CN105602982A - 一种高生长速率的隐甲藻突变株的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种高生长速率的隐甲藻突变株的构建方法，具有高生长速率的微藻隐甲藻ATCC？30556基因删除突变株的方法。其特征是包含如下步骤：(1)隐甲藻光合作用相关基因核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶Rubisco基因的克隆；(2)用于同源双交换整合的基因片段的构建；(3)Rubisco基因的删除和突变株的构建；(4)隐甲藻Rubisco基因删除突变体生长特性的比较分析。利用本发明的方法定点敲除隐甲藻的Rubisco基因，能够获得异养培养条件下具有高生长速率的隐甲藻突变株，为二十二碳六烯酸(DHA)高效发酵菌种的优化筛选提供了一种新方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种高生长速率的隐甲藻突变株的构建方法，特别是一种高生长速率的产二十二碳六烯酸(DHA)隐甲藻突变体的构建方法，具体是构建具有高生长速率的隐甲藻基因删除突变株的方法，属于工业微生物领域，
背景技术
二十二碳六烯酸DHA(docosahexaenoicacid)是n-3系多不饱和脂肪酸(n-3polyunsaturatedfattyacid,n-3PUFA)的一种。其含有6个不饱和键的特殊结构决定了它对人类健康有着特殊的作用和影响。人们对DHA的研究备受重视的另一个原因是发现DHA与生命现象密切相关，其在大脑的结构膜和视网膜中其中决定性的作用。
截止目前为止，深海鱼油一直是市售的DHA的主要来源。但这一主要来源存在诸多缺点，比如海洋污染造成的对鱼油安全性的担忧，鱼油质量会随着鱼的种类、捕捞季节和地点的不同而不同，含EPA、易受环境污染、纯化成本高，鱼油的特殊气味也限制了鱼油来源的DHA作为一种食品添加剂的应用。尤其是考虑到DHA的主要消费者是怀孕妇女和年幼的孩子，其可能的不利影响更令人担忧；此外，世界渔业资源的逐年萎缩对DHA的可持续性供应的影响也值得考虑。
利用隐甲藻(Crypthecodiniumcohnii)发酵生产DHA，与传统鱼油来源相比，具有一系列优点，如发酵周期短，培养方式简单，微生物生长快，易于大规模培养；多不饱和脂肪酸含量高，产品质量稳定，氧化稳定性较好，不饱和脂肪酸成分单一，不含EPA或EPA含量低，易于分离纯化；同时克服了传统的从鱼油中获取DHA受原料、气候、产地、生产周期等诸多限制因素的影响。因此微生物发酵生产DHA可替代鱼油来源的DHA，具有广泛的应用前景。
异养微藻隐甲藻因其能在体内大量积累油脂(其中DHA的含量达到40％-50％)而受到研究人员的特别关注。然而有关隐甲藻基因工程相关的研究工作一直处于延至状态，究其原因主要是隐甲藻细胞基因转化体系和突变体构建技术一直没有突破性进展。因此，研究人员很难从基因层面全面了解隐甲藻油脂积累的代谢过程，这也进一步阻碍了人们通过基因工程技术手段修饰隐甲藻底盘细胞进一步提高其在发酵领域的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种隐甲藻突变体的构建方法。
本发明一种高生长速率的隐甲藻突变株的构建方法是通过下列方式完成，其包含如下步骤：
1)隐甲藻光合作用相关基因核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶Rubisco的克隆：
采用隐甲藻的Rubisco序列(EB086308.1)设计上游引物和下游引物，以隐甲藻的cDNA为模板进行PCR，纯化目的片段，连入pTZ57R/T载体(ThermoFisherScientific)并测序；
2)用于同源双交换整合的基因片段的构建：
①隐甲藻Rubisco基因上游片段的扩增：
以隐甲藻基因组为模板，Rubisco基因上游片段的上游引物、下游引物进行PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得隐甲藻Rubisco基因的上游片段；
②隐甲藻Rubisco基因下游片段的扩增：
以隐甲藻基因组为模板，Rubisco基因下游片段的上游引物、下游引物进行PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得隐甲藻Rubisco基因的上游片段；
③潮霉素抗性基因片段的扩增：
以pCAMBIA1301植物表达载体为模板，hpt上下游引物进行PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得潮霉素抗性基因片段；
