CN102517310B - 枸杞异戊二烯焦磷酸异构酶基因及包括该基因的重组载体和宿主细胞及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种枸杞异戊二烯焦磷酸异构酶基因及包括该基因的重组载体和宿主细胞及应用。选自以下核苷酸序列之一：1)具有SEQ ID No.1序列所示的核苷酸序列；2)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的70％的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。通过提取新鲜枸杞叶片总RNA，用3′RACE技术克隆了枸杞异戊二烯焦磷酸异构酶基因LmIpi，得到完整的基因序列为882bp。构建了大肠杆菌表达载体pET28a-LmIpi，应用大肠杆菌异源表达系统，对克隆的枸杞异戊二烯焦磷酸异构酶基因LmIpi编码的酶活性进行了鉴定，枸杞异戊二烯焦磷酸异构酶LmIPI能够催化异戊二烯焦磷酸转变成二甲基丙烯焦磷酸，使代谢向下游流动，提高β-类胡萝卜素含量。
Description
技术领域
本发明涉及一种枸杞(Lycium chinense Miller)中异戊二烯焦磷酸异构酶基因LmIpi的克隆和重组及应用，属于分子生物学和生物技术领域。
背景技术
枸杞中含有丰富的类胡萝卜素，据报道，宁夏枸杞鲜果的β-胡萝卜素含量为19.65mg/100g，总类胡萝卜素含量为295.27mg/100g，是胡萝卜的3～4倍。类胡萝卜素是由类异戊二烯聚合而成的菇类化合物，生物合成的前体是含5个碳的异戊二烯焦磷酸(IPP)。绝大多数类胡萝卜素是由8个IPP单位聚合而成的含有个40碳的碳氢四萜类(胡萝卜素)及其含氧的衍生物。在类胡萝卜素生物合成途径中，异戊二烯焦磷酸异构酶(Isopentenyl pyrophosphate isomerase，IPI)催化异戊二烯焦磷酸转变成二甲基丙烯焦磷酸，该基因广泛存在于生物体中，在这些物种萜类合成中行使调节萜类5-碳前体分子库容的重要功能。目前为止，已经从水稻、玉米、番茄、甘薯、烟草等植物克隆到该基因。
类胡萝卜素是C40的碳氢化合物，广泛存在于植物、一些光合细菌以及藻类中的脂溶性色素，主要包括胡萝卜素(carotenes)和它们的氧化衍生物叶黄素(xanthophylls)两大类。类胡萝卜素在植物光合作用中起着至关重要的作用，它们是光合天线和光反应中心复合体不可缺少的结构成分，还可以保护叶绿素免受强光导致的光氧化破坏。类胡萝卜素是维生素A的前体，具有增强免疫、抗氧化、增进细胞缝间联接交流、预防、延缓及治疗癌症的功能。Aluru等将细菌crtB(pds)和crtI基因串联在一起，在玉米胚乳中特异性表达，胚乳中类胡萝卜素含量提高34倍，并积累了大量的维生素A的前体：β-胡萝卜素。
生物系统中一旦形成高度活泼的具有损伤能力的自由基后，就会对细胞遗传物质和细胞膜进行强烈的破坏，导致细胞功能下降，机体衰老以及疾病的发生。类胡萝卜素，尤其是β-胡萝卜素能抑制、清除体内自由基，可以延缓衰老和预防肿瘤、血栓、动脉粥样硬化等疾病。类胡萝卜素能增加免疫系统中B细胞的活力、消灭外源入侵的病原菌，能提高淋巴辅助T细胞的活力，协助B细胞产生抗体，并提高其他免疫组分的活性；还能增加自然杀伤细胞的数目，以消除机体内被感染的细胞或癌细胞。据报道，除β-胡萝卜素外，番茄红素等也有增加免疫力的功能。
随着人类对类胡萝卜素药用价值及医疗保健作用的不断发现，对类胡萝卜素的种类和产量的需求也将越来越大，然而，类胡萝卜素很难用化学方法合成。现代分子生物学研究手段的发展，使得类胡萝卜素生物合成途径中的一系列关键酶的基因被陆续分离鉴定，为通过DNA重组技术和遗传工程调控生产类胡萝卜素开辟了道路，特别是通过类胡萝卜素基因工程获得“金色水稻”和“金油菜”，极大地增强了人们开展植物类胡萝卜素基因工程的信心。
发明内容
本发明的目的在于提供一种枸杞异戊二烯焦磷酸异构酶基因。
