CN102191265A - 一种杜氏藻基因敲除载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及杜氏藻(Dunaliella)基因工程，特别是关于杜氏藻番茄红素-β-环化酶(LycB)基因敲除载体及其应用。在lycB基因敲除载体中包含筛选标记基因，并接入了lycB基因的3′端同源重组区和5′同源重组区，该载体应用于培育lycB基因被敲除的杜氏藻。敲除了lycB基因的杜氏藻生物合成β-胡萝卜素的过程被阻止于番茄红素阶段，在胁迫条件下能够累积高含量的番茄红素，累积量可达藻体干重的3％～4％。

Description

一种杜氏藻基因敲除载体及其应用

技术领域

本发明涉及杜氏藻(Dunaliella)基因工程领域，尤其是杜氏藻番茄红素-β-环化酶(Lycopene β-cyclase，LycB)基因敲除载体及其应用。

背景技术

番茄红素(Lycopene)是一种脂溶性天然色素，其分子是由11个共轭双键和2个非共轭双键组成的直链型碳氢化合物，属类胡萝卜素类。主要存在于番茄、西瓜、红色葡萄柚等植物中。近十年来的研究表明，番茄红素极强的抗氧化活性，其清除单线态氧的能力是维生素E的100倍、是β-胡萝卜素的2.2倍，清除羟自由基的效果比β-胡萝卜素强32倍，为目前自然界中被发现的最强抗氧化剂之一。研究发现，番茄红素具有优越的生理功能，它不仅具有抗癌、抑癌的功效，而且对于预防心血管疾病、动脉硬化等各种成人病、增强人体免疫系统以及延缓衰老等也有良好的效果。2009年全世界番茄红素的总用量约2300吨，据有关机构预测，番茄红素的需求量在未来数年仍将以约10％的速度增长。

目前世界上番茄红素的生产方法有天然提取法、化学合成法和发酵法三种。

俄罗斯和美国罗氏药业有化学合成的番茄红素产品，生产成本较低，但其结构为非全反式，生理功能差，而且人们对化学合成品毒副作用有相当的疑虑，因此化学合成番茄红素很少用于药物和食品添加剂。

目前市场上的番茄红素大多是从番茄中提取的天然产物，但由于番茄中番茄红素的含量仅为0.002％左右，提取难度大、成本高、纯度低，而且大量种植番茄用于番茄红素提取需要消耗很多的土地资源。

利用微生物发酵法制备番茄红素的研究方面也有一些报道，美国专利US3097146、US3369974及中国专利200510090996.0提出了利用三孢布拉氏霉菌发酵制备番茄红素的方法，但这些方法均需要添加氨基吡啶等化学药剂干扰霉菌的生物合成路径来实现番茄红素的积累，化学添加剂在产品中的残留对人体的健康会产生不利影响。中国专利200710122895发明了一种利用细菌(龟裂链霉菌)发酵累积番茄红素的方法，但由于受到其合成前体供应量的限制，依照此方法生产番茄红素产率仅在0.4％～0.7％细胞干重范围，仍没有实质性的突破与提高。

通过基因工程和代谢工程的方法来提高番茄中番茄红素的含量方面也有一些有益的尝试。如以色列Lycored Natural Product Industries公司率先选育出番茄红素含量为普通番茄4～5倍的杂交番茄。英国将细菌八氢番茄红素脱氢酶基因crtI导入番茄细胞中，培育出了番茄红素含量为普通番茄3.5倍的转基因番茄新品种。这些研究虽然在一定程度上提高了原料中番茄红素的含量，但总体水平仍很低。

杜氏藻(Dunaliella)，为绿藻门多鞭藻科的一属，是盐生的、无细胞壁的单细胞绿藻，能高效率地生物合成β-胡萝卜素，其中的盐生杜氏藻(Dunaliella salina)细胞中累积β-胡萝卜素最高可达干重的14％，是β-胡萝卜素含量最高的生物体，远远高于其它生物。此外杜氏藻可以在露天开放环境下利用阳光和二氧化碳快速生长，其中盐生杜氏藻的增殖速度达约10g/m²/天，因此杜氏藻是生产天然β-胡萝卜素的很好资源，全球有不少公司利用杜氏藻来生产β-胡萝卜素，用作药物或健康食品的成分。