④用于同源双交换删除Rubisco基因的DNA片段的构建：
以隐甲藻Rubisco基因上游片段、隐甲藻Rubisco基因下游片段、以及含有hpt基因的DNA片段模板，进行融合PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得目的片段。
3)Rubisco基因的的删除和突变株的构建：
①隐甲藻感受态细胞的制备：
取隐甲藻悬浮培养48h的细胞10mL，4℃,3500rpm离心5min，弃上清，加入1mL25mMDTT溶液，30℃水浴15min，离心5min，弃上清，10mL1M山梨糖醇(sorbitol)清洗细胞三次，1mL山梨糖醇重悬细胞备用；
②隐甲藻感受态细胞的转化：
在无菌条件下取200μL隐甲藻感受态细胞置于2mm电极杯中，加入1μL鲑鱼精DNA和2μg目的片段混匀，冰浴5min，电击转化条件为2.0kV，电阻200Ω，电容25μF，电击之后冰浴5min，加入2mL新鲜液体C9N2培养基，25℃，180rpm震荡复苏48h，取50μL细胞悬浮液均匀图涂布在含有40mg/L潮霉素B的固体C9N2培养基平板上，倒置培养2周，将平板上长出的单克隆细胞挑出，重新在潮霉素B的抗性平板上划线，进行转化子的复筛，待长出单克隆细胞，转接液体培养，并进行突变体鉴定；
4)删除突变体的分子生物学鉴定：
分别提取野生型和突变株隐甲藻细胞的基因组，以hpt基因上下游引物进行PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳；
5)删除突变体的生长特性分析：
所得的隐甲藻突变株M1，M6，M7在C27N7.5的液体培养基中培养，摇床设置参数为转速180rpm，温度25℃；
步骤为：接种时取OD490nm为0.8的新鲜细胞5mL加入20mL培养基中，每组做三个平行样，用UV-1750分光光度计测定波长为490nm下的吸光值，每12h测量一次，绘制柱状图；可以观察到在液体培养基C27N7.5中，突变株的生长速率比野生株要快。
步骤2中④所述获得目的片段是指上游片段、潮霉素B抗性片段、下游片段的一个完整融合PCR产物。
步骤2中②所述新鲜液体C9N2培养基是由葡萄糖9g、酵母浸粉2g、海盐25g，加水至1L而成。
步骤2中②所述含有40mg/L潮霉素B的固体C9N2培养基是由葡萄糖9g、酵母浸粉2g、海盐25g、琼脂粉15g，加水至1L而成。
步骤5中所述C27N7.5液体培养基是由葡萄糖27g、酵母浸粉7.5g、海盐25g，加水至1L而成。
所述的菌种为隐甲藻属。
发明人研究发现：在异养条件下发酵隐甲藻产DHA的过程中，细胞中编码光合作用重要酶Rubisco的基因依然得到转录表达。这就意味中细胞在代谢过程中会分散能量和营养去合成这些与生长和油脂积累不相关的蛋白，从而降低了细胞中能量和营养的使用效率，降低了生长速率。Rubisco蛋白是一类丰度很大的蛋白，占据中细胞的很大一部分空间，因此从细胞内空间使用率的角度考虑，异养发酵隐甲藻时，如果Rubisco基因高效表达可能不利于细胞内油脂的积累。
有益效果：利用本发明方法，可以实现对隐甲藻细胞中基因的定点快速敲除，为利用基因工程技术手段修饰隐甲藻发酵底盘细胞提供了技术支持，也为人们研究隐甲藻油脂积累机理提供了可能性。
附图说明
图1隐甲藻ATCC30556Rubisco基因突变体构建示意图。
图2转化株的PCR鉴定图，其中，1、2泳道为野生型；3、4泳道为突变株M1；5、6泳道为突变株M6；7、8为突变株M7。
图3抗潮霉素B的Rubisco基因突变株和野生株在潮霉素B抗性平板上生长状况的对照图。
图4野生型和Rubisco基因突变株的生长速率对比图，其中，培养基为：葡萄糖27g，酵母浸粉7.5g，海盐25g，加水至1L。培养至84小时,野生型和突变体细胞的生长达均达到最大值，其中突变体比野生型平均增长了15％。利用T检验进行显著性分析以证明其可信度，p值<0.05的被认为可信。
具体实施方式
下面的实施例是为了使本领域的技术人员更好地理解本发明但并不用于限制本发明。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：
本发明的技术方案概述如下：
1)隐甲藻光合作用相关基因核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶Rubisco基因的克隆：
根据NCBI数据库报道的有关隐甲藻的Rubisco基因序列(EB086308.1)设计上、下游引物，以隐甲藻的cDNA为模板进行PCR，纯化目的片段，连入pTZ57R/T载体(ThermoFisherScientific)并测序；