本发明的第二个目的是提供该基因编码的蛋白质。
本发明的目的还在于提供含有该基因的重组载体和宿主细胞。
本发明的另一个目的在于提供该基因的用途。
本发明提供了一种枸杞异戊二烯焦磷酸异构酶基因LmIpi，如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列构成。
本发明提供了一种上述枸杞异戊二烯焦磷酸异构酶基因LmIpi编码的蛋白质，如序列表中所示的氨基酸序列的蛋白质。
本发明提供了一种上述枸杞异戊二烯焦磷酸异构酶基因LmIpi重组克隆载体pMD18-T-LmIpi。
含有上述的枸杞异戊二烯焦磷酸异构酶基因LmIpi的重组载体，这些重组载体包括质粒。
所述的质粒表达载体大肠杆菌表达载体pET28a-LmIpi。
含有上述枸杞异戊二烯焦磷酸异构酶基因LmIpi完整编码阅读框序列的宿主细胞，如含有上述重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围。
所述的宿主细胞选自大肠杆菌细胞。
本发明提供了一种含有LmIpi基因工程菌。
上述枸杞异戊二烯焦磷酸异构酶基因LmIpi的应用包括该LmIpi基因编码的蛋白在大肠杆菌中的应用。
本发明的技术方案具体描述如下：
本发明提供的一种枸杞异戊二烯焦磷酸异构酶基因LmIpi，如序列表SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列，还包括所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的70％以上同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。
本发明提供的一种含有异戊二烯焦磷酸异构酶基因LmIpi的重组载体pET28a-LmIpi的大肠杆菌Top10。
本发明提供的一种异戊二烯焦磷酸异构酶基因LmIpi编码的蛋白，如序列表SEQ IDNO.2所示氨基酸序列。
本发明提供的一种异戊二烯焦磷酸异构酶基因LmIpi编码的蛋白在大肠杆菌中的表达应用。
本发明的克隆方法由下述步骤组成：
从枸杞叶片中提取总RNA，根据转录组Unigene序列中枸杞异戊二烯焦磷酸异构酶基因的核苷酸序列设计上游引物LmIpiF：5’-ATGTCGCTGACTACTGCACCTT C-3’，然后利用3′RACE方法扩增得到完整的基因序列为882bp。
本发明构建含异戊二烯焦磷酸异构酶基因LmIpi的大肠杆菌表达载体pET28a-LmIpi，由下述步骤组成：
1)构建含有枸杞异戊二烯焦磷酸异构酶基因LmIpi的中间载体pMD18-T-LmIpi：
设计由SEQ ID NO.3所示的上游引物P1，和由SEQ ID NO.4所示的下游引物P2，以枸杞异戊二烯焦磷酸异构酶基因的cDNA为模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物连接于pMD18-T载体，获得含有序列表中SEQ ID NO.1所示的枸杞异戊二烯焦磷酸异构酶基因LmIpi的中间载体pMD18-T-LmIpi。
2)构建大肠杆菌表达载体pET28a-LmIpi：
设计由SEQ ID NO.5所示的上游引物P3，和由SEQ ID NO.6所示的下游引物P4，以质粒pMD18-T-LmIpi为模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物经BamHI和XhoI酶切后，将大肠杆菌表达载体pET28a经BamHI和XhoI酶切，二者进行连接反应，得到大肠杆菌表达载体pET28a-LmIpi。
本发明提供了一种枸杞异戊二烯焦磷酸异构酶基因及包括该基因的重组载体和宿主细胞及应用，首次从枸杞中分离出编码异戊二烯焦磷酸异构酶的完整cDNA，连接到大肠杆菌表达载体上，利用外源表达系统验证枸杞LmIpi基因在蛋白水平表达的产物具有酶的活性。