番茄红素和β-胡萝卜素都是胡萝卜素类物质，它们有相近的化学结构，让杜氏藻像生物合成β-胡萝卜素那样直接合成、累积番茄红素的想法非常有吸引力的，因为迄今为止世界上还没有发现过能够以如此高的效率来合成、累积番茄红素的生物。

发明内容

本发明的目的是构建杜氏藻番茄红素-β-环化酶(Lycopene β-cyclase，LycB)基因敲除载体，并转入杜氏藻细胞，用于培育番茄红素-β-环化酶基因表达被抑制的杜氏藻，该杜氏藻能够累积高含量的番茄红素。

植物生物合成β-胡萝卜素途径的相关研究表明，番茄红素是生物合成β-胡萝卜素的前体，番茄红素在LycB的催化作用下，先将番茄红素分子的两个末端的之一环化成γ-胡萝卜素，然后再将另一端环化形成β-胡萝卜素，LycB是番茄红素转化为β-胡萝卜素的关键酶。图1显示的是植物β-胡萝卜素生物合成路径，如果没有LycB的参与，番茄红素就不能环化，生物合成β-胡萝卜素的过程就会终止于番茄红素合成阶段。

番茄果实中番茄红素的累积研究证实，番茄红素的累积是上游八氢番茄红素合成酶基因(psy基因)和八氢番茄红素脱氢酶基因(pds基因)表达增强及下游lycB基因表达减弱的结果，其调控方式为相关基因的转录调控。

杜氏藻生物合成β-胡萝卜素的过程中，两步环化反应都必需LycB参与才能完成，而LycB是lycB基因表达的产物，因此，通过抑制杜氏藻的lycB基因的表达就可以实现番茄红素在杜氏藻体内不被转化为β-胡萝卜素而大量累积下来。

抑制杜氏藻lycB基因表达的理想途径是将杜氏藻基因组中的lycB基因敲除(knock-out)。本发明将通过构建有效的杜氏藻lycB基因敲除载体，并将载体转入杜氏藻细胞，再经过筛选得到敲除了杜氏藻lycB基因的藻株，该杜氏藻能够累积高含量的番茄红素，使人类可以用一种新的方式大量、方便地获取天然番茄红素。

本发明的具体过程是：

第一步，提取杜氏藻基因组DNA

用十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB法)或其它已知方法。所述的杜氏藻(Dunaliella)是盐生杜氏藻(Dunaliella salina)或巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)或双杜氏藻(Dunaliella biocuiate)等，其中优选累积β-胡萝卜素能力更强的盐生杜氏藻(Dunaliella salina)或巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)，特别是盐生杜氏藻(Dunaliella salina)。

第二步，对杜氏藻lycB全长基因进行测序。

按照基因工程领域常用的测序方法进行，也可以将测序工作委托给专门提供测序服务的生物技术公司。通常利用基因分析仪测序，先设计多对引物进行分段克隆、测序获取分段序列，然后组装获取lycB全长基因。

本发明根据GenBank登录号EU327877序列设计6对引物对盐生杜氏藻Y6株(中盐制盐工程技术研究院)进行分段克隆、测序、组装，获得了Y6的lycB基因序列，见序列表SEQ ID NO：1。详细的技术方案将在实施例1中说明。

第三步，lycB基因敲除载体构建。

在lycB基因敲除载体中包含用于筛选的筛选标记基因，并接入了lycB基因的3′端同源重组区和lycB基因的5′同源重组区。所述的筛选标记基因是氯霉素抗性基因、阿特拉津抗性基因、荧光蛋白基因等，本发明优选氯霉素抗性基因、阿特拉津抗性基因。