2)用于同源双交换整合的基因片段的构建：
①隐甲藻Rubisco基因上游片段的扩增：
以隐甲藻基因组为模板，Rubisco基因上游片段的上、下游引物进行PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得隐甲藻Rubisco基因的上游片段；
②隐甲藻Rubisco基因下游片段的扩增：
以隐甲藻基因组为模板，Rubisco基因下游片段的上、下游引物进行PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得隐甲藻Rubisco基因的上游片段；
③潮霉素抗性基因片段的扩增：
以pCAMBIA1301植物表达载体为模板，hpt基因上下游引物进行PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得潮霉素抗性基因片段；
④用于同源双交换删除Rubisco基因的DNA片段的构建：
以隐甲藻Rubisco基因上游片段、隐甲藻Rubisco基因下游片段、以及含有hpt基因的DNA片段模板，进行融合PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得目的片段(上游片段、潮霉素B抗性片段、下游片段的一个完整融合PCR产物)；
3)Rubisco基因的的删除和突变株的构建：
①隐甲藻感受态细胞的制备：
取隐甲藻悬浮培养48h的细胞10mL，4℃，3500rpm离心5min，弃上清，加入1mL25mMDTT溶液，30℃水浴15min，离心5min，弃上清，10mL1M山梨糖醇(sorbitol)清洗细胞三次，1mL山梨糖醇重悬细胞备用；
②隐甲藻感受态细胞的转化：
在无菌条件下去200μL隐甲藻感受态细胞至于2mm电极杯中，加入1μL鲑鱼精DNA和2μg目的片段混匀，冰浴5min，电击转化条件为2.0kV，电阻200Ω，电容25μF，电击之后冰浴5min，加入2mL新鲜液体C9N2培养基25℃，180rpm震荡复苏48h，取50μL细胞悬浮液均匀图涂布在含有40mg/L潮霉素B的固体C9N2培养基(葡萄糖9g，酵母浸粉2g，海盐25g，琼脂粉15g，加水至1L)平板上，倒置培养2周，将平板上长出的单克隆细胞挑出，重新在潮霉素B的抗性平板上划线，进行转化子的复筛，待长出单克隆细胞，转接液体培养，并进行突变体鉴定；
4)删除突变体的分子生物学鉴定：
分别提取野生型和突变株隐甲藻细胞的基因组，以hpt基因上下游引物进行PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳；
5)删除突变体的生长特性分析：
所得的隐甲藻突变株M1，M6，M7在C27N7.5液体培养基中(葡萄糖27g，酵母浸粉7.5g，海盐25g，加水至1L)培养，摇床设置参数为转速180rpm，温度25℃。
步骤为：接种时取OD490nm为0.8的新鲜细胞5mL加入20mL培养基中，每组做3个平行样，用UV-1750分光光度计测定波长为490nm下的吸光值，每12h测量一次，绘制柱状图。
可以观察到在液体培养基C27N7.5中，突变株的生长速率比野生株要快，这一结果表明Rubisco基因的缺失加快了隐甲藻细胞的生长速率。
实施例1
一种隐甲藻突变体的构建方法，包括下述步骤：
(1)隐甲藻ATCC30556光合作用相关基因Rubisco的克隆：
取隐甲藻ATCC30556cDNA溶液10ng，5×PhusionHFbuffer4μL，10μM的dNTP0.4μL，10μMRubisco基因上游引物1μL、10μMRubisco基因下游引物1μL，Phusion酶0.2μL，无菌水12.4μL，在PCR管中混匀；将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为：98℃30s；98℃10s，55℃30s，72℃30s，共30个循环，4℃5min，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得隐甲藻Rubisco基因片段，连入pTZ57R/T载体(ThermoFisherScientific)并测序；
(2)同源双交换片段的构建：
①Rubisco基因上游片段的扩增：
取隐甲藻ATCC30556基因组溶液10ng，5×PhusionHFbuffer4μL，10μM的dNTP0.4μL，10μMRubisco基因上游片段的上游引物1μL、10μMRubisco基因上游片段的下游引物1μL，Phusion酶0.2μL，无菌水12.4μL，在PCR管中混匀；将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为：98℃30s；98℃10s，55℃30s，72℃30s，共30个循环，4℃5min，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得隐甲藻Rubisco基因的上游片段；