本发明所述的枸杞异戊二烯焦磷酸异构酶基因可望用于制备转基因玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、马铃薯、棉花、谷子、大麦以及花卉和蔬菜植株。
本发明通过提取新鲜枸杞叶片总RNA，用3′RACE技术克隆了枸杞异戊二烯焦磷酸异构酶基因LmIpi，得到完整的基因序列为882bp。构建了大肠杆菌表达载体pET28a-LmIpi，应用大肠杆菌异源表达系统，对克隆的枸杞异戊二烯焦磷酸异构酶基因LmIpi编码的酶活性进行了鉴定，枸杞异戊二烯焦磷酸异构酶LmIPI能够催化异戊二烯焦磷酸转变成二甲基丙烯焦磷酸，使代谢向下游流动，提高β-类胡萝卜素含量。
附图说明
图1pMD18-T-LmIpi载体示意图。
图2pET28a-LmIpi酶切验证结果。
图3LmIpi在大肠杆菌中的表达。
图4表达LmIPI的大肠杆菌HPLC检测结果。
具体实施方式
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
枸杞异戊二烯焦磷酸异构酶基因LmIpi的克隆：
以RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN，German)试剂盒，从100mg新鲜枸杞叶片中提取Total RNA，根据转录组的Unigene序列设计上游引物，LmIpi基因上游引物为：LmIpiF：5’-ATGTCGCTGACTACTGCACCTTC-3’。利用3′-FULL RACE Core Set Ver.2.0(TaKaRa，Japan)试剂盒扩增得到完整的基因序列。具体步骤：①以Total RNA为模板，使用3′RACEAdaptor引物进行反转录反应，合成1st Strand cDNA，反应体系如下：
RNA： 2μl
3′RACE Adaptor： 1μl
5×M-MLV Buffer： 2μl
dNTP Mixture： 1μl
RNase Inhibitor： 0.25μl
Reverse Transcriptase M-MLV：0.25μl
RNase Free dH2O： 3.5μl
反应条件：42℃，60min；70℃，15min。
②根据基因的上游引物与试剂盒提供的下游引物3′RACE out primer：5’-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3’，以1st Strand cDNA为模板，进行PCR反应，反应体系如下：
1st PCR产物： 2μl
dNTP Mixture： 8μl
LmIpiF： 2μl
3′RACE out primer： 2μl
10×LA PCR Buffer II： 4μl
MgCl2： 3μl
TaKaRa LA Taq： 0.25μl
dH2O： 28.75μl
反应条件：94℃，3min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，50sec；72℃，10min，30个循环。
实施例2
克隆载体pMD18-T-LmIpi的构建过程
将序列表所示的LmIpi基因与pMD18-T载体连接，反应体系如下：
目的PCR片段：4μl
pMD18-T载体：1μl
SolutionI： 5μl
反应条件：16℃，30min。连接产物转化E-Coli.TOP10，涂布于含氨苄的LB平板。以目的基因为引物进行PCR(反应条件：94℃，3min；94℃，30sec；54℃，30sec；72℃，50sec；72℃，10min，30个循环。)得到PCR产物，电泳条带正确，然后送华大基因公司测序，测序结果在NCBI中进行Blast，表明为该基因。载体示意图如图1。
实施例3
大肠杆菌表达载体pET28a-LmIpi的构建过程
