CN109294920A - 一种添加纳米材料诱导雨生红球藻高效积累虾青素的方法 - Google Patents

一种添加纳米材料诱导雨生红球藻高效积累虾青素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种添加纳米材料诱导雨生红球藻高效积累虾青素的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、藻种培养：将处于对数生长期的雨生红球藻接种到BBM培养液中进行藻种培养，并扩培；S2、诱导雨生红球藻积累虾青素：将预先配置的纳米材料储备液、BBM培养液与经步骤S1培养得到的处于对数生长期的雨生红球藻混合培养，得到培养后的雨生红球藻；S3、收集所述培养后的雨生红球藻并从中提取虾青素。在诱导雨生红球藻积累虾青素的培养过程中添加纳米材料能大幅促进雨生红球藻积累虾青素，从而显著提高虾青素生产效率。

Description

一种添加纳米材料诱导雨生红球藻高效积累虾青素的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种添加纳米材料诱导雨生红球藻高效积累虾青素的方法。
背景技术
虾青素(astaxanthin)即3,3′-二羟基-4,4′-二酮基-β,β′-胡萝卜素，为萜烯类不饱和化合物，化学分子式为C40H52O4，分子结构中有两个β-紫罗兰酮环，11个共轭双键。虾青素广泛存在于自然界，如大多数甲壳类动物和鲑科鱼类体内，植物的叶、花、果，以及火烈鸟的羽毛中等。研究表明，虾青素具有极强的抗氧化活性，而且具有增强人体免疫力、抑制肿瘤发生、预防心血管疾病、维护眼睛及中枢神经系统等多种生理功能，因而在食品添加剂、保健品、医药工业、化妆品等方面有广泛的应用。
雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)属于绿藻门，绿藻纲，团藻目，红球藻科，红球藻属，正常条件下藻细胞呈绿色，胁迫环境下细胞积累虾青素呈红色。雨生红球藻主要存在游动细胞和不动孢子两个生活阶段：在环境适合生长的条件下，细胞主要以绿色游动细胞的形式生存，以有丝分裂的方式无性生殖；当环境不适合生长或者受到外界条件胁迫时，游动细胞会停止分裂，鞭毛开始消失，细胞壁明显增厚，进入静止状态，最后从绿色变成红色不动孢子；一旦外界条件适合生长时，厚壁红色孢子会重新变绿，恢复分裂，释放游动细胞。在这种状态下的孢子大小不一，大小变化比较大，直径一般为20～40μm。由于处在胁迫条件下可大量积累虾青素，其含量最高可达细胞干重的4％，因而雨生红球藻已经成为了天然虾青素生产的重要生物资源，有着巨大的商业前景，而利用雨生红球藻生产虾青素则已成为国内外研究的热点。
由于雨生红球藻特殊的生物学性质，其生长繁殖和活性物质的积累明显分为两个截然不同的生理阶段。因此，如何提高营养细胞的生长密度，又如何促使不动细胞快速、大量积累虾青素，是提高虾青素生产效率、降低成本的技术关键。藻细胞生物量和虾青素累积量与培养基、培养条件有关。目前较为常用的虾青素诱导方法包括强光刺激、缺氮培养等，但强光刺激的方式耗能高；缺氮培养的工艺较为复杂，在整个过程需要更换培养基(由含氮更换为缺氮)。
以上背景技术内容的公开仅用于辅助理解本发明的发明构思及技术方案，其并不必然属于本专利申请的现有技术，在没有明确的证据表明上述内容在本专利申请的申请日前已经公开的情况下，上述背景技术不应当用于评价本申请的新颖性和创造性。
发明内容
本发明的主要目的在于克服现有的强光刺激、缺氮培养等方法的缺陷，提出一种添加纳米材料诱导雨生红球藻高效积累虾青素的方法，以较低的能耗和更简单的工艺高效积累虾青素。
本发明为达上述目的所提出的技术方案如下：
一种添加纳米材料诱导雨生红球藻高效积累虾青素的方法，包括以下步骤：
S1、藻种培养：将处于对数生长期的雨生红球藻接种到BBM培养液中进行藻种培养，并扩培；
S2、诱导雨生红球藻积累虾青素：将预先配置的纳米材料储备液、BBM培养液与经步骤S1培养得到的处于对数生长期的雨生红球藻混合培养，得到培养后的雨生红球藻；
S3、收集所述培养后的雨生红球藻并从中提取虾青素。
本发明的上述技术方案，无需采用强光、无需缺氮培养，仅需加入纳米材料就能以较低的能耗和更简单的流程诱导雨生红球藻高效地积累虾青素。一方面，纳米材料接触雨生红球藻可使藻细胞产生机械损伤，如纳米切割等，从而加速雨生红球藻中虾青素的诱导；另一方面，纳米材料具有很强的吸附性，易于吸附在雨生红球藻表面，影响雨生红球藻的代谢通路等，使雨生红球藻更易处于胁迫环境从而积累虾青素；再者，纳米材料可促使雨生红球藻产生氧化应激，从而促进虾青素的积累。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式对本发明作进一步说明。
本发明的具体实施方式提供一种添加纳米材料诱导雨生红球藻高效积累虾青素的方法，包括以下步骤S1至S3：
S1、藻种培养：将处于对数生长期的雨生红球藻接种到BBM培养液中进行藻种培养，并扩培。BBM培养液优选要采用无菌的，将处于对数生长期的雨生红球藻加入到装有BBM培养液的瓶中后采用含0.22μm滤膜的封口膜包裹瓶口，进行藻种培养，在此期间，每隔数天(7天为优)就接种一次进行扩培。
S2、诱导雨生红球藻积累虾青素：将预先配置的纳米材料储备液、BBM培养液与经步骤S1培养得到的处于对数生长期的雨生红球藻混合培养，得到培养后的雨生红球藻。其中，纳米材料储备液是用纳米材料与BBM培养液混合配置的混合液，浓度为0.25～1.0g/L；优选地，本发明所采用的纳米材料是碳量子点、富勒烯或者纳米二氧化钛。在纳米材料储备液、BBM培养液与经步骤S1培养得到的处于对数生长期的雨生红球藻混合得到的终溶液中，纳米材料储备液的浓度为1～100mg/L，雨生红球藻的藻细胞密度为105±104个/mL，混合培养的时间为20天。
S3、收集所述培养后的雨生红球藻并从中提取虾青素。
在进行步骤S2之前，需要预先配置好纳米材料储备液备用。在本发明的一种实施例中，以碳量子点作为纳米材料为例进行说明。首先以柠檬酸为碳源、乙二胺为钝化剂，采用水热合成法制备所述碳量子点备用；再用碳量子点与BBM培养液混合，按照所需的浓度(0.25～1.0g/L)配置成碳量子点储备液。
在一具体的实施例中，碳量子点的制备过程包括：按摩尔比为1:1分别称取柠檬酸固体粉末和乙二胺溶液，再准备足量的蒸馏水；将柠檬酸粉末与蒸馏水混合，再将乙二胺溶液加入到前二者的混合液中，并用玻璃棒搅拌均匀，再把三者的混合溶液转移至聚四氟乙烯内衬的高压釜中；然后将高压釜放入鼓风干燥箱加热至200℃，并持续5小时；加热完成后，让反应釜自然冷却至室温，便得到棕褐色悬浊液产物。此时，再把得到的悬浊液产物经高速离心(12000r/min)10min后，取其上层清液利用截留分子量为1000的透析膜透析24h，期间每隔6h换一次蒸馏水，以去除清液中的小分子及少量的杂质，最终得到呈黄褐色透明的碳量子点溶液，最后经真空冷冻干燥后即得到所需的固体碳量子点，密封常温保存待用。
另一方面，本发明所用的富勒烯、纳米二氧化钛纯度均高于99.5wt％。采用BBM培养基配制的富勒烯/纳米二氧化钛储备液