CN106978464B - 一种提高蛹虫草Cm04类胡萝卜素产量的固体发酵方法 - Google Patents

一种提高蛹虫草Cm04类胡萝卜素产量的固体发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高蛹虫草Cm04类胡萝卜素产量的固体发酵方法。本发明以蛹虫草Cm04类胡萝卜素含量为指标，提供了最佳培养条件为大米培养基30 g，营养液蛋白胨浓度为1.5%，黑暗培养天数为6天，光照培养时间为8天，得到的蛹虫草Cm04固体发酵后的类胡萝卜素含量可显著提高至309.54μg/g，本发明采用单因素与正交试验相结合的方法验证了优化的结果。本发明还通过添加粘红酵母小分子物质Part O提取物作为激发子进一步提高蛹虫草Cm04中类胡萝卜素含量，对粘红酵母的最优发酵时间、小分子物质Part O提取物最佳浓度和最佳的添加时间进一步优化，显著提高蛹虫草Cm04中类胡萝卜素的产量获得了分别比对照提高38.19%、26.86%和47.44%的显著效果，本发明方法还具有操作简单，效果稳定等优点。

Description

一种提高蛹虫草Cm04类胡萝卜素产量的固体发酵方法
技术领域
本发明涉及蛹虫草人工培育技术领域，更具体地，涉及一种提高蛹虫草（Cordyceps militaris）Cm04类胡萝卜素产量的固体发酵方法。
背景技术
在传统中药中，部分虫草菌，如冬虫夏草、蛹虫草、大团囊虫草等，它们与寄主的复合体常常可以直接入药。冬虫夏草作为我国传统的名贵中药材，迄今为止，人们仍然没有实现冬虫夏草的规模化人工培养。尤其是近些年来，随着市场价格不断上涨，冬虫夏草被过渡开采，其野生资源不断减少，已经被列入“国家二级保护物种”。
在药用价值方面，蛹虫草与冬虫夏草十分类似，含有诸如虫草酸、虫草素、虫草多糖、甾类、甘露醇和超氧化物歧化酶(SOD)等生物活性物质。蛹虫草还含有17种氨基酸，总蛋白质含量高达30%，其中35.47%为必需氨基酸。另外，蛹虫草还含有VA、VD、VE、VC、VB1、VB2和VB6等多种维生素。此外，与冬虫夏草要求“苛刻”的生长环境不同，蛹虫草不仅生长更快，而且易于人工培养。
蛹虫草具有免疫系统调节、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖、镇静、催眠和调节内分泌系统等功效。新近研究表明蛹虫草含有稀少的水溶性类胡萝卜素，具有独特的生理价值。
蛹虫草作为一种珍贵的食药用真菌，目前为止对其活性成分的研究多集中于虫草素、虫草酸、虫草多糖、腺苷和超氧化物歧化酶等。自付鸣佳首次对蛹虫草产类胡萝卜素的特性进行了研究报道和Dong首次证实了蛹虫草中的类胡萝卜素大部分是水溶性强的北虫草黄素以来，对于蛹虫草类胡萝卜素的研究还是相对较少。
类胡萝卜素是由类异戊二烯单位组成的碳氢化合物及其氧化衍生物的总称，具有抗炎、抗癌、抗氧化等的功能效力，现今发现的类胡萝卜素绝大部分是脂溶性的类胡萝卜素，人体难以直接吸收利用且大部分遇光和热不稳定。蛹虫草类胡萝卜素作为迄今为止发现的一类罕见的水溶性类胡萝卜素，与传统的类胡萝卜素相比，其理论上应该具有更强的潜在生理活性，故对其开发应用是当前亟待解决的问题。现如今，对蛹虫草所含类胡萝卜素的研究已经日益增多，但绝大部分仍处于提取、鉴定等阶段，而对如何提高类胡萝卜素的含量鲜有报道。
目前关于蛹虫草比较成熟的是液态深层发酵。但是固体发酵与液态发酵相比，具有其重要的优势：固体发酵原料来源广泛易得，并且低价；其次，固体发酵技术和设备操作简单；再者，固体发酵产率较高；此外，固体发酵下游工程相对简单，目的产物一般沉积在固体基质，有时不用提取即可直接利用。总结来说，固体发酵投资较少，能耗较低，产率较高。
蛹虫草是大型真菌，它本来就是生长在固体物质上面，现今的大规模栽培蛹虫草子实体用的都是固体培养的方式，故利用固体发酵的方法本来就是模拟它的原始生活状态。但是现有的蛹虫草固态发酵后类胡萝卜素产量很低，营养价值受到限制，影响了其推广应用。总结获得一种提高蛹虫草类胡萝卜素产量的固体发酵方法具有重要的实际应用价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有固态发酵技术中对提高蛹虫草（Cordyceps militaris）Cm 04中类胡萝卜素产量方法的不足，提供一种操作简单、效果稳定的提高蛹虫草Cm04类胡萝卜素产量的固体发酵方法。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