首先，以pMD18-T-LmIpi为模版，P3和P4分别为上下游引物扩增LmIpi片段，其反应条件为94℃，3min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，1min50sec；72℃，10min，30个循环。在P3中引入BamHI酶切位点(GGATCC)，在P4中引入XhoI酶切位点(CTCGAG)。然后，PCR产物与pET28a质粒分别经BamHI和XhoI双酶切，将二者酶切产物连接：16℃，16hrs，连接(2μl 10×T4buffer，0.5μl T4DNA连接酶，5μl载体DNA，7.5μl外源DNA，5μl ddH2O)。连接产物转化E coli.Top10，涂布于含Amp的LB平板。以目的基因为引物进行PCR得到882bp产物，酶切鉴定得到目的条带，如果2为酶切电泳图。最后送华大基因测序公司测序，结果表明载体pET28a-LmIpi构建正确。
将构建好的植物表达载体pET28a-LmIpi转化大肠杆菌BL21。
实施例4
LmIpi基因在大肠杆菌中的功能验证
在大肠杆菌中共转化质粒pACCAR16ΔcrtX(氯霉素抗性)和表达载体pET28a-LmIpi(卡那霉素抗性)，具体步骤为：①向E.coli(BL21)感受态细胞中加入两种质粒DNA各1μL，混匀，冰上放置30min；②42℃热激90s，然后冰上放置2-3min；③加800μL，37℃预热的LB液体培养基(不含抗生素)，37℃，150r/min振荡培养45min；④吸取50μL上述培养液于含相应抗生素的LB固体培养基上，涂板；⑤倒置平板，37℃，培养12hrs。枸杞异戊二烯焦磷酸异构酶基因LmIpi编码的酶可使β-胡萝卜素含量增加，表现为大肠杆菌菌落颜色加深。如图3所示：A为转化质粒pACCAR16ΔcrtX；B为共转化质粒pACCAR16ΔcrtX和表达载体pET28a-LmIpi，可见橘红色β-胡萝卜素颜色明显加深。LB液体培养基组成为：10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，5g/L酵母提取物。
大肠杆菌类胡萝卜素的提取：①离心收集菌体，菌体质量不超过0.8g；②加20ml甲醇到菌体中，重悬；③加2ml，60％KOH，重悬；④60℃温浴20min，再将样品冷却至室温；⑤将样品与20ml含有10％乙醚的石油醚(bp.40-60℃)转移到分液漏斗中，充分混合，萃取；⑥若样品与乙醚/石油醚分层效果不好，可以加入适量的饱和NaCl溶液和少量乙醇；⑦收集上层有机相；⑧通氮气，吹干样品。
大肠杆菌类胡萝卜素的HPLC检测：将样品溶于40μL丙酮，使用nucleosil 100-3c250×4.6mm(MN，Germany)色谱柱，兰博(进口SSI)四元梯度泵。按照Sander(LaneC.Sander，Katherine Epler Sharpless，et al，Development of Engineered Stationary Phases forthe Seperation of Carotenoid Isomers，Anal.Chem，1994，66：1667-1674)等(1994)的方法进行高效液相色谱分析。流动相为乙腈∶甲醇∶异丙醇＝85∶10∶5，流速为1.0mL/min，同时用Thermo二极管阵列(diode-array detector，DAD)检测器，全波长扫描类胡萝卜素谱图。如图4所示，A和B分别为转化质粒pACCAR16ΔcrtX和共转化质粒pACCAR16ΔcrtX和表达载体pET28a-LmIpi的提取物谱图。
Claims (3)
1.一个枸杞异戊二烯焦磷酸异构酶基因，其特征在于该基因为SEQ ID No.1序列所示的核苷酸序列。
2.一种权利要求1所述的枸杞异戊二烯焦磷酸异构酶基因编码的蛋白质，其特征在于所述的蛋白质为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
3.一种重组载体，其特征在于含有权利要求1所述的枸杞异戊烯焦磷酸异构酶基因全序列。
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