②Rubisco基因下游片段的扩增：
取隐甲藻ATCC30556基因组溶液10ng，5×PhusionHFbuffer4μL，10μM的dNTP0.4μL，10μMRubisco基因下游片段的上游引物1μL、10μMRubisco基因下游片段的下游引物1μL，Phusion酶0.2μL，无菌水12.4μL，在PCR管中混匀；将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为：98℃30s；98℃10s，55℃30s，72℃30s，共30个循环，4℃5min，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得隐甲藻Rubisco基因的下游片段；
③潮霉素抗性基因(hpt)的扩增：
取pCAMBIA1301植物表达载体溶液10ng，5×PhusionHFbuffer4μL，10μM的dNTP0.4μL，10μM上游引物1μL、10μM下游1μL，Phusion酶0.2μL，无菌水12.4μL，在PCR管中混匀；将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为：98℃30s；98℃10s，55℃30s，72℃40s，共30个循环，4℃5min，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得潮霉素抗性基因片段；
④目的片段的扩增：
以上游片段、潮霉素B抗性片段(hpt片段)、下游片段为模板进行融合PCR，步骤为：各取上游片段、下游片段、hpt片段各10ng为模板，5×PhusionHFbuffer4μL，10μM的dNTP0.4μL，Phusion酶0.2μL，无菌水10.4μL，以10μMRubisco基因上游片段的上游引物1μL、10μMRubisco基因下游片段的下游引物1μL，在PCR管中混匀。将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为：98℃30s；98℃10s，60℃60s，72℃30s，共30个循环，4℃5min，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得目的片段(上游片段、潮霉素B抗性片段、下游片段融合PCR产物)；
(3)目的片段的转化：
无菌条件下，接种隐甲藻菌液于液体C9N2培养基中，取隐甲藻悬浮培养48h的细胞10mL，4℃，3500rpm离心5min，弃上清。加入1mL25mMDTT溶液，30℃水浴15min。离心5min，弃上清。10mL1M山梨糖醇(sorbitol)清洗细胞三次，1mL山梨糖醇重悬细胞备用。在无菌条件下去200μL隐甲藻感受态细胞至于2mm电极杯中，加入1μL鲑鱼精DNA和2μg目的片段混匀，冰浴5min。电击转化条件为2.0kV，电阻200Ω，电容25μF，电击之后冰浴5min。加入2mL新鲜C9N2培养基25℃，180rpm震荡复苏48h。取50μL细胞悬浮液骏图涂布在含有40mg/L潮霉素B的C9N2固体平板上，倒置培养2周。将平板上长出的单克隆细胞挑出，重新在潮霉素B的抗性平板上划线，进行转化子的复筛。待长出单克隆细胞，转接液体培养。
(4)突变体的生长鉴定：
所得的隐甲藻突变株M1，M6，M7在C27N7.5的液体培养基中(葡萄糖27g，酵母浸粉7.5g，海盐25g，加水至1L)培养，摇床设置参数为转速180rpm，温度25℃。
步骤为：接种时取OD490nm为0.8的新鲜细胞5mL加入20mL培养基中，每组做3个平行样，用UV-1750分光光度计测定波长为490nm下的吸光值，每12h测量一次，绘制柱状图(图1)。
从图1中可以观察到在液体培养基C27N7.5中，突变株的生长速率比野生株要快，这一结果表明Rubisco基因的缺失加快了隐甲藻细胞的生长速率。
所述液体C9N2培养基：葡萄糖9g，酵母浸粉2g，海盐25g，加水至1L。
所述固体C9N2培养基：葡萄糖9g，酵母浸粉2g，海盐25g，琼脂粉15g加水至1L。
所述C27N7.5液体培养基：葡萄糖27g，酵母浸粉7.5g，海盐25g，加水至1L。
实施例2
本实施例与实施例1基本相同，只是使用的菌株为隐甲藻ATCC30772。
Claims (6)
1.一种高生长速率的隐甲藻突变株的构建方法，其特征是包含如下步骤：