本发明能采用的起始质粒有很多选择，包括pCAMBIA1301，这是本专业领域的研究人员所熟知的。

以质粒pCAMBIA1301(GenBank Locus：AF234297)为骨架进行含氯霉素抗性基因的lycB基因敲除载体的构建过程是：

首先将pCAMBIA1301质粒中的潮霉素抗性基因(hpt)用限制性内切酶XhoI酶切，替换为660 bp的氯霉素抗性基因(cat，来自载体pBC SK+)，得到p1301-cat。然后将p1301-cat和pBluescript II KS(+)(GenBank Locus：X52327)用SacII酶切，连接，得载体pBS-1301-cat。再将pBS-1301-cat用XcmI酶切，自连得载体pBS-1301-cat-Xcm。原始载体具有三个NotI酶切位点，但是当去掉XcmI酶切位点之间的片段后，载体只剩一个NotI酶切位点，因此用NotI酶切鉴定。再将载体pBS-1301-cat-Xcm用NcoI/BstEII双酶切，去掉其1.8kb长的β-葡萄糖苷酸酶基因(gus)，连上0.6kb的白喉毒素A链基因(dtA，GenBank Locus：AY611535)，得到载体pBS-1301-cat-Xcm-DTA。最后用SbfI酶切载体pBS-1301-cat-Xcm-DTA，接入lycB基因的3′端同源重组区，NotI酶切载体接入lycB基因的5′同源重组区，得到敲除载体pDs-GKO-cat。

第四步，将lycB基因敲除载体转化进杜氏藻细胞、转化藻的筛选、PCR鉴定。

将lycB基因敲除载体转化进杜氏藻细胞方法可以是电击法、聚乙二醇(PEG)法、基因枪法、玻璃珠搅拌法等，这些方法是基因工程领域所常用的，这些方法在转化效率方面有所不同，优选简便高效电击法。

用电击法将lycB基因敲除载体转化进杜氏藻细胞：在冰浴中以3kV/cm～8kV/cm电击杜氏藻细胞悬浮液。在本发明中电击法可以达到较高的0.05％～0.2％的转化效率。

携带抗性标记的的转化株可以用抗性平板筛选，携带荧光蛋白标记的转化株用流式细胞鉴别分离仪器筛选。附图2是电转化后利用氯霉素抗性筛选的平板。

挑选出来的单藻落经扩大培养后提取DNA，然后PCR检测cat基因、dtA基因和敲除片段。检测结果显示，筛选得到的藻株基因组存在cat基因、dtA基因和敲除片段，证明lycB基因被成功敲除。

将已确认lycB基因被敲除的杜氏藻进行放大养殖，用高压液相色谱(HPLC)检测藻体中番茄红素的含量，结果显示，所得到的杜氏藻能够累积高含量的番茄红素。

本发明的优点在于：

本发明所构建的杜氏lycB基因敲除载体及转化方法，用于培育敲除lycB基因的杜氏藻，该杜氏藻的lycB基因的表达被抑制，该杜氏藻生物合成β-胡萝卜素的过程被阻止于番茄红素阶段，进而在其生物体内能够大量累积番茄红素，该累积过程是藻体自然的生物代谢过程，无需添加任何化学抑制剂。由本发明得到的lycB基因被敲除的杜氏藻，在10％盐浓度下养殖就可以大量累积番茄红素，HPLC检测结果显示，其番茄红素的含量可以达到藻体干重的3％～4％，超过番茄的1000倍，是迄今为止已知的番茄红素含量最高的生物。本发明成果将为人类大量、廉价地获取番茄红素提供全新的解决方案。

本发明获得了盐生杜氏藻Y6的全长lycB基因SEQ ID NO：1，该盐生杜氏藻Y6是商业化生产β-胡萝卜素的最常用的杜氏藻品种，在强光、高盐等胁迫环境下能够累积β-胡萝卜素的量达到生物体干重的10％～14％，因此，该lycB基因序列应用于盐生杜氏藻Y6的基因敲除具有很好的潜在价值。

附图说明

图1是植物β-胡萝卜素生物合成途径。

图2是电转化后利用氯霉素抗性平板筛选转化藻。

图3是杜氏藻Y6和突变株4#40A1的HPLC分析谱图，峰I为β-胡萝卜素，峰II为番茄红素。

具体实施方式

下述实施例中所涉及的方法如无特殊说明均为该技术领域的常规方法，所用的酶制剂如无特别说明均为TaKaRa公司的产品，所涉及的引物的DNA序列在序列表中相应列出。

实施例1、杜氏藻番茄红素-β-环化酶基因敲除载体的构建

步骤1、杜氏藻基因组DNA的提取

5000r/min离心收集DsMG液体培养基(牟春琳，陈喜文，侯召丽.工业生产β-胡萝卜素杜氏藻的分离及种属鉴定.盐业与化工，2009，38(4)：25～29)培养的杜氏藻细胞，按每100mg细胞加750μL制备液(含2.5mL提取液，2.5mL核裂解液，1mL 5％(w/v)N-月桂酰肌氨酸钠，混匀后，称取0.024g亚硫酸氢纳，溶解，混匀。提取液为350mmol/L山梨醇、100mmol/LTris(pH7.5)、5mmol/L EDTA。核裂解液为200mmol/L Tris·HCl(pH7.5)、50mmol/L EDTA、2.0mol/LNaCl、2％CTAB)，55℃孵育2h(每15min颠倒混匀一次)，分装，每个离心管750μL；每管加750μL氯仿/异戊醇(24∶1)，颠倒混匀，室温12000r/min离心5min；取上清，加500μL冷异丙醇，颠倒混匀，直至看到线状DNA出现，室温12000r/min离心5min；用冰冷的75％乙醇洗DNA沉淀两次，空气干燥；加500μL TE溶解DNA，55℃加适量RNase A消化RNA；酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提两次；加1/10体积的3mol/L乙酸钠，2.5倍体积的冷无水乙醇，置-20℃ 1h以上，4℃最大转速离心15min，弃上清；用冰冷的75％乙醇洗DNA沉淀两次，空气干燥，加100μL TE溶解DNA，-70℃保存。

步骤2、杜氏藻lycB基因的克隆

根据GenBank登录号EU327877序列设计六对引物LycB-1-F/R、LycB-2-F/R、LycB-3F/R、LycB-4-F/R、LycB-5-F/R、LycB-6-F/R，对杜氏藻Y6的lycB全长基因进行分段克隆，测序。引物LycB-1-F的序列为CTAGATTGCATACAGAACAG，引物LycB-1-R的序列为GCTGAGCATCTGTGTAAG；引物LycB-2-F的序列为TGACCAAGAGTTCAACCCAG，引物LycB-2-R的序列为CTTTGCACCTTTGTCAATGAG；引物LycB-3-F的序列为GATTGCTGTAAGCCAACCCAC，引物LycB-3-R的序列为ACAAGAAAGCATCCTGAGGACC；引物LycB-4-F的序列为ATCGGTAGCCTGAAACCAC，引物LycB-4-R的序列为ATCAGGCAGTACTCCTCATCC；引物LycB-5-F的序列为AACCCATGTACAAGGTAGACCC，引物LycB-5-R的序列为AATATCACACCTCATGCCAATG；引物LycB-6-F的序列为GGTTATGAACTCACTTACTCCG，引物LycB-6-R的序列为TTGCTTGTAGTACCCAGTCAC。

PCR体系为15μL，含1ng盐生杜氏藻Y6基因组DNA，0.18μL的10μmol/L上游引物，0.18μL的10μmol/L下游引物，0.075μL的5U/μL Ex Taq，1×Ex Taq缓冲液，1.2μL的2.5mol/LdNTPs。PCR反应在TaKaRa PCR Thermal Cycler600上进行。

PCR反应条件为：94℃ 5min；40个三温度循环(94℃ 40s，58℃ 32s，72℃ 110s)，72℃再延伸7min。0.7％琼脂糖凝胶电泳分离回收PCR产物条带，与pMD19-T Simple Vector连接，转化大肠杆菌DH5α-FT，菌落PCR确定的阳性菌进行测序。经过组装，获得9035bp长的Y6的lycB全长基因，其序列见序列表SEQ ID NO：1。

