CN104087617B - 一种利用阻断巴氏盐藻代谢通路生产番茄红素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用阻断巴氏盐藻代谢通路生产番茄红素的方法，包括如下步骤：(1)配制杜氏藻基本培养液，向培养液中加入A5微量元素溶液，调节pH，灭菌、冷却至室温；(2)将杜氏藻细胞加入培养液中，置于光照培养箱中培养，待OD600达到0.7的时候加入阻断剂三乙胺200‑800ppm，继续培养24～72小时，然后提取色素，得到番茄红素。本发明相对传统从番茄表皮提取番茄红素的方法，提取方法更加简单、方便快捷，提取周期短。相对于利用三孢布拉氏霉等自养微生物，更利于大规模养殖，养殖所需环境要求简单，符合工业化大规模生产的标准。
Description
技术领域
本发明属于食品科学技术领域。具体涉及利用一种阻断剂阻断杜氏盐藻的代谢通路来生产番茄红素的方法。
背景技术
杜氏盐藻(Dunaliella salina)是一种嗜盐的绿色微藻，是一种嗜盐的单细胞真核藻类，是迄今为止发现的最耐盐的真核生物之一。它属于高盐逆境生物，适应性很强，繁殖快，其自然生活环境多为盐池、盐湖等地方，特殊的环境造就了独特的生长机制。杜氏盐藻属于光合自养生物，含有丰富的油脂、胡萝卜素。蛋白质、多糖等，同时含有较高的Ca、P、Zn等矿物质，还含有包括人类必须氨基酸在内的18中氨基酸，累积的甘油为干重的40％～50％。在适当条件下，体内合成的β‐胡萝卜素可达细胞干重的14％以上，远远高于其他动物和植物体内的含量，是β‐胡萝卜素极好的天然产源，具有很大的开发应用价值。β‐胡萝卜素可以作为维生素A的前提，能使皮肤和黏膜细胞正常化并可以维持视网膜正常的功能。
番茄红素是一种类胡萝卜素，作为植物所含的一种天然色素，主要存在于茄科植物西红柿的成熟果实中。研究证明番茄红素具有提高人体免疫力、抗癌、抗氧化、降血脂、保护皮肤等功效。随着人们越来注重绿色、健康，番茄红素不断受到人们的广泛关注。但是作为功能性天然色素的番茄红素，人类自身不能合成，需要通过膳食等方式补充。据美国CPM(客户管理关系)国际公司预测，番茄红素产品销售将年增35％，预计两三年内到达200亿美元的销售量，世界跨国医药巨头和国内的医药巨头们纷纷进军番茄红素产业。
当前番茄红素的生产方法主要有天然提取、化学合成、微生物发酵等。目前，已证实天然番茄红素比化学合成的番茄红素更易吸收。而且，化学合成化学物残留的存在，因此，近年来已转向天然产品的开发。目前两种主流生产番茄红素的方法，一是番茄表皮中提取，二是利用三孢布拉氏霉生产。然而从番茄表皮中提取，提取效率低，提取工艺繁琐，需要耗费大量的番茄，非常浪费；三孢布拉氏霉属于异养霉菌类微生物，养殖所需碳源、氮源以及生长环境要求高，难以工业化大规模生产，且生产成本较高。
发明内容
本发明的目的利用一种阻断剂，阻断杜氏盐藻的代谢通路中由番茄红素向β‐胡萝卜素的环化反应，实现了利用杜氏盐藻生产番茄红素的突破。
本发明的技术方案概述如下：
一种利用阻断巴氏盐藻代谢通路生产番茄红素的方法，包括如下步骤：
(1)配制杜氏藻基本培养液，向培养液中加入A5微量元素溶液，调节pH，灭菌、冷却至室温；
(2)将杜氏藻细胞加入培养液中，置于光照培养箱中培养，培养过程中用分光光度计测定藻液的光密度(OD值)，待OD600达到0.7的时候加入阻断剂三乙胺200-800ppm，继续培养24～96小时，然后提取色素，得到番茄红素。
所述杜氏藻基本培养液，其成分为：NaNO30.420g/L，NaCl87.69g/L，NaH2PO4·2H2O0.156g/L，NaHCO30.840g/L，KCl0.074g/L，MgSO4·7H2O1.230g/L，CaCl2·2H2O0.044g/L，0.1％EDTA铁0.5ml/L，调pH至7.5。
所述的A5微量元素溶液，其成分如下：H3BO3286，MnCl2·4H2O181，ZnSO4·7H2O22，CuSO4·5H2O7.9，(NH4)6Mo7O24·4H2O3.9，单位均为mg/100ml，加入的量为1ml/L。
所述的灭菌条件：压力102.9kPa，温度121℃，时间20min。
所述的培养箱的培养条件为：在光照度为6000Lx，光暗周期为14h:10h，温度为26℃，以转速50r/min的转速震荡培养。
