CN1670211A - 编码杜氏盐藻番茄红素β环化酶(Lyc－B)的基因 - Google Patents

编码杜氏盐藻番茄红素β环化酶(Lyc－B)的基因 Download PDF

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CN1670211A
CN1670211A CN 200510033235 CN200510033235A CN1670211A CN 1670211 A CN1670211 A CN 1670211A CN 200510033235 CN200510033235 CN 200510033235 CN 200510033235 A CN200510033235 A CN 200510033235A CN 1670211 A CN1670211 A CN 1670211A
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CN
China
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gene
lyc
dunaliella salina
coding
lycopene beta
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CN 200510033235
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Inventor
姜建国
朱跃辉
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South China University of Technology SCUT
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South China University of Technology SCUT
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Abstract

本发明提供从杜氏盐藻(Dunaliella salina)中分离的编码番茄红素β环化酶(Lyc－B)基因cDNA，为利用基因重组技术获得高效产β－胡萝卜素工程菌或是对天然盐藻进行生物改造以提高β－胡萝卜素的产量奠定基础。

Description

编码杜氏盐藻番茄红素β环化酶(Lyc-B)的基因
技术领域
本发明涉及一种新的基因，具体地说涉及从杜氏盐藻(Dunaliellasaline)中分离的编码番茄红素β环化酶(Lyc-B)的新基因cDNA。
背景技术
β-胡萝卜素具有重要的生物学功能，在人体内是维生素A的前体，也是天然抗氧化剂，广泛用于食品、化妆品的添加剂及药品和保健品方面。目前市场上对β-胡萝卜素的需求主要通过三孢布拉霉发酵、从养殖的盐藻中直接提取以及化学合成满足，但仍然是供不应求。杜氏盐藻(Dunaliella salina)简称盐藻，是一种单细胞绿藻，能在适宜的条件下累积大量的β-胡萝卜素，其含量最高可超过干重的10％，是公认的产β-胡萝卜素最好的天然资源。其生物合成途径包括直接前体物质牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)的缩合反应，第一个无色的类胡萝卜素分子八氢番茄红素的脱氢反应以及线性番茄红素分子的末端环化反应三个主要阶段。番茄红素β环化酶(Lyc-B)的功能是催化番茄红素的线性末端生成一个或两个β-(紫罗酮)环得到δ或β-胡萝卜素，这一反应是生成结构复杂多样的类胡萝卜素分子的分水岭。
在绿藻中，目前尚未见Lyc-B基因的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供从盐氏杜氏藻中分离获得的番茄红素β环化酶(Lyc-B)基因的cDNA序列。
本发明通过四种植物(zea mays，Arabidopsis thaliana，Capsicumannuum，Lycopersicon esculentum)番茄红素β环化酶基因，蓝藻Synechococcus sp.PCC7942以及噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)的番茄红素环化酶基因的氨基酸序列进行对比分析，推测可能的保守区，在保守区的对应的核苷酸序列区域设计4条特异引物，利用RT-PCR结合嵌套PCR，降落PCR方法扩增出盐藻Lyc-B cDNA的部分序列。进而通过3’和5’RACE-PCR技术获得包括终止密码子的3’末端和起始密码子的5’末端部分的序列。
附图的简要说明
图1为本发明采用的5’RACE-PCR原理图。
发明的具体实施方式
通过与盐藻亲缘关系较近的四种植物(zea mays，Arabidopsisthaliana，Capsicum annuum，Lycopersicon esculentum)番茄红素β环化酶基因，以及蓝藻Synechococcus sp.PCC7942以及噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)的番茄红素环化酶基因的氨基酸序列进行对比分析，推测可能的保守区，在保守区的位置参照zea mays，Arabidopsisthaliana，Capsicum annuum，Lycopersicon esculentum的核苷酸序列并根据盐藻的β-胡萝卜素合成基因八氢番茄红素合成酶(Psy)基因和八氢番茄红素脱氢酶(Pds)cDNA中密谋子的偏爱性，设计如下4条特异引物(按5’至3’方向，下同)：
上游引物：LYCfp1 TTGTTGGTGGTGGTCCTGCTGG，
          LYCfp2 GTAGACAAAATGGTGTTCATGGATTGG，
下游引物：LYCrp3 AATGGCATAGCGTACAAGAACGTTGG，
          LYCrp4 CCATGTAACCAGTTGAAGGATGAACCAT。
从对数后期的盐藻中提取总RNA，用BD Clontech powerscript反转录酶合成单链cDNA作为PCR模板扩增出盐藻Lyc-B cDNA的部分序列。反应程序为：94℃预变性5min进入循环过程；94℃变性30sec，70℃退火30sec，72℃延伸1min，5个循环；94℃变性30sec，68℃退火30sec，72℃延伸1min，5个循环；94℃变性30sec，66℃退火30sec，72℃延伸1min，20个循环。最后以72℃延伸10min。经1％琼脂糖凝胶进行电泳分析。
取不同时间段培养的盐藻RNA进行如上反应。以引物组合LYCfp1/rp4的50倍稀释的扩增产物作为模板，再用内部引物LYCfp2/rp3进行嵌套PCR扩增，得到特异性较强的一100bp左右的条带，凝胶回收后连接到pGEM-Teasy(Promega)载体上，将重组质粒电转化到E.coli DH5α感受态细胞。对阳性克隆进行测序，并用BLAST程序对序列进行同源性分析。该片段与Arabidopsis thaliana的Lyc-BcDNA的核苷酸序列在多个区域有完全的一致性，因此初步判断它是的盐藻八氢番茄红素脱氢酶cDNA片段。
根据已知的该段序列设计了一条基因特异性上游引物(LycB-3upl AGCGTACAAGAACGTTGGCCATG)进行3’-RACE。反转录用修饰的锁定引物CGCGTCGACGAGCCAGAGCTCTGGGAAOligo(dT)18VN来引导合成第一链cDNA，用另外引入的PCR引物序列CGCGTCGACGAGCCAGAGCTCTGGGAA与基因特异性上游引物配对进行3’-RACE PCR扩增盐藻Lyc-B cDNA的3’末端。
根据已知的该段序列设计了一条基因特异性下游引物(LycB-5dpl GGATTGGACAAAATGGTGTTCATGG)进行5’-RACE。其原理是先是利用真核生物mRNA的3’末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo(dT)18VN作为锁定引物在反转录酶PowerscriptMMLV反转录酶作用下，反转录合成标准第一链cDNA。利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5’末端时自动加上3-5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有寡核苷酸序列Oliogo(dG)的通用接头引物(5’-GGGTCTAGAGAATTCGGATCCAGGGGG-3’)配对后，转换为以该引物序列为模板继续延伸。用该引物序列作为上游引物，用上述的基因特异引物作为下游引物，以第一链cDNA为模板，进行降落PCR循环，把目的基因cDNA5’末端扩增出来。
盐藻Lyc-B cDNA的初始扩增的部分序列如SEQ ID.1所示。
                                         04序列~1
                      SEQUENCE LISTING
<110>华南理工大学
<120>编码杜氏盐藻番茄红素β环化酶的基因
<130>200502
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1037
<212>cDNA
<213>杜氏盐藻(Dunaliella salina)
<400>1
atggaatggc tggacttgcg gtcgcccttc ctcccagcag ctggaccggt cctgcccttg  60
tgaatgattt tgcgtggctg cctgctcctt gcactcacag ccagctgaca cctgcccttg  120
gtcaacgtcg ggcctggcct gcaggcttgt agcactctga gcgggcaggc gaagttccag  180
cttggacgtg tttgttccct gtttcgaact atgtcgtgaa gaaaaagtgt agacagtcgc  240
ggctcgctgc agcaagcgct ctgtcgcagg ctacgacaac cctggccttg gagcccacag  300
atagcgtaca gaacgttggc catgtaacca gttgaaggat gaaccatgaa caccattttg  360
tccaatccat gaacaccatt ttgtctacac tggcgctg cttatgtgtc agcactgcaatc  420
gaaggtacac ccgcatgctg cgttgcaacc ggccccttgg aacattctga gatgagctac  480
tttctcatct tgagagcctg gagagtgttt gcctgaccta atccacaagc atacagcggg  540
aaggcgcggt tgaagggctt tccctctcct ccagacagct tctagccaaa tcctcctgaa  600
ccttcttggt ctgtaagcaa tctgcgctca accacaggtg ttctccatgc ctgcgtgcca  660
tcatcaaaag aagcactgca acactgcaca acaaggtgta gagacgtagg ggggagtttg  720
catttcctcc catttcatgc cttatggtca aactctttgt cctcacaagg cgcgggagta  780
ggcctgtgtg ctctttggac gtgacttaca gagggcctgc agatgatcca tccttcttat  840
ggaatcacaa tattaaacgg tcttgtaccg gtgcgtatgt tgatgcccaa cacacacaca  900
gagggttgga accacgtgca cacttgctca ccgggctgcg agaggacatt gcatctcgga  960
gcaaaactgc agaggaggtc tcacagcggc tcccaccact caaggtcgac cttccaggag  1020
gtgagtggca tgccggtgca ggaggtatct ctgcagaaat tgctaggttc ctcagcagct  1080
aagcaagcgg actgtcgagt ccagatcctt gtccaagtca gagcccacag gcatcctcct  1140
aagaagctgg tag                                                     1153

