CN101402987B - 提高耐辐射奇球菌类胡萝卜素产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种提高耐辐射奇球菌类胡萝卜素产量的方法，是将发酵培养到稳定早期的耐辐射奇球菌通过光照诱导处理和后培养，诱导菌体类胡萝卜素大量合成，以提高其产量。本发明的菌体经过离心分离，低温有机溶剂提取，所获得的类胡萝卜素产量比未经光照处理的提高了25％以上。本发明方法设计合理，条件温和、操作简便，可用于有效提高发酵法生产类胡萝卜素的产量。
Description
技术领域
本发明涉及一种类胡萝卜素的提取方法，尤其涉及光照诱导提高耐辐射奇球菌类胡萝卜素产量的方法。
背景技术
类胡萝卜素是一类天然色素的总称，属于类萜化合物，以异戊二烯残基为单元组成，基本结构都是一个较长的共轭体系，不易溶于水，易溶于有机溶剂，属于脂溶性色素。目前已经确定结构的类胡萝卜素达600种以上，普遍存在于动物、植物、真菌、藻类和细菌中，在生物体内起着不可替代的作用。随着研究的深入，它的医疗保健作用越来越引起人们的广泛关注。类胡萝卜素不仅是植物体内的功能性分子，在动物和人类健康中也发挥重要作用。越来越多的研究表明，食用富含类胡萝卜素的食物可减少与老化有关的疾病如冠心病、黄斑退化疾病、白内障以及某些癌症的发病率。动物和人体无法从头合成类胡萝卜素，只能从食物中摄取。有些类胡萝卜素在人体内具有维生素A前体的活性。
耐辐射奇球菌是一种极端环境微生物，以对电离辐射、紫外射线、干燥和氧化压力等极端条件表现极强抗性而著称。它的这种超强抗性有一部分归功于其体内含有红色类胡萝卜素。研究表明，耐辐射奇球菌类胡萝卜素的自由基清除能力远远高于人们熟知的β-胡萝卜素、番茄红素和虾青素等。基于耐辐射奇球菌类胡萝卜素的特殊生物活性及其在医药保健品、精细化工以及饲料等行业的广阔应用前景，提高耐辐射奇球菌类胡萝卜素的产量具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高耐辐射奇球菌类胡萝卜素产量的方法，本发明所用的菌株为耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)，来源于美国典型物保藏中心，保藏号：ATCC No.13939，通过以下步骤实现：
(1)菌种的活化：
将耐辐射奇球菌划线接种于TGY固体培养基上，培养基组成为蛋白胨5g/L，酵母提取物3g/L，葡萄糖1g/L，30±1℃培养40～45小时，挑取单菌落接种于三角瓶中摇瓶培养至对数生长期早期；
(2)发酵培养条件：
将上述种子液按2％体积的接种量接入发酵液体培养基中，28～32℃培养38～42小时；
(3)光照诱导条件：
①菌体光照诱导时期的选择：菌体生长到38～42小时，即稳定早期，菌浓度>108ml-1，菌体形态多数呈二联体，此时是进行光诱导的最佳时期；②诱导方法：将菌体培养物置于带有光源的培养室内光照处理30～60分钟，光源为LED光源，可以是具有波长范围400～700nm的光，光照强度为100～150μmol·m-2·s-2；
(4)菌体光照后培养的条件：
经光照诱导后的菌体，在30～32℃条件下培养60分钟，使菌体在接受光照刺激后，大量合成耐辐射奇球菌类胡萝卜素；
(5)耐辐射奇球菌类胡萝卜素的提取：
①菌液离心5000rpm，4℃，10分钟，收集菌体细胞沉淀，用50～60mM，pH7.0的磷酸盐缓冲液洗涤三次，离心收集菌体细胞；
②每克湿菌体加入1～3倍低温预冷(-18℃)的提取液(甲醇:丙酮(按体积比)＝2:7)，冰上振荡30分钟，8000rpm，3～4℃条件下离心10～20分钟，收集上清液，重复提取三次并将提取液混合，即为耐辐射奇球菌类胡萝卜素提取液。
本发明的有益之处是：将发酵培养到稳定早期的耐辐射奇球菌经光照处理和后培养，诱导菌体类胡萝卜素大量合成，以提高其产量。本发明的菌体经过离心分离，低温有机溶剂提取，所获得的类胡萝卜素产量比未经光照处理的提高了25％以上。本发明方法设计合理，条件温和、操作简便，可用于有效提高发酵法生产类胡萝卜素的产量。
附图说明
图1为本发明方法的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，这些实施例应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
参见图1，(1)耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)菌种来源于美国典型物保藏中心(ATCC No.13939)，划线接种于TGY固体培养基上，30℃培养40小时，挑取单菌落接种于三角瓶中摇瓶培养至对数生长期早期；
(2)将活化的种子液按2％体积的接种量接入发酵液体培养基中，30℃培养40小时；
(3)将菌体培养物置于带有光源(400～700nm连续波长，150μmol·m-2·s-2)的培养室内光照处理30分钟；
(4)将光照诱导后的菌体，在30℃条件下培养60分钟；
(5)耐辐射奇球菌类胡萝卜素的提取：
①菌液离心5000rpm，4℃，10分钟，收集菌体细胞沉淀，用50～60mM，pH 7.0的磷酸盐缓冲液洗涤三次，离心收集菌体细胞；
②每克湿菌体加入1～3倍低温预冷(-18℃)的提取液(甲醇:丙酮(按体积比)＝2:7)，冰上振荡30分钟，8000rpm，4℃条件下离心10分钟，收集上清液，重复提取三次并将提取液混合，即为耐辐射奇球菌类胡萝卜素提取液。类胡萝卜素含量为134.8μg/g干菌体，比无光照情况(89.1μg/g)增加了51.3％。
实施例2
(1)耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)菌种来源于美国典型物保藏中心(ATCC No.13939)，划线接种于TGY固体培养基上，30℃培养40小时，挑取单菌落接种于三角瓶中摇瓶培养至对数生长期早期；
(2)将活化的种子液按2％体积的接种量接入发酵液体培养基中，30℃培养40小时；
(3)将菌体培养物置于带有光源(400～700nm连续波长，100μmol·m-2·s-2)的培养室内光照处理60分钟；
(4)将光照诱导后的菌体，在30℃条件下培养60分钟；
(5)耐辐射奇球菌类胡萝卜素的提取：
①菌液离心5000rpm，4℃，10分钟，收集菌体细胞沉淀，用50～60mM，pH7.0的磷酸盐缓冲液洗涤三次，离心收集菌体细胞；
②每克湿菌体加入1～3倍低温预冷(-18℃)的提取液(甲醇:丙酮(按体积比)＝2:7)，冰上振荡30分钟，8000rpm，4℃条件下离心10分钟，收集上清液，重复提取三次并将提取液混合，即为耐辐射奇球菌类胡萝卜素提取液。类胡萝卜素含量为111.4μg/g干菌体，比无光照情况(89.1μg/g)增加了25％。
实施例3
(1)耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)菌种来源于美国典型物保藏中心(ATCC No.13939)，划线接种于TGY固体培养基上，30℃培养40小时，挑取单菌落接种于三角瓶中摇瓶培养至对数生长期早期；
(2)将活化的种子液按2％体积的接种量接入发酵液体培养基中，30℃培养40小时；
(3)将菌体培养物置于带有光源(波长650～660nm，100μmol·m-2·s-2)的培养室内光照处理60分钟；
(4)将光照诱导后的菌体，在30℃条件下培养60分钟；提取耐辐射奇球菌类胡萝卜素。
(5)耐辐射奇球菌类胡萝卜素的提取：
①菌液离心5000rpm，4℃，10分钟，收集菌体细胞沉淀，用50～60mM，pH7.0的磷酸盐缓冲液洗涤三次，离心收集菌体细胞；
②每克湿菌体加入1～3倍低温预冷(-18℃)的提取液(甲醇:丙酮(按体积比)＝2:7)，冰上振荡30分钟，8000rpm，4℃条件下离心10分钟，收集上清液，重复提取三次并将提取液混合，即为耐辐射奇球菌类胡萝卜素提取液。类胡萝卜素含量为197.1μg/g干菌体，比无光照情况的增加了121.2％。
Claims (3)
1.一种提高耐辐射奇球菌类胡萝卜素产量的方法，所用的菌株为耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)，来源于美国典型物保藏中心，保藏号：ATCCNo.13939，其特征是通过以下步骤实现：
(1)菌种的活化：
将耐辐射奇球菌划线接种于TGY固体培养基上，培养基组成为蛋白胨5g/L，酵母提取物3g/L，葡萄糖1g/L，30±1℃培养40～45小时，挑取单菌落接种于三角瓶中摇瓶培养至对数生长期早期；
(2)发酵培养条件：
将步骤(1)的种子液按2％体积的接种量接入发酵液体培养基中，28～32℃培养38～42小时；
(3)光照诱导条件：①菌体光照诱导时期的选择：菌体生长到38～42小时，菌浓度＞108ml-1，菌体形态多数呈二联体；②诱导方法：将菌体培养物置于带光源的培养室内光照处理30～60分钟；
(4)菌体光照后培养的条件：
经光照诱导后的菌体，在30～32℃条件下培养60分钟，使菌体在接受光照刺激后，大量合成耐辐射奇球菌类胡萝卜素；
(5)耐辐射奇球菌类胡萝卜素的提取：
①菌液离心5000rpm，4℃，10分钟，收集菌体细胞沉淀，用50～60mM，pH 7.0的磷酸盐缓冲液洗涤三次，离心收集菌体细胞；②每克湿菌体加入1～3倍低温预冷的提取液，冰上振荡30分钟，8000rpm，3～4℃条件下离心10～20分钟，收集上清液，重复提取三次并将提取液混合，即为耐辐射奇球菌类胡萝卜素提取液。
2.根据权利要求1所述的一种提高耐辐射奇球菌类胡萝卜素产量的方法，其特征是：步骤(3)中第②步所述光照的光源为LED光源，波长范围400～700nm，光照强度为100～150μmol·m-2·s-1。
3.根据权利要求1所述的一种提高耐辐射奇球菌类胡萝卜素产量的方法，其特征是：步骤(5)的第②步所用的是-18℃低温预冷的按体积比甲醇∶丙酮＝2∶7的提取液。
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Hua Yuejin Inventor after: Shen Shaochuan Inventor after: Tian Bing Inventor after: Sun Zongtao Inventor before: Hua Yuejin Inventor before: Tian Bing Inventor before: Shen Shaochuan Inventor before: Sun Zongtao |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: HUA YUEJIN TIAN BING SHEN SHAOZHUAN SUN ZONGTAO TO: HUA YUEJIN SHEN SHAOZHUAN TIAN BING SUN ZONGTAO |
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Granted publication date: 20111026 |