提供一种提高蛹虫草Cm04类胡萝卜素产量的固体发酵方法，通过优化蛹虫草Cm04固体发酵条件，以及添加粘红酵母中小分子物质Part O的提取物作为激发子进一步提高蛹虫草Cm04类中胡萝卜素的产量。
具体地，所述方法包括以下步骤：
S01.菌种活化：将保存的原始菌株接种到固体平板培养基上，黑暗培养至菌丝长满培养皿，光照培养使其转色，得到活化的母种；
S02.二级活化：取S01所述母种的菌丝块接种于液体培养基中，振荡培养，待长满菌丝球后，得到活化的液体种子；
S03.固体发酵：将步骤S02所述液体种子，接种至蛹虫草Cm04发酵固体培养基中，25℃培养箱中黑暗培养后，20℃、1200Lux、光照培养；
其中，在固体发酵过程中添加粘红酵母中小分子物质Part O的提取物作为激发子提高蛹虫草Cm04类胡萝卜素产量；S03所述蛹虫草Cm04发酵培养基的制备方法为于组培瓶装入大米培养基30g，营养液25mL，121℃灭菌30min后备用；所述营养液的制备方法为加入质量体积比为1.5%的蛋白胨、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁0.5g，定容至1000mL；所述粘红酵母中小分子物质Part O的提取物是通过分离粘红酵母的粗提物，去除蛋白质和多糖制得；所述小分子物质Part O提取物的浓度为1.5g/L；
所述小分子物质Part O提取物的制备方法为：
S11.将粘红酵母接种到培养基中，振荡培养；
S12.收集粘红酵母菌体，干燥；
S13.加入石英砂和超纯水对粘红酵母菌体进行研磨，抽滤，定容，灭菌，制得粘红酵母粗提物；
S14.取100 mL的S13所述粘红酵母粗提物，水浴浓缩至10 mL；
S15.加入预冷的95%乙醇，边加入边混合，得粘红酵母粗提物混合液，于静置；
S16.将S15所述粘红酵母粗提物混合液离心，使得混合液分成沉淀和上清液两部分；
S17.取S16所述上清液，在真空条件下，旋转蒸发至干，所得的残留物用100 mL双蒸水溶解，制得小分子物质Part O提取物。
优选地，步骤S03所述黑暗培养时间为6天，所述光照培养时间为8天。
优选地，所述小分子物质Part O提取物的添加方法为：将小分子物质Part O提取物喷洒在蛹虫草Cm04菌丝的表面。
优选地，所述喷洒小分子物质Part O提取物的时间为所述蛹虫草Cm04接种后培养到第五天。
优选地，步骤S11所述培养基为YPD液体培养基；所述振荡培养为25℃、220r/min摇床振荡培养；
优选地，步骤S12所述收集粘红酵母菌体的方法为离心收集；所述干燥的条件为65℃干燥5小时；
优选地，步骤S13所述石英砂的重量为所述粘红酵母菌体的相等重量；所述超纯水的体积为所述菌体和石英砂混合物的5倍体积；所述灭菌条件为121℃灭菌30min；
优选地，步骤S15所述95%乙醇体积为40mL；所述静置条件为4℃下静置12 h；
优选地，步骤S16所述离心条件为8000 r/min离心15 min；
优选地，步骤S17所述真空蒸发条件为40℃，-0.08MP真空条件；
进一步地，所述粘红酵母的振荡培养时间为60小时。
本发明的有益效果：
本发明针对现有技术中对提高蛹虫草Cm04中类胡萝卜素产量方法的不足，提供一种操作简单、效果稳定的提高蛹虫草Cm04类胡萝卜素产量的固体发酵方法，可以显著提高蛹虫草Cm04中类胡萝卜素的产量。
本发明首次通过添加粘红酵母中小分子物质Part O的提取物来提高蛹虫草Cm04中类胡萝卜素的产量，并且对粘红酵母的培养条件及小分子物质Part O的提取物的添加方式进行了进一步优化，可以更进一步地显著提高蛹虫草Cm04中类胡萝卜素的产量。
附图说明
图1大米装料量对蛹虫草Cm04类胡萝卜素含量的影响。
图2蛋白胨浓度对蛹虫草Cm04类胡萝卜素含量的影响。
图3黑暗培养天数对蛹虫草Cm04类胡萝卜素含量的影响。
图4光照培养天数对蛹虫草Cm04类胡萝卜素含量的影响。
图5粘红酵母激发子对蛹虫草Cm04类胡萝卜素含量的影响。