1)隐甲藻光合作用相关基因核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶Rubisco的克隆：
采用隐甲藻的Rubisco序列(EB086308.1)设计上游引物和下游引物，以隐甲藻的cDNA为模板进行PCR，纯化目的片段，连入pTZ57R/T载体(ThermoFisherScientific)并测序；
2)用于同源双交换整合的基因片段的构建：
①隐甲藻Rubisco基因上游片段的扩增：
以隐甲藻基因组为模板，Rubisco基因上游片段的上游引物、下游引物进行PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得隐甲藻Rubisco基因的上游片段；
②隐甲藻Rubisco基因下游片段的扩增：
以隐甲藻基因组为模板，Rubisco基因下游片段的上游引物、下游引物进行PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得隐甲藻Rubisco基因的上游片段；
③潮霉素抗性基因片段的扩增：
以pCAMBIA1301植物表达载体为模板，hpt上下游引物进行PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得潮霉素抗性基因片段；
④用于同源双交换删除Rubisco基因的DNA片段的构建：
以隐甲藻Rubisco基因上游片段、隐甲藻Rubisco基因下游片段、以及含有hpt基因的DNA片段模板，进行融合PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得目的片段。
3)Rubisco基因的的删除和突变株的构建：
①隐甲藻感受态细胞的制备：
取隐甲藻悬浮培养48h的细胞10mL，4℃,3500rpm离心5min，弃上清，加入1mL25mMDTT溶液，30℃水浴15min，离心5min，弃上清，10mL1M山梨糖醇(sorbitol)清洗细胞三次，1mL山梨糖醇重悬细胞备用；
②隐甲藻感受态细胞的转化：
在无菌条件下取200μL隐甲藻感受态细胞置于2mm电极杯中，加入1μL鲑鱼精DNA和2μg目的片段混匀，冰浴5min，电击转化条件为2.0kV，电阻200Ω，电容25μF，电击之后冰浴5min，加入2mL新鲜液体C9N2培养基，25℃，180rpm震荡复苏48h，取50μL细胞悬浮液均匀图涂布在含有40mg/L潮霉素B的固体C9N2培养基平板上，倒置培养2周，将平板上长出的单克隆细胞挑出，重新在潮霉素B的抗性平板上划线，进行转化子的复筛，待长出单克隆细胞，转接液体培养，并进行突变体鉴定；
4)删除突变体的分子生物学鉴定：
分别提取野生型和突变株隐甲藻细胞的基因组，以hpt基因上下游引物进行PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳；
5)删除突变体的生长特性分析：
所得的隐甲藻突变株M1，M6，M7在C27N7.5的液体培养基中培养，摇床设置参数为转速180rpm，温度25℃；
步骤为：接种时取OD490nm为0.8的新鲜细胞5mL加入20mL培养基中，每组做三个平行样，用UV-1750分光光度计测定波长为490nm下的吸光值，每12h测量一次，绘制柱状图；可以观察到在液体培养基C27N7.5中，突变株的生长速率比野生株要快。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤2中④所述获得目的片段是指上游片段、潮霉素B抗性片段、下游片段的一个完整融合PCR产物。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤2中②所述新鲜液体C9N2培养基是由葡萄糖9g、酵母浸粉2g、海盐25g，加水至1L而成。
4.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤2中②所述含有40mg/L潮霉素B的固体C9N2培养基是由葡萄糖9g、酵母浸粉2g、海盐25g、琼脂粉15g，加水至1L而成。
5.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤5中所述C27N7.5液体培养基是由葡萄糖27g、酵母浸粉7.5g、海盐25g，加水至1L而成。
6.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述的菌种为隐甲藻属。
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