25mg/L的NaCl，0.5mg/L的FeCl3·6H2O。
本试验的小球藻培养过程中污泥水解液的变化情况如图3所示。
本试验的小球藻（Chlorella Protothecoides）购买自中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库，保藏编号为：FACHB-3，来源于捷克布拉格大学。
将本试验得到的小球藻进行生物柴油提取试验：
采用离心法收集小球藻，在60℃温度下烘干至恒重，采用溶液浸提法，用有机溶剂在180rpm转速下反应8h，提取小球藻的油脂（为了做到没有气体挥发，盛有有机溶剂的锥形瓶瓶口需要用铝箔纸密封）；再加入40mL蒸馏水作为诱导两相稳定的引导，然后放入恒定的温度振动箱中，采用脂肪酶进行酯交换反应，酯交换反应后将反应物通过分液漏斗分层，将上层的物质分离出后，用50℃蒸馏水洗涤至中性，即得生物柴油，其中，酯交换反应是指：加入75%脂肪酶（基于油重）和10%的蒸馏水（基于油重），按甲醇与油脂的摩尔比为3:1的比例均分为3次加入甲醇，在温度为38℃，PH值为7.0，转速为180rpm反应4h。
本试验中的有机溶剂是由正己烷：异丙醇按体积比为3：2的比例混合而成。
本试验的脂肪酶是购买得到的。
通过气相色谱和质谱（GC-MS法）确定本试验的生物柴油成分为：烷酸甲酯和油酸甲酯。说明采用本发明污泥水解液异养培养的小球藻能够有效的制备生物柴油。
同时，通过不同培养条件，检测小球藻的生物量和含油量的变化情况。
污泥水解液的制备：一、污泥超声处理：取生活污水处理厂的剩余污泥，将污泥含水率浓缩至98.4%，在声能密度为5W/mL、脉冲比例为2:1的条件下，进行超声处理10min；二、污泥水解液的制取：将步骤一超声处理后的污泥在转速为180r/min，温度为35℃的条件下，进行厌氧水解3d，水解过程中，每12h调节一次pH，调节pH值至9.0，并在氮气流量为0.3m3/h的条件下，每12h进行1次氮气吹脱，即得污泥水解液；
将制得的污泥水解液与15g/L葡萄糖SE培养基和单纯利用污泥水解液、加入除氮磷外的微量元素和其他营养物质的污泥水解液的培养基作为对照；在超净工作台中按体积百分比为10~20%的量将小球藻接种到上述三种培养基中，在培养条件为：0lux，30℃，120rpm的条件下，进行小球藻培养168h，检测小球藻的生物量变化；其中，微量元素为286mg/L的H3BO3、80mg/L的CuSO4·5H2O、186mg/L的MnCl2·4H2O、390mg/L的Na2MoO4·2H2O、50mg/L的Co(NO3)2·6H2O、220mg/L的ZnSO4·7H2O；其它营养元素为75mg/L的MgSO4·7H2O，25mg/L的CaCl2·2H2O，25mg/L的NaCl，0.5mg/L的FeCl3·6H2O。
结果如图1所示，由图1可知小球藻均在60h左右达到最大值，进入稳定期生长，利用15g/L葡萄糖溶液作为底物时，最大生物量为0.625g/L；利用加入营养物质的污泥水解液作为底物异养培养小球藻时，小球藻细胞生长达到最大值为0.495g/L；只利用污泥水解液培养小球藻时，最大值只有0.3425g/L。结果表明，虽然加入除氮磷外的其它营养物质的污泥水解液培养小球藻的效果没有15g/L葡萄糖溶液培养小球藻的效果好，但效果很接近。这表明，利用污泥水解液作为有机碳源来培养小球藻是可行的。小球藻可以利用厌氧水解产生的小分子有机酸及其他营养物质来进行生长。
同时，还检测了小球藻的含油量变化，结果如图2所示，由图2可知在稳定期末期，加入其它营养物质的污泥水解液、15g/L葡萄糖溶液、只利用污泥水解液培养小球藻的含油量分别为21.50%，31.05%，19.02%。结合三种培养条件下小球藻的生物量图和油脂累积图，我们可以得出，利用污泥水解液异养培养小球藻制备生物柴油具有很大的潜力，是可行的。
同时，对污泥水解液的小分子酸消耗情况进行检测，结果如图3所示，由图3可知异戊酸在24h之后，48h时，首先迅速被利用完，异丁酸在48h后，72h时，迅速被用完，而乙酸，丙酸，丁酸，戊酸均在48h~144h内有较大的消耗，这处在小球藻生长的对数期和稳定期，小球藻利用消耗这些碳源，用于自身的生长和油脂的积累。

Claims (7)

1.一种利用污泥水解液异养培养小球藻的方法，其特征在于利用污泥水解液异养培养小球藻的方法是按照以下步骤进行的：一、污泥超声处理：取生活污水处理厂的剩余污泥，将污泥含水率浓缩至质量百分含量为98%~98.5%，在声能密度为5~10W/mL、脉冲比例为2:1的条件下，进行超声处理8~10min；二、污泥水解液的制取：将步骤一超声处理后的污泥在转速为180r/min，温度为35℃的条件下，进行厌氧水解2~3d，水解过程中，每12h调节一次pH值至9.0，并在氮气流量为0.3m3/h的条件下，每12h进行一次氮气吹脱，即得污泥水解液；三、向步骤二得到的污泥水解液中加入微量元素和其它营养元素，进行高压蒸汽灭菌，得培养液；四、小球藻的异养培养：将步骤三得到的培养液冷却至室温后，在超净工作台中将小球藻按体积百分比为10%~20%的接种量接种到培养液中，然后置于振荡培养箱中培养150~180h，即完成小球藻的培养；其中，步骤三中的培养液中微量元素加入量为1mL/L，培养液中其它营养元素的加入量1mL/L，培养液中污泥水解液加入量为3500~4000mg/L，步骤四中所述的培养条件为0lux、30℃和120rpm。
2.根据权利要求1所述的一种利用污泥水解液异养培养小球藻的方法，其特征在于步骤二中所述的pH值调节采用1mol/L的NaOH进行。
3.根据权利要求1所述的一种利用污泥水解液异养培养小球藻的方法，其特征在于步骤三中所述的高压蒸汽灭菌操作条件为：121℃，121KPa，灭菌30min。
4.根据权利要求1所述的一种利用污泥水解液异养培养小球藻的方法，其特征在于步骤四中所述的接种小球藻为生长到吸光度为1~2的小球藻。
5.根据权利要求1所述的一种利用污泥水解液异养培养小球藻的方法，其特征在于步骤三中所述的微量元素是由286mg/L的H3BO3、80mg/L的CuSO4·5H2O、186mg/L的MnCl2·4H2O、390mg/L的Na2MoO4·2H2O、50mg/L的Co(NO3)2·6H2O和220mg/L的ZnSO4·7H2O组成的。
6.根据权利要求1所述的一种利用污泥水解液异养培养小球藻的方法，其特征在于步骤三中的其它营养元素是由75mg/L的MgSO4·7H2O，25mg/L的CaCl2·2H2O，25mg/L的NaCl和0.5mg/L的FeCl3·6H2O组成的。
7.根据权利要求1所述的一种利用污泥水解液异养培养小球藻的方法，其特征在于步骤二中的污泥水解液的制取方法还包括热解法、臭氧氧化法、碱破解法或加酶强化法。
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