步骤3、杜氏藻lycB基因敲除载体的构建

以pCAMBIA1301为骨架进行敲除载体构建，其步骤如下：

a.首先将pCAMBIA1301质粒中的潮霉素抗性基因(hpt)用限制性内切酶XhoI酶切，替换为660bp的氯霉素抗性基因(cat)，得到p1301-cat。

b.然后将p1301-cat和pBluescript II KS(+)用SacII酶切，连接，得到载体pBS-1301-cat。

c.再将pBS-1301-cat用XcmI酶切，质粒自连接，得到载体pBS-1301-cat-Xcm。原本载体具有三个NotI酶切位点，但是当去掉XcmI酶切位点之间的片段后，载体只剩一个NotI酶切位点，因此用NotI酶切鉴定。

d.再将载体pBS-1301-cat-Xcm用NcoI/BstEII双酶切，去掉1.8kb的gus基因，连入0.6kb的dtA基因，得到载体pBS-1301-cat-Xcm-DTA。

e.最后用SbfI酶切载体pBS-1301-cat-Xcm-DTA，接入lycB基因的3′端同源重组区，NotI酶切载体接入lycB基因的5′同源重组区，得到敲除载体pDs-GKO-cat。对最终构建完成的敲除载体pDs-GKO-cat进行关键部位测序，得到的序列完全正确。3′端同源重组区是利用引物Ds-T-3-F/R扩增基因组所得，5′同源重组区是利用引物Ds-T-5-F/R扩增基因组所得。引物Ds-T-5-F的序列为AAGCGGCCGCCTCAGAAAAAATTGCTAACTCACAAACCATC，引物Ds-T-5-R的序列为AAGCGGCCGCCACCAAGGAAGTCTCTTCCAAGAACAC；引物Ds-T-3-F的序列为AACCTGCAGGTGAACAACCCCTTCTAGCCCAATG，引物Ds-T-3-R序列为AACCTGCAGGTTAGGAATCCATCACAAGCCAATACCC。

实施例2、lycB基因敲除载体pDs-GKO-cat的电转化及转化子的筛选、鉴定

a.培养杜氏藻细胞至对数生长期(1.0×10⁶/mL)，4℃，4000r/min离心5min，收集细胞；

b.冰上操作，电击缓冲液(组成为：0.28mol/L的NaCl，5mmol/L的KCl，25mmol/L的CaCl₂，20mmol/L的Hepes，200mmol/L的甘露醇，200mmol/L的山梨醇，0.05％的Tween-20，0.4mol/L的甘油)悬浮细胞，清洗2次；

c.重悬至细胞密度为1.0×10⁷/mL；取90～100μL重悬藻液，加终浓度为10ng/μL的载体和20ng/μL的鱼精DNA，混匀，冰浴10min；

d.6kV/cm电击，冰浴10min，加入1mL DsMG，暗培养12h；

e.光∶暗＝14∶10培养，最后铺板于含100μg/mL氯霉素的固体平板上培养(说明书附图2)。

f.敲除载体pDs-GKO-cat的5′端同源重组区和3′端同源重组区，分别位于lycB基因的外显子VI上游和内含子VI下游，且中间插入了cat基因，因此敲除突变株的lycB基因将在lycB基因的外显子VI和内含子VI之间产生突变。因此，我们设计CAT-F1/R1、DTA-F2/R2、LycB-F3/R3、DTA-J-F/R、CAT-F/R引物对对藻株进行检测cat基因、dtA基因和敲除片段。方法是：挑取单藻落扩大到1mL培养，然后提取其基因组，用PCR方法分别鉴定。引物CAT-F1的序列为AAAATCACTGGATATACCACCG，引物CAT-R1的序列为TCATTAAGCATTCTGCCGAC；引物DTA-F2的序列为ATGGCAGCTATGGCTGGTCCTGATG，引物DTA-R2的序列为CTAGGATCGCCTGACACGATTTC；引物LycB-F3的序列为GATTGCTGTAAGCCAACCCAC，引物LycB-R3的序列为ACAAGAAAGCATCCTGAGGACC；引物DTA-J-F的序列为GCCATGGCAGCTATGGCTGGTCCTGATG，引物DTA-J-R的序列为CGGTCACCTGTAATCTAGGATCGCCTGACACGATTTC；引物CAT-F的序列为ACCATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACC，引物CAT-R的序列为TTACGCCCCGCCCTGC。