Claims (5)

1、一种分离的核苷酸，编码番茄红素β环化酶，其具有SEQ IDNO.1所示序列。
2、权利要求1所述的核苷酸，其特征在于其从杜氏盐藻中分离。
3、由权利要求1的核苷酸编码的氨基酸序列。
4、含有权利要求1所述核苷酸的表达载体。
5、含有权利要求1所述核苷酸的宿主细胞。
CN 200510033235 2005-02-22 2005-02-22 编码杜氏盐藻番茄红素β环化酶(Lyc－B)的基因 Pending CN1670211A (zh)

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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102191266A (zh) * 2011-04-06 2011-09-21 南开大学 一种使杜氏藻累积高含量番茄红素的方法
CN102191265A (zh) * 2011-04-06 2011-09-21 南开大学 一种杜氏藻基因敲除载体及其应用
CN102251007A (zh) * 2011-05-31 2011-11-23 南开大学 利用rna干扰技术使杜氏藻累积高含量番茄红素的方法
CN108004258A (zh) * 2017-11-01 2018-05-08 江西中医药大学 栀子番茄红素β-环化酶b2基因及其编码的蛋白质、优化的基因及它们的应用
CN110423765A (zh) * 2019-08-29 2019-11-08 南京大学 一种番茄红素ε-环化酶基因及其编码蛋白和应用

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C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication