KR20200063375A - 곤충으로부터 재배한 동충하초를 이용하여 코디세핀을 추출하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 곤충으로부터 재배한 동충하초를 이용하여 코디세핀(Cordycepin)을 추출하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 곤충을 배지로 이용하여 Cordyceps militaris 동충하초를 접종 후 배양하여 추출 후, 여과방법을 통해 여과하여 코디세핀을 추출하기 위한 최적의 배양 온도, 배양 일수 및 최적의 추출방법을 확립하여, 고함량, 고순도의 코디세핀의 추출을 극대화 시킬 수 있는 동충하초 재배 방법 및 추출 방법에 관한 것이다.

Description

곤충으로부터 재배한 동충하초를 이용하여 코디세핀을 추출하는 방법{A method for extracting Cordycepin from fruiting bodies of Cordyceps militaris on insect hosts}
본 발명은 곤충으로부터 재배한 동충하초를 이용하여 코디세핀(Cordycepin)을 추출하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 곤충을 배지로 이용하여 Cordyceps militaris 동충하초를 접종 후 배양하여, 코디세핀을 추출하기 위한 최적의 배양 온도, 배양 일수 및 최적의 추출방법을 확립하여, 고함량, 고순도의 코디세핀의 추출을 극대화 시킬 수 있는 동충하초 재배 방법 및 추출 방법에 관한 것이다.
곤충은 지상최대의 미활용 생물자원으로 생체이용, 기능이용, 곤충유래 활성물질 등의 중요한 연구개발에 활용할 수 있는 소재이다. 국제식량농업기구(FAO)에서 2050년경에는 현재의 약 2배 정도의 식량 요구가 예측된다는 발표가 있었으며, 곤충산업은 전 세계의 식량부족 위기를 극복하기 위한 매우 중요한 미래의 식량산업이기에, 세계적인 경향에 따라 경쟁력을 확보하기 위해 주력해야할 산업으로 주목되고 있다.
곤충은 소, 돼지, 닭 등의 기존 육류단백질원에 비해 최소 2배 이상의 단백질을 함유하고 있으며, 기존 육류 단백질원에는 없는 식이섬유와 필수 아미노산, 비필수 아미노산을 다량 함유하고 있어 현존하는 단백질원 중 영양학적으로 가장 우수하다는 평가를 받고 있다. 사육기간은 짧게는 2∼8개월로 가축의 사육기간 개체 수 대비 압도적 우위를 보이며 그 생산량은 소나 돼지의 수십 배를 넘는다. 또한, 소 한 마리 (대량 500kg)를 사육하는데 평균 120만원 이상의 사육비가 지출되는데 반해 같은 량의 식용곤충은 20만원대의 지출로도 사육이 가능하다.
현재 곤충산업 기반 구축을 강화하기 위해 농림축산식품부, 농촌진흥청, 산림청에서 곤충자원의 식품화, 사료화를 위한 제도개선을 추진하고 곤충자원을 활용한 기능성 의약품 소재개발 연구 등을 활발히 진행하고 있다. 또한 2016년 농림축산식품부 조사에 따르면 지역별 곤충사육 농가 조사에서 충청지역 263 농가를 비롯하여 총 1,261호 농가들이 지역별로 곤충사육을 하고 있으나 현재는 곤충이 시각적으로 혐오식품으로 인식되는 경향이 크기 때문에 사육한 곤충의 소비 및 활용에 의한 활성화 방법이 부족한 실정이다.
동충하초는 곤충을 기주로 하여 자라나는 약용버섯으로 비싸고 귀한 약재로 널리 알려져 있으므로, 곤충을 식품으로 활용하더라도 시각적으로 혐오감을 줄일 수 있고 기능성을 향상시킬 수 있어, 곤충 산업과 접목하여 활성화시킬 수 있는 적합한 활용분야이다.
동충하초는 자낭균강의 맥각균목 동충하초과에 속하는 소형의 버섯류로서, 겨울에는 곤충의 몸에 기생하고 있다가 여름에는 풀처럼 자라 나오는 모습에서 그 명칭이 유래되었다. 동충하초의 형성 과정을 자세히 살펴보면, 동충하초균이 자낭 포자나 분생 포자를 형성하여 살아 있는 곤충의 호흡기, 소화기, 관절 등 부드러운 부분을 통해 부착 침입한 후, 곤충 체내의 영양분을 섭취하면서 균사를 형성하여 곤충을 죽게 한 다음, 여름에 그 기주인 곤충의 양분을 이용하여 자실체를 형성하게 된다. 이러한 동충하초로는 페실로마이세스 자포니카(Paecilomyces japonica), 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris), 코디셉스 시넨시스(Cordyceps sinensis) 등이 있다.
동충하초는 그 종류에 따라 구성성분에 다소 차이가 있지만 일반적으로 수분, 지방, 조단백, 탄수화물 및 회분으로 구성되어 있으며, 단백질 중에는 인체에 필수적인 아미노산이 약 18종이 함유되어 있다. 또한, 동충하초에는 충초다당(Cordyceps Polysaccharides) 및 충초산(Cordycepic Acid)과 같은 특수한 성분이 함유되어 있어서, 고대로부터 결핵, 천식, 황달 등의 치료제 뿐만 아니라 불로장생의 비약으로 알려져 왔으며, 면역 강화 기능 및 항암 작용이 있다는 사실도 밝혀져 있다.
한편 상기 동충하초의 유용성분으로 가장 주목받고 있는 코디세핀(cordycepin)은 3-deoxyadenosine 계통의 천연 화합물로서, 영국의 Cunningham교수(1951년 영국 글라스고우 대학)가 동충하초로부터 추출하여 처음 보고한 것으로 알려져 있으며, 미국 식품의약국(FDA)에서 급성 림프구성 백혈병의 희귀 의약품으로 승인되었다. 코디세핀의 화학식은 하기 [화학식 1]의 구조를 가지며, 면역활성, 항염증, 항산화 및 항암, 당뇨, 고혈압과 같은 성인병 등 다양한 약리학적 특성이 보고되어왔다.
[화학식 1]
Figure pat00001
물질명: 코디세핀(Cordycepin)
CAS No.: 73-03-0
분자식: C10H13N5O3
특히, 밀리타리스 동충하초(Cordyceps militaris)는 여러 동충하초 중에서도 코디세핀을 상대적으로 많이 함유하고 있어서, 그 자실체는 폐를 보호하고 신장을 튼튼히 하는 것으로 알려져 있으며 결핵, 황달 등의 치료와 강장제로서의 효과가 널리 인정되고 있을 뿐만 아니라 주로 병후의 신체조절, 보약 등에 사용되는 고가의 한방 약재로 이용되고 있으며 특히 밀리타리스 동충하초의 약리 성분 중에는 면역 기능을 강화하는 성질이 함유되어 있어 감기, 폐결핵, 만성기침, 천식, 발작, 빈혈, 남성의 성적기능 장애, 고혈압 등에 다양한 효과를 나타내고 있다.
종래 관련 기술로는 공개특허공보 제10-2017-0050310호가 있으며 이는 동충하초의 추출방법 및 그 방법에 의해 추출된 추출물에 관한 것으로서, 현미배지에 접종한 밀리터리스 동충하초를 이산화탄소로 초임계 추출하는 방법을 개시하고 있으며, 등록특허공보 제10-1610888호는 동충하초로부터 다당체를 대량 생산하는 방법에 관한 것으로서, 동충하초를 pH가 조절된 MCM배지에 접종한 후 특정 온도에서 배양하여 다량의 다당체를 대량 생산하는 방법에 대해 기술하고 있다. 이처럼 동충하초의 기능성물질을 다량으로 얻는 방법에 대해서는 연구되고 있으나, 곤충만을 동충하초의 순수배지로 이용하여 고함량, 고순도의 코디세핀을 추출하기 위한 최적의 배양조건 및 추출방법에 관한 것에 대해서는 공지된 바 없다.
또한, 공개특허공보 제10-2017-0049353호는 고순도 코디세핀 추출방법에 관한 것으로서, 시중에서 구할 수 있는 동충하초를 추출하여 컬럼 흡착크로마토그래피를 통과시켜 코디세핀 분획을 얻고, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제한 후 재결정하여 고순도의 코디세핀을 얻는 방법에 대해 기술하고 있다. 하지만 최대 35∼40%의 코디세핀 함량을 추출할 수 있어 한 번에 추출할 수 있는 코디세핀의 양이 너무 적다는 문제점이 있었다.
국내 공개특허공보 제10-2017-0050310호 (2017. 05. 11) 국내 등록특허공보 제10-1610888호 (2016. 04. 04) 국내 공개특허공보 제10-2017-0049353호 (2017. 05. 10)
본 발명은 곤충만을 동충하초의 순수배지로 이용하여 코디세핀을 얻기 위한 것이다.
또한, 본 발명은 고함량, 고순도의 코디세핀을 얻기 위해 곤충을 배지로 하여 배양한 동충하초를 배양시 최적의 배양조건을 찾기 위한 것이다.
또한, 본 발명은 고함량, 고순도의 코디세핀을 얻기 위해 곤충을 배지로 하여 배양한 동충하초를 추출시 최적의 추출방법을 찾기 위한 것이다.
상기 과제를 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 곤충배지를 준비하는 단계; (b) 상기 곤충배지에 Cordyceps militaris를 접종하는 단계; (c) 상기 접종 후, 25 내지 35℃의 온도, 60 내지 70%의 상대습도에서 10 내지 15일 또는 35 내지 50일 동안 암조건으로 배양하는 단계; (d) 상기 배양된 자실체를 수확, 건조 후 분말로 분쇄하는 단계; (e) 상기 분쇄된 분말에서 동충하초 추출물을 추출하는 단계; 및 (f) 상기 추출된 동충하초 추출물을 여과방법으로 여과하여 코디세핀을 분리하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 곤충으로부터 재배한 동충하초를 이용하여 코디세핀을 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 곤충배지는 수분함량을 60 내지 70%로 조정하여 고온, 고압으로 멸균 후 냉각하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계에서 배양된 자실체를 건조하는 과정은 55 내지 65℃의 온도에서 6.5 내지 7.6%의 수분함량이 될 때까지 오븐에서 건조되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 (e) 단계에서 동충하초 추출물을 추출하는 과정은 추출 용매로 100% 증류수에 22 내지 26시간 동안 진탕 방치하여 추출하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 추출방법으로 배양되고 분리된 순도 90 내지 99.9%의 코디세핀을 제공한다.
본 발명의 곤충으로부터 재배한 동충하초를 이용하여 코디세핀을 추출하는 방법은 곤충만을 동충하초의 순수배지로 이용하여 고함량, 고순도의 코디세핀을 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은 고함량, 고순도의 코디세핀을 얻기 위해 곤충을 배지로 하여 배양한 동충하초의 최적의 배양조건과 최적의 추출방법을 확립할 수 있다.
나아가 본 발명은 영양학적으로 뛰어난 곤충을 식량 자원으로 활용 가능한 활용화 방법을 제시할 수 있으며, 곤충 농가 소득을 확대하는데 기여할 수 있다.
도 1은 분리된 코디세핀의 HPLC와 UV 스펙트럼의 크로마토그램을 나타낸 그래프이다.
도 2는 20℃에서 누에 번데기로부터 재배한 동충하초의 배양 일수에 따른 코디세핀 함량을 나타낸 그래프이다.
도 3은 25℃에서 누에 번데기로부터 재배한 동충하초의 배양 일수에 따른 코디세핀 함량을 나타낸 그래프이다.
도 4는 30℃에서 누에 번데기로부터 재배한 동충하초의 배양 일수에 따른 코디세핀 함량을 나타낸 그래프이다.
도 5는 35℃에서 누에 번데기로부터 재배한 동충하초의 배양 일수에 따른 코디세핀 함량을 나타낸 그래프이다.
도 6은 20℃에서 흰점박이 꽃무지 유충으로부터 재배한 동충하초의 배양 일수에 따른 코디세핀 함량을 나타낸 그래프이다.
도 7은 25℃에서 흰점박이 꽃무지 유충으로부터 재배한 동충하초의 배양 일수에 따른 코디세핀 함량을 나타낸 그래프이다.
도 8은 30℃에서 흰점박이 꽃무지 유충으로부터 재배한 동충하초의 배양 일수에 따른 코디세핀 함량을 나타낸 그래프이다.
도 9는 35℃에서 흰점박이 꽃무지 유충으로부터 재배한 동충하초의 배양 일수에 따른 코디세핀 함량을 나타낸 그래프이다.
도 10은 20℃에서 갈색 거저리로부터 재배한 동충하초의 배양 일수에 따른 코디세핀 함량을 나타낸 그래프이다.
도 11은 25℃에서 갈색 거저리로부터 재배한 동충하초의 배양 일수에 따른 코디세핀 함량을 나타낸 그래프이다.
도 12는 30℃에서 갈색 거저리로부터 재배한 동충하초의 배양 일수에 따른 코디세핀 함량을 나타낸 그래프이다.
도 13은 35℃에서 갈색 거저리로부터 재배한 동충하초의 배양 일수에 따른 코디세핀 함량을 나타낸 그래프이다.
도 14는 20℃에서 장수 풍뎅이 유충으로부터 재배한 동충하초의 배양 일수에 따른 코디세핀 함량을 나타낸 그래프이다.
도 15는 25℃에서 장수 풍뎅이 유충으로부터 재배한 동충하초의 배양 일수에 따른 코디세핀 함량을 나타낸 그래프이다.
도 16은 30℃에서 장수 풍뎅이 유충으로부터 재배한 동충하초의 배양 일수에 따른 코디세핀 함량을 나타낸 그래프이다.
도 17은 35℃에서 장수 풍뎅이 유충으로부터 재배한 동충하초의 배양 일수에 따른 코디세핀 함량을 나타낸 그래프이다.
도 18은 20℃에서 벼메뚜기로부터 재배한 동충하초의 배양 일수에 따른 코디세핀 함량을 나타낸 그래프이다.
도 19는 25℃에서 벼메뚜기로부터 재배한 동충하초의 배양 일수에 따른 코디세핀 함량을 나타낸 그래프이다.
도 20은 30℃에서 벼메뚜기로부터 재배한 동충하초의 배양 일수에 따른 코디세핀 함량을 나타낸 그래프이다.
도 21은 35℃에서 벼메뚜기로부터 재배한 동충하초의 배양 일수에 따른 코디세핀 함량을 나타낸 그래프이다.
도 22는 20℃에서 쌍별 귀뚜라미로부터 재배한 동충하초의 배양 일수에 따른 코디세핀 함량을 나타낸 그래프이다.
도 23은 25℃에서 쌍별 귀뚜라미로부터 재배한 동충하초의 배양 일수에 따른 코디세핀 함량을 나타낸 그래프이다.
도 24는 30℃에서 쌍별 귀뚜라미로부터 재배한 동충하초의 배양 일수에 따른 코디세핀 함량을 나타낸 그래프이다.
도 25는 35℃에서 쌍별 귀뚜라미로부터 재배한 동충하초의 배양 일수에 따른 코디세핀 함량을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 곤충으로부터 재배한 동충하초를 이용하여 코디세핀(Cordycepin)을 추출하는 방법에 관한 것으로 곤충을 배지로 이용하여 Cordyceps militaris 동충하초를 접종 후 배양하여, 코디세핀을 추출하기 위한 최적의 배양 온도, 배양 일수 및 최적의 추출방법을 확립하여, 고함량, 고순도의 코디세핀의 추출을 극대화 시킬 수 있는 동충하초 재배 방법 및 추출 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 곤충으로부터 재배한 동충하초를 이용하여 코디세핀을 추출하는 방법은 먼저 곤충배지를 준비한 후, 상기 곤충배지에 Cordyceps militaris를 접종한다. 접종 후, 25 내지 35℃의 온도, 60 내지 70%의 상대습도에서 10 내지 15일 또는 35 내지 50일 동안 암조건으로 배양한 다음, 배양된 자실체를 수확, 건조 후 분말로 분쇄한다. 분쇄된 분말에서 동충하초 추출물을 추출한 후, 추출된 추출물을 여과방법으로 여과하여 코디세핀을 분리한다.
이하, 본 발명에 대해 하기 실시예와 실험예에서 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명이 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 태양을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
<실시예 1> 곤충배지의 준비
본 실시 예에서 곤충배지로 사용된 곤충은 누에 번데기, 갈색 거저리, 점박이 꽃무지 유충, 장수풍뎅이 유충, 벼메뚜기, 쌍별 귀뚜라미가 사용되었다. 본 발명의 곤충배지의 곤충은 누에 번데기, 갈색 거저리, 흰점박이 꽃무지 유충, 장수풍뎅이 유충, 벼메뚜기, 쌍별 귀뚜라미를 포함하지만, 본 발명에 따른 곤충으로부터 재배한 동충하초를 이용하여 고함량의 코디세핀을 추출하는 방법에서 곤충은 이에 제한되지 않는다.
곤충배지로 사용되는 곤충은 깨끗한 물에 세척하여 오염물질을 제거한 후에, 850cc PP병에 곤충 100g을 넣고 수분함량은 60∼70%으로 조정하였다. 그리고 121℃, 1.2기압에서 30분간 고온 고압 멸균하고, 멸균된 곤충배지를 16∼20℃로 충분히 냉각시켜 주었다. 상기 곤충배지의 수분함량이 60% 미만일 경우는 균사배양 속도가 너무 느렸고, 70% 이상일 경우는 오염되는 확률이 증가하여 비경제적이다.
<실시예 2> 곤충으로부터 재배한 동충하초 추출물의 제조
실시예 1에서 준비한 곤충배지에 배양된 Cordyceps militaris 동충하초 액체종균을 15∼20ml 접종한 후에 접종된 동충하초를 배양실로 옮겨 균사배양을 유도하였다. 배양실 온도조건은 20℃, 25℃, 30℃, 35℃의 조건의 배양실에서 배양하였고, 상대습도는 60∼65%, 암조건으로 배양하였다. 배양일수는 5일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 35일, 40일, 45일, 50일간 배양하였다.
상기 배양된 자실체는 수분 함량이 6.86% 내지 7.58%가 될 때까지 55 내지 65℃의 온도에서 오븐으로 건조시켰다. 건조된 상기 자실체는 분쇄기 (Retsch, Haan, Germany)로 0.5 ~ 1mm 크기로 분쇄하여 분말로 제조하였다. 상기 건조 수분함량이 6.86% 미만일 경우는 추출 시 소요되는 시간이 증가하였고, 7.58% 이상일 경우는 추출물의 수득률이 너무 낮아지게 되었다.
상기 건조된 자실체 분말 5g을 80% 메탄올 250ml로 추출하고, 동시에 다른 5g을 250ml의 100% 증류수로 22 내지 26시간 동안 추출 하였다. 상청액을 1500rpm에서 5 분 동안 원심 분리하여 분리 한 후 0.45 ㎛ 필터로 여과 하였다.
<실시예 3> 곤충으로부터 재배한 동충하초 추출물에서 코디세핀의 분리
본 발명의 코디세핀을 분리하는 방법은 추출물을 다양한 여과방법으로 여과하여 코디세핀을 분리할 수 있으며, 바람직하게는 컬럼 흡착크로마토그래피를 이용하여 코디세핀을 분리할 수 있다.
곤충으로부터 재배한 동충하초 추출물에서 코디세핀의 분리하기 위해 실시예 2에서 제조된 80% 메탄올 추출물과 100% 증류수 추출물을 감압하여 증발시켜 추출물을 수득하고 100ml의 증류수에 현탁시킨 후, 컬럼 흡착크로마토그래피를 이용하여 코디세핀을 분리하였다. 가장 많은 양의 코디세핀으로 이끄는 최적 조건의 용매 시스템을 결정하기 위해 100% 물로 시작해서 100% 메탄올로 끝나는 물: 메탄올 농도 구배 시스템(100% 물: 0% 메탄올, 80% 물: 20% 메탄올, 60% 물: 40% 메탄올, 40% 물: 60% 메탄올, 20% 물: 80% 메탄올, 0% 물: 100% 메탄올)으로 용매의 농도를 처리하여 컬럼 흡착크로마토그래피를 실시하였다.
본 발명의 컬럼 흡착크로마토그래피에서 흡착수지는 SP207, HP20SS, Diaion HP 20, SP-850, 활성탄, 또는 Amberlite XAD-2,4로부터 선택된 흡착수지를 이용 가능하지만 본 실시예에서는 Diaion HP20 흡착수지(Mitsubishi chemical사 제품)를 이용하였다.
Diaion HP20 흡착수지를 충진한 컬럼 흡착크로마토그래피에 상기 증류수로 현탁시킨 추출물을 흡착시킨 후, 증류수를 사용하여 상기 컬럼에서 배당체 불순물을 세척하였고, 상기 물:메탄올 농도의 용매를 사용하여 상기 컬럼에서 코디세핀으로 추정되는 물질을 용리시켰다.
<실험예 1> 곤충으로부터 재배한 동충하초 추출물에서 분리된 코디세핀의 검정
실시예 3에서 분리된 물질이 코디세핀과 동일한 물질인지 확인하기 위하여 푸리에 변환 적외선 분광법(FT-IR: Fourier transform infrared spectroscopy), 핵자기공명법(NMR: nuclear magnetic resonance) 및 질량분광법(MS: mass spectroscopy)을 실시하였다.
푸리에 변환 적외선 분광법(FT-IR)은 Bruker Equinox 55 FT-IR spectrometer를 사용하였고, 최대흡광도 (λmax, H2O)는 260 나노미터 (nm)에서 측정하였으며 분석결과는 IR (KBr) 3330, 3140, 1678, 1608, 1575, 1480, 1422, 1384, 1341, 1298, 1206, 1174, 1092, 831, 717cm-1로 나타났다.
핵자기공명법(NMR)은 Varian UNITY INOVA 500 MHz를 사용하였고 1H-NMR (DMSO-d6)의 분석 결과는 δ : 8.36 (1H, s), 8.17 (1H, s), 7.32 (2H, s), 5.87 (1H, s), 5.67 (1H, d), 4.67 , 4.56 (1H, m), 3.72 (1H, m), 3.55 (1H, dd), 2.35 (1H, m)이며, 13C-NMR (CD3OD)의 측정값은 δ : 156.1, 152.6, 148.9, 139.2, 119.2, 90.9, 80.7, 74.8, 62.8, 34.2이었다.
질량분광법(MS)은 질량분석기(Jeol JMS HX 110/110A)를 이용하여 분자량을 확인한 결과, 코디세핀에 해당하는 251 [M]+, 252 ([M+H]+)의 피크가 검출되었고 분자식은 코디세핀의 분자식인 C10H13N5O3로 동일하게 측정되었다.
푸리에 변환 적외선 분광법, 핵자기공명법 및 질량분광법으로 분석한 결과 곤충으로부터 재배한 동충하초 추출물에서 분리한 물질이 코디세핀과 동일한 물질인 것을 확인할 수 있었다.
<실험예 2> 곤충으로부터 재배한 동충하초 추출물에서 분리된 코디세핀의 측정
실시예 3에서 분리된 코디세핀의 함량분석은 HPLC로 분석하였다. 분리 된 각 분획으로부터 10mg/ml 샘플을 제조하고, 10μl를 HPLC에 주입하였다. 컬럼은 Gemini-NX ODS- 컬럼 (5μm, 10 * 150mm)을 사용하였다. 시스템은 HPLC(Waters 600 Q- 펌프, 996 광 다이오드 어레이 검출기 및 Waters Empower 소프트웨어)를 사용하였고 2.0 ml / min의 유속, 260 nm의 UV에서 측정하였다. 코디세핀의 정량 분석은 표준 곡선을 기준으로 피크 면적으로 결정 하였다. 실험결과, 코디세핀의 HPLC와 UV 스펙트럼의 크로마토그램을 도 1에 나타내었다.
곤충으로부터 재배한 동충하초 추출물에서 분리된 코디세핀 함량을 측정한 결과, 고함량의 코디세핀을 추출하기 위한 최적의 동충하초 배양 온도, 배양 일수 및 최적의 추출방법을 찾을 수 있었다.
곤충배지에 배양된 Cordyceps militaris 동충하초 액체종균을 접종한 후 20℃, 25℃, 30℃, 35℃에서 5일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 35일, 40일, 45일, 50일간 배양한 후, 코디세핀의 함량을 측정한 결과는 도 2 내지 도 25에 나타내었다. 누에 번데기는 30℃에서 45일차에 11392μg Cor/g, 흰점박이 꽃무지 유충은 30℃에서 45일차에 28317μg Cor/g, 갈색 거저리는 30℃에서 35일차에 14381μg Cor/g, 장수풍뎅이 유충은 30℃에서 35일차에 22998μg Cor/g, 벼메뚜기는 30℃에서 40일차에 28490μg Cor/g, 쌍별 귀뚜라미는 30℃에서 50일차에 10740μg Cor/g의 코디세핀 함량이 가장 높게 측정되었다(도 4, 도 8, 도 12, 도 16, 도 20, 도 24).
상기 도 2 내지 도 25에서 알 수 있듯이, 최적의 배양온도는 6 종류의 곤충배지 모두에서 30℃의 온도에서 배양하였을 때가 가장 고함량의 코디세핀을 함유하는 것을 알 수 있었고, 25℃ 내지 35℃의 온도에서 배양했을 때가 20℃에서 배양했을 때보다 고함량의 코디세핀을 함유하는 것을 확인할 수 있었다. 최적의 배양일수는 6가지의 곤충 모두 35 내지 50일차 배양하였을 때가 가장 고함량의 코디세핀을 함유하는 것을 확인할 수 있었고, 10 내지 15일차 배양하였을 때가 그 다음으로 고함량의 코디세핀을 함유하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2에서 제조된 자실체 분말을 100% 증류수와 80% 메탄올로 22 내지 26시간 동안 추출한 후에, 실시예 3에서 물: 메탄올 농도 구배 시스템으로 용매의 농도를 처리하고, Diaion HP-20 칼럼을 이용한 컬럼 흡착크로마토그래피를 실시하여 분리된 코디세핀을 HPLC로 평균 코디세핀의 함량을 측정한 결과는 하기 표 1에 타나내었다.
추출방식과 사용한 용매의 농도에 따른 코디세핀 함량 비교
평균 코디세핀 함량 (%)
컬럼 흡착크로마토그래피
용매 농도		 동충하초 80%
메탄올 추출물		 동충하초 100%
증류수 추출물
100% 물 : 0% 메탄올 3.9 2.4
80% 물 : 20% 메탄올 38.6 33.7
60% 물 : 40% 메탄올 57 63.8
40% 물 : 60% 메탄올 0.3 ­
20% 물 : 80% 메탄올 ­ ­
0% 물 : 100% 메탄올 ­ ­
상기 표 1의 결과에서도 알 수 있듯이, 가장 고함량의 코디세핀을 함유하는 곤충으로부터 재배한 동충하초 추출물의 최적의 추출방법은 100% 증류수로 22 내지 26시간 동안 추출한 후 Diaion HP-20 칼럼을 이용한 컬럼 흡착크로마토그래피에서 40% 메탄올로 용리시키는 것으로 확인되었으며, 코디세핀의 63.8 %가 분리되고 정제되었음을 확인하였다.
이는 기존에 인공배지에서 동충하초를 재배하여 추출하였을 때 20∼40%의 코디세핀 함량을 추출할 수 있는 방법보다 훨씬 고함량의 코디세핀을 추출할 수 있는 수치이다. 또한, 63.8 %의 코디세핀 함량 수치는 통상적으로 93.2 % 순도의 고순도의 코디세핀 제품이 전체 회수율 90 % 이상으로 제조가 가능한 수치이며, 다른 방법들과 비교하여 저비용 및 저에너지 사용으로 Cordyceps militaris 동충하초로부터 코디세핀을 추출하는 매우 효율적인 방법이다.

Claims (5)

  1. 곤충으로부터 재배한 동충하초를 이용하여 코디세핀을 추출하는 방법에 있어서,
    (a) 곤충배지를 준비하는 단계;
    (b) 상기 곤충배지에 Cordyceps militaris를 접종하는 단계;
    (c) 상기 접종 후 25 내지 35℃의 온도, 60 내지 70%의 상대습도에서 10 내지 15일 또는 35 내지 50일 동안 암조건으로 배양하는 단계;
    (d) 상기 배양된 자실체를 수확, 건조 후 분말로 분쇄하는 단계;
    (e) 상기 분쇄된 분말에서 동충하초 추출물을 추출하는 단계; 및
    (f) 상기 추출된 동충하초 추출물을 여과방법으로 여과하여 코디세핀을 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 곤충으로부터 재배한 동충하초를 이용하여 코디세핀을 분리하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 곤충배지는 수분함량을 60 내지 70%로 조정하여 고온, 고압으로 멸균 후 냉각하는 것을 특징으로 하는 곤충으로부터 재배한 동충하초를 이용하여 코디세핀을 추출하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서.
    상기 (d) 단계에서 배양된 자실체를 건조하는 과정은 55 내지 65℃의 온도에서 6.5 내지 7.6%의 수분함량이 될 때까지 오븐에서 건조하는 것을 특징으로 하는 곤충으로부터 재배한 동충하초를 이용하여 코디세핀을 추출하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 (e) 단계에서 동충하초 추출물을 추출하는 과정은 추출 용매로 100% 증류수에 22 내지 26시간 동안 진탕 방치하여 추출하는 것을 특징으로 하는 곤충으로부터 재배한 동충하초를 이용하여 코디세핀을 추출하는 방법.
  5. 제 1항의 방법으로 배양되고 분리된 순도 90 내지 99.9%의 코디세핀.
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