图6粘红酵母中小分子物质Part O提取物的浓度对蛹虫草Cm04类胡萝卜素的影响。
图7粘红酵母中小分子物质Part O提取物的添加时间对蛹虫草Cm04类胡萝卜素的影响。
图8粘红酵母发酵时间对蛹虫草Cm04类胡萝卜素的影响。
注：附图中结果=平均数±标准差（n=3），一列内的平均值具有不同字母表示差异显著（P<0.05）。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明方法。下述实施例和附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的生试剂原料，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。
主要检测蛹虫草Cm04中类胡萝卜素含量的方法：
（1）总类胡萝卜素的提取
光照结束后，将蛹虫草Cm04菌丝连同固体培养基一起置于55℃下，干燥48 h。粉碎，30目过筛，称取0.5 g，加10 mL 80%的乙醇浸提24 h，8000 r/min高速离心10 min，缓慢倒出上清，再加5 mL乙醇，充分混匀，再次离心后，合并上清液。
（2）总类胡萝卜素的全波长扫描
将上述上清液用双光束紫外可见风光光度计UV2310II进行全波长扫描。
（3）类胡萝卜素的含量测定
利用紫外可见光分光光度计UV1102在443nm的波长下测量吸光度。类胡萝卜素含量计算参照公式:
色素总量（μg/g）
Figure 95708DEST_PATH_IMAGE001
式中：A:吸光度；V:乙醇用量（mL）；D:提取液稀释倍数；E:消光系数（0.16）；G：（干燥粉碎物）
实施例1 固体培养条件的优化
S01.菌种活化：将保存的原始菌株接种到固体平板培养基上，黑暗培养至菌丝长满培养皿，光照培养使其转色，得到活化的母种；
S02.二级活化：取S01所述母种的菌丝块接种于液体培养基中，振荡培养，待长满菌丝球后，得到活化的液体种子；
S03.固体发酵：将步骤S02所述液体种子，接种至蛹虫草Cm04发酵固体培养基中，25℃培养箱中黑暗培养后，20℃、1200Lux、光照培养；
S03所述蛹虫草Cm04发酵培养基的制备：于组培瓶装入大米培养基30g，营养液25mL，121℃灭菌30min后备用；
所述营养液的制备：加入蔗糖、质量体积比为1.5%的蛋白胨、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁0.5g，定容至1000mL。
根据相关文献报道，以蛹虫草Cm04产类胡萝卜素总量为指标，考察大米装料量，蛋白胨浓度，暗培养天数，光照天数4个因素设计单因素实验。
（1）大米装料量
营养液蛋白胨浓度为1.0%（W/V），每250mL组培瓶大米装料量设为5个水平，分别是20 g，25 g，30 g，35 g，40 g，暗培养天数设为6 d，光照天数设为7 d。
结果如附图1所示，从图中可以看出，蛹虫草Cm04类胡萝卜素含量随着装料量的增加，而逐渐减少，在20 g的装料量时最大。
（2）蛋白胨浓度
每瓶大米装料量设为30 g，蛋白胨设为5个水平浓度（W/V），分别为0%、0.5%、1.0%、1.5%、2%，暗培养天数设为6 d，光照天数设为7 d。
结果如附图2所示，结果显示，随着蛋白胨浓度的增加，蛹虫草Cm04类胡萝卜素含量变化的趋势是波动的，但在蛋白胨浓度为1.5%的时候达到最高。
（3）黑暗培养天数
营养液蛋白胨浓度为1.0%（W/V），每瓶大米装料量设为25 g，黑暗培养天数设为4d、5 d、6 d、7 d、8 d，光照天数设为7 d。
结果如附图3所示，结果显示，随着黑暗培养天数的增加，类胡萝卜素含量呈现先升高，后下降的趋势，并且在第5 d达到顶峰，6 d和7 d的差异较小，下降趋势在第8 d最为明显。
（4）光照培养天数
营养液蛋白胨浓度为1.0%（W/V），每瓶大米装料量设为25 g，黑暗培养天数设为6d，光照天数设为5 d、6 d、7 d、8 d、9 d。
结果如附图4所示，结果显示，随着光照培养天数的增加，在第8 d达到最大值。
以上述蛹虫草Cm04的单因素实验为基础，以蛹虫草Cm04类胡萝卜素含量为考察指标，采用L9(34)正交表安排实验，考察大米装料量(A)、蛋白胨含量(B)、黑暗培养天数(C)、光照培养天数(D)4个因素，各3次重复，利用SPSS16.0软件分析实验结果，确定影响蛹虫草Cm04最佳培养条件。并通过方差分析对4个因素对蛹虫草Cm04类胡萝卜素含量的影响力进行主次排序。
影响蛹虫草Cm04类胡萝卜素的因素水平设置见表1；正交实验结果见表2，其中，K值代表：代表各因素水平的结果之和；方差分析结果见表3，其中均方数值代表：各因素水平的平方和与自由度的比值。
Figure 225338DEST_PATH_IMAGE002
Figure 774131DEST_PATH_IMAGE003
Figure 331015DEST_PATH_IMAGE004
结果显示，(D)因素对综合评分值具有显著影响,且因素作用主次为(D) > (B)>(C) > (A)，即光照时间对类胡萝卜素影响最大。根据表2中的K值结果，确定最优条件组合为A3B2C2D2，即大米装料量为30 g，蛋白胨浓度为1.5%（W/V），黑暗培养天数为6d，光照培养时间为8d。
根据试验结果，按最佳优化条件进行3次试验，结果显示在最优条件下蛹虫草Cm04的类胡萝卜素含量平均达到309.54 μg/g，说明该培养条件显著提高了蛹虫草Cm04中类胡箩卜素的含量。
实施例2 粘红酵母激发条件的优化
将粘红酵母Rhodotorulaglutinis接种到YPD液体培养基中，25℃，220 r/min摇床振荡培养3天，离心收集粘红酵母菌体置于称重好的研钵中，65℃干燥5 h，再次称重，加入等重量的石英砂和5倍体积的超纯水进行研磨，抽滤，滤液，即为粘红酵母粗提物。粗提取物经过去多糖、去蛋白获得小分子物质Part O提取物作为激发子使用，提取物分别定容至0.5g/L、5 g/L、10 g/L、20 g/L、50 g/L五个浓度，经121℃，灭菌30 min，置于4℃冰箱保存。
分别在接种当天以及接种6天菌丝长满培养基时，将配置好相应浓度的激发子1mL 喷洒在蛹虫草Cm04菌丝的表面，进行发酵培养，同时设置空白对照组。不同浓度的小分子物质Part O提取物在接种当天以及接种6天分别添加时对蛹虫草Cm04类胡萝卜素含量的影响如附图5所示，结果显示，在第6天时添加小分子物质Part O提取物，在0.5 g/L、5 g/L、10 g/L、20 g/L共四个浓度下有正向促进作用。其中，在0.5 g/L的浓度下，类胡萝卜素含量显著提高了13.72%。这说明，粘红酵母具有提高蛹虫草Cm04中类胡萝卜素含量的作用。
进一步优化粘红酵母对蛹虫草Cm04的激发条件，分别选取激发子生长时间，激发子添加浓度，激发子添加时间三个因素，设计单因素实验。
（1）小分子物质Part O提取物的添加浓度
在前期粗筛结果的基础上，本实验将激发子浓度的范围缩小，控制恒定的粘红酵母发酵时间与加入时间，对小分子物质Part O提取物的浓度（W/V）进行梯度设计，浓度分别为0.5 g/L、1 g/L、1.5 g/L、2 g/L、2.5 g/L，研究粘红酵母激发子添加浓度对蛹虫草Cm04类胡萝卜素的影响。
结果如附图6所示，结果显示，不同的激发子浓度对类胡萝卜素含量的影响，随着激发子浓度的增加，最初是逐渐升高的，当激发子浓度达到1.5 g/L后，对类胡萝卜素含量的影响是波动的。当添加浓度分别为1.5 g/L，2 g/L，2.5 g/L时，类胡萝卜素含量较空白组提高了23.19%、17.45%和26.86%。这综合考虑，粘红酵母小分子物质Part O提取物的最佳添加浓度为1.5 g/L。
（2）小分子物质Part O提取物的添加时间
控制恒定的粘红酵母发酵时间与加入浓度，对粘红酵母小分子物质Part O提取物的添加时间进行梯度设计，添加时间分别为蛹虫草Cm04接种后的5天、6天、7天、8天、9天，研究粘红酵母激发子添加时间对蛹虫草Cm04类胡萝卜素的影响。
结果如附图7所示，结果显示，添加小分子物质Part O提取物后，对类胡萝卜素含量影响均呈现正向促进作用。除了接种后第5天以外，其余几天与对照相比差异比较小，而在接种后第5天添加激发子对类胡萝卜素含量的影响最为显著，提高了47.44%。这表明，小分子物质Part O提取物的最佳的添加时间为接种后第5天。
（3）粘红酵母的发酵时间
控制恒定的小分子物质Part O提取物的添加浓度与添加时间，对粘红酵母的发酵时间进行梯度设计，时间分别为48小时、60小时、72小时、84小时、96小时，研究粘红酵母激发子发酵时间对蛹虫草Cm04类胡萝卜素的影响。
结果如附图8所示，结果显示，不同发酵时间的粘红酵母菌体制成的小分子物质Part O提取物对蛹虫草Cm04类胡萝卜素含量的影响存在明显差异，其中，培养48小时，84小时和96小时的激发子对类胡萝卜素的合成无显著影响。但发酵时间为60小时和72小时的激发子可显著诱导蛹虫草Cm04中类胡萝卜素的合成，与对照相比，类胡萝卜素含量分别提高了38.19%和23.19%。这表明，粘红酵母的最佳发酵时间为60小时。

Claims (6)

1.一种提高蛹虫草（Cordyceps militaris）Cm04类胡萝卜素产量的固体发酵方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S01.菌种活化：将保存的原始菌株接种到固体平板培养基上，黑暗培养至菌丝长满培养皿，光照培养使其转色，得到活化的母种；
S02.二级活化：取S01所述母种的菌丝块接种于液体培养基中，振荡培养，待长满菌丝球后，得到活化的液体种子；
S03.固体发酵：将步骤S02所述液体种子，接种至蛹虫草Cm04发酵固体培养基中，25℃培养箱中黑暗培养后，20℃、1200Lux、光照培养；
其中，在固体发酵过程中添加粘红酵母中小分子物质Part O的提取物作为激发子提高蛹虫草Cm04类胡萝卜素产量；S03所述蛹虫草Cm04发酵培养基的制备方法为于组培瓶装入大米培养基30g，营养液25mL，121℃灭菌30min后备用；所述营养液的制备方法为加入质量体积比为1.5%的蛋白胨、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁0.5g，定容至1000mL；
所述粘红酵母中小分子物质Part O的提取物是通过分离粘红酵母的粗提物，去除蛋白质和多糖制得；
所述小分子物质Part O提取物的浓度为1.5g/L；
所述小分子物质Part O提取物的制备方法为：
S11.将粘红酵母接种到培养基中，振荡培养；
S12.收集粘红酵母菌体，干燥；
S13.加入石英砂和超纯水对粘红酵母菌体进行研磨，抽滤，定容，灭菌，制得粘红酵母粗提物；
S14.取100 mL的S13所述粘红酵母粗提物，水浴浓缩至10 mL；
S15.加入预冷的95%乙醇，边加入边混合，得粘红酵母粗提物混合液，于静置；
S16.将S15所述粘红酵母粗提物混合液离心，使得混合液分成沉淀和上清液两部分；
S17.取S16所述上清液，在真空条件下，旋转蒸发至干，所得的残留物用100 mL双蒸水溶解，制得小分子物质Part O提取物。
2.根据权利要求1所述提高蛹虫草Cm04类胡萝卜素产量的固体发酵方法，其特征在于，步骤S03所述黑暗培养时间为6天，所述光照培养时间为8天。
3.根据权利要求1所述提高蛹虫草Cm04类胡萝卜素产量的固体发酵方法，其特征在于，所述小分子物质Part O提取物的添加方法为：将小分子物质Part O提取物喷洒在蛹虫草Cm04菌丝的表面。
4.根据权利要求3提高蛹虫草Cm04类胡萝卜素产量的固体发酵方法，其特征在于，所述喷洒小分子物质Part O提取物的时间为所述蛹虫草Cm04接种后培养到第五天。
5.根据权利要求1所述提高蛹虫草Cm04类胡萝卜素产量的固体发酵方法，其特征在于，
步骤S11所述培养基为YPD液体培养基；所述振荡培养为25℃、220r/min摇床振荡培养；
步骤S12所述收集粘红酵母菌体的方法为离心收集；所述干燥的条件为65℃干燥5小时；
步骤S13所述石英砂的重量为所述粘红酵母菌体的相等重量；所述超纯水的体积为所述菌体和石英砂混合物的5倍体积；所述灭菌条件为121℃灭菌30min；
步骤S15所述95%乙醇体积为40mL；所述静置条件为4℃下静置12 h；
步骤S16所述离心条件为8000 r/min离心15 min；
步骤S17所述真空蒸发条件为40℃，-0.08MP真空条件。
6.根据权利要求1所述提高蛹虫草Cm04类胡萝卜素产量的固体发酵方法，其特征在于，所述粘红酵母的振荡培养时间为60小时。
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