所述的阻断剂三乙胺的加入量为500ppm。
所述的提取色素的方法为：取10ml藻液在10000rpm转速下离心1min，弃上清液，向藻泥中加入2ml丙酮，涡旋分散，8000rpm转速下离心1min，取上清转移到新的离心管中，加入0.2ml60％KOH，去除叶绿素，过0.45um的滤膜。
加入阻断剂后继续培养48～72小时。
本发明的藻种来源：
所涉及的巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil FACHB-847)购于中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库(湖北武汉)，并采用液体培养基弱光保存。
HPLC测定本发明中藻液番茄红素的含量，表明加入阻断剂前后番茄红素是一个从无到有的变化，另外在阻断剂加入后的一段时间内，番茄红素的含量不断积累并在48h～72h时达到最大值，其中加入三乙胺的量在500ppm时，番茄红素产量最高。
本专利的发明效果在于：加入三乙胺后能够有效抑制环化酶的活性，阻断巴氏杜氏藻代谢通路中番茄红素向β‐胡萝卜素的进一步转化，将仅仅作为巴氏杜氏藻代谢通路中的中间产物的番茄红素作为终产物出现在培养基中，是一种新的生产番茄红素的方法。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明相对传统从番茄表皮提取番茄红素的方法，提取方法更加简单、方便快捷，提取周期短，产量也相对较高。
(2)巴氏杜氏藻属于真核自养微生物，在养殖过程中，无需碳源、氮源等有机物，相对于目前两种主流生产番茄红素的方法成本更低。
(3)本发明中利用的巴氏杜氏藻相比于三孢布拉氏霉，更利于大规模养殖，养殖所需环境要求简单，符合工业化大规模生产的标准。
(4)本发明在高盐、强光、缺氮等极端环境的胁迫下，番茄红素会有更高的产率，获得更高的收益。
附图说明
图1为杜氏盐藻中番茄红素的代谢途径，抑制代谢路径中的番茄红素环化酶，将终产物停留在番茄红素；图中的英文缩写示意：MEP:2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸；PDS:八氢番茄红素脱氢酶；ZISO:ζ-胡萝卜素异构酶；ZDS:ζ-胡萝卜素脱氢酶；CRTISO:类胡萝卜素异构酶。
图2为加入500ppm三乙胺阻断12小时后的液相图谱，没有番茄红素峰。
图3为加入500ppm三乙胺阻断24小时后的液相图谱，峰8为番茄红素峰。图2和图3的比对说明，确实是三乙胺起到的阻断效果，产生的番茄红素。
图4为加入500ppm三乙胺阻断48小时后的液相图谱，峰9为番茄红素峰。
图5为加入500ppm三乙胺阻断72小时后的液相图谱，峰15为番茄红素峰。
图6为图4中峰9的波段扫描图。
图7为番茄红素标准品全波段扫描图。
具体实施方式
实施例1
(1)杜氏藻培养液配制
配制盐藻培养液：NaNO30.420g/L，NaCl87.69g/L，NaH2PO4·2H2O0.156g/L，NaHCO30.840g/L，KCl0.074g/L，MgSO4·7H2O1.230g/L，CaCl2·2H2O0.044g/L，0.1％EDTA铁0.5ml/L。向培养液中加入A5微量元素溶液1ml/L，调pH至7.5。A5微量元素溶液，其成分如下：H3BO3286，MnCl2·4H2O181，ZnSO4·7H2O22，CuSO4·5H2O7.9，(NH4)6Mo7O24·4H2O3.9，单位均为mg/100ml。盐藻培养液按100ml每瓶分装至500ml的三角瓶中，四层纱布封口，在100kPa大气压下高温灭菌20min。室温冷却后使用。
(2)接种培养
将处于代数生长期的藻液于5000r/min下离心10min，弃除培养液，按1％的接种量将藻细胞加入装有新鲜培养液的三角瓶中，用四层纱布包裹瓶口。将三角瓶置于光照培养箱中，在光照度为6000Lx(光暗周期为14h:10h)，温度为26℃，以转速50r/min的转速震荡培养。培养过程中用分光光度计测定藻液的光密度(OD值)，当其OD600达到0.7时加入三乙胺500ppm，继续培养4天。
(3)色素的提取
加入阻断剂后每个12小时，取10ml藻液在10000rpm转速下离心1min，弃上清液，向藻泥中加入2ml丙酮，涡旋分散，8000rpm转速下离心1min，取上清转移到新的离心管中，加入0.2ml60％KOH，去除叶绿素的影响。过0.45um的滤膜待测液相。