经上述电转化、筛选、PCR鉴定操作步骤后，得到到lycB基因被成功敲除的盐生杜氏藻4#40A1，以10％盐度的下养殖该藻，并以盐生杜氏藻Y6为对照。按以下方式分离藻体、提取番茄红素，利用HPLC定量检测番茄红素的含量，以确认其是否能够累积高含量的番茄红素。

取藻液50mL，4000r/min离心5min，去上清；加3mL丙酮重新悬浮藻泥，抽提，-20℃放置1h；6000r/min离心10min；取上清，0.45μm膜过滤；取15μL进行HPLC分析。HPLC条件：色谱柱为Comatex C18(5μm，Φ4.6×250mm)，流动相A为乙酸乙酯，流动相B为乙腈和水(9∶1，体积比)，梯度：0～16min 0～60％、16～30min 60％、30～35min 60％～100％，进样量为15μL，柱温为35℃，流速为1mL/min，检测波长为502nm。β-胡萝卜素标准品用三氯甲烷溶解，番茄红素标准品用二氯甲烷溶解，然后用HPLC测定β-胡萝卜素的标样，得到标准曲线和线性回归方程。HPLC分析杜氏藻提取样品的β-胡萝卜素和番茄红素的含量，附图3是HPLC分析的图谱。

HPLC分析结果显示4#40A1的番茄红素含量占总类胡萝卜素的56.4±3.5％，远高于Y6的2.9％，是Y6的19.45倍；β-胡萝卜素含量由61.9％降为15.9±2.9％，降至Y6的25.7％。按干重计算，4#40A1的番茄红素含量为3.5±0.6％，超过番茄的1000倍以上。

参考文献

1、中国专利200510090996.00一种利用三孢布拉氏霉菌发酵制备番茄红素的方法；

2、中国专利申请200710122895一种利用细菌发酵生累积高含量番茄红素的方法。

3、牟春琳，陈喜文，侯召丽.工业生产β-胡萝卜素杜氏藻的分离及种属鉴定.盐业与化工，2009，38(4)：25～29

Claims (11)

1.一种杜氏藻(Dunaliella)基因敲除载体，其特征在于接入了杜氏藻的番茄红素-β-环化酶(LycB)基因的3′端同源重组区和lycB基因的5′同源重组区。

2.根据权利要求1所述的杜氏藻是以下杜氏藻的任何一种：盐生杜氏藻(Dunaliella salina)、巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)、双杜氏藻(Dunaliella biocuiate)。

3.根据权利要求1所述的杜氏藻是盐生杜氏藻(Dunaliella salina)或巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)。

4.根据权利要求1所述的杜氏藻是盐生杜氏藻(Dunaliella salina)。

5.根据权利要求1至4任一所述的杜氏藻基因敲除载体，其特征在于含有筛选标记基因。

6.根据权利要求5所述的筛选标记基因是氯霉素抗性基因或阿特拉津抗性基因。

7.根据权利要求1所述杜氏藻基因敲除载体，是用于敲除杜氏藻基因组中的番茄红素-β-环化酶(LycB)基因，获取lycB基因表达被抑制的杜氏藻。

8.根据权利要求7所述的用于基因敲除操作的出发杜氏藻是以下杜氏藻的任何一种：盐生杜氏藻(Dunaliella salina)、巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)、双杜氏藻(Dunaliella biocuiate)。

9.根据权利要求7所述的用于基因敲除操作的出发杜氏藻是盐生杜氏藻(Dunaliellasalina)或巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)。

10.根据权利要求7所述的用于基因敲除操作的出发杜氏藻是(Dunaliella salina)。

11.根据权利要求8、9、10任一项所述的用于基因敲除的盐生杜氏藻，其特征在于其lycB基因的序列为SEQ ID NO：1。

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