(4)含量测定
利用高效液相(HPLC)来测定番茄红素的含量
液相条件：流动相：45％乙腈45％异丙醇10％甲醇，流速1.2ml/min，柱温25℃，色谱柱Welch Ultimate XB-C18。
加入三乙胺12小时，没有番茄红素的峰。(见图2)
加入三乙胺24小时，番茄红素的峰高0.974mAU。(见图3)
加入三乙胺48小时，番茄红素的峰高11.020mAU。(见图4)
其中在加入阻断剂72小时番茄红素的峰高度达到最大值为16.203mAU(见图5)。
实施例2
(1)杜氏藻培养液配制(同实施例1)
(2)接种培养
同实施例1，不同之处在于加入阻断剂的量不同，本实施例加入三乙胺的量为200ppm。
(3)含量测定(同实施例1)
加入三乙胺12小时，没有番茄红素的峰。
加入三乙胺24小时，番茄红素的峰高1.938mAU。
加入三乙胺48小时，番茄红素的峰高7.224mAU。
加入三乙胺72小时，番茄红素的峰高6.310mAU。
其中在加入阻断剂48小时番茄红素的峰高度达到最大值为7.224mAU。
实施例3
(1)杜氏藻培养液配制(同实施例1)
(2)接种培养
同实施例1，不同之处在于加入阻断剂的量不同，本实施例加入三乙胺的量为800ppm。
(3)含量测定(同实施例1)
加入三乙胺12小时，没有番茄红素的峰。
加入三乙胺24小时，番茄红素的峰高1.598mAU。
加入三乙胺48小时，番茄红素的峰高4.357mAU。
其中在加入阻断剂72小时番茄红素的峰高度达到最大值为7.570mAU。
Claims (8)
1.一种利用阻断巴氏盐藻代谢通路生产番茄红素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配制杜氏藻基本培养液，向培养液中加入A5微量元素溶液，调节pH，灭菌、冷却至室温；
(2)将杜氏藻细胞加入培养液中，置于光照培养箱中培养，待OD600达到0.7的时候加入阻断剂三乙胺200-800ppm，继续培养24～96小时，然后提取色素，得到番茄红素。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述杜氏藻基本培养液，其成分为：NaNO3 0.420g/L，NaCl 87.69g/L，NaH2PO4·2H2O 0.156g/L，NaHCO3 0.840g/L，KCl 0.074g/L，MgSO4·7H2O 1.230g/L，CaCl2·2H2O 0.044g/L，0.1％EDTA铁0.5 mL /L，调pH至7.5。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的A5微量元素溶液，其成分如下：H3BO3 286，MnCl2·4H2O 181，ZnSO4·7H2O 22，CuSO4·5H2O 7.9，(NH4)6Mo7O24·4H2O 3.9，单位均为mg/100mL，加入的量为1 mL /L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的灭菌条件：压力102.9 kPa，温度121℃，时间20 min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的培养箱的培养条件为：在光照度为6000 Lx，光暗周期为14h:10h，温度为26℃，以转速50r/min的转速震荡培养。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的阻断剂三乙胺的加入量为500 ppm。
7.根据权利要求1～6任意一项所述的方法，其特征在于，所述的提取色素的方法为：取10mL藻液在10000rpm转速下离心1min，弃上清液，向藻泥中加入2ml丙酮，涡旋分散，8000rpm转速下离心1min，取上清转移到新的离心管中，加入0.2mL 60％ KOH，去除叶绿素，过0.45μm的滤膜。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)加入阻断剂后继续培养48～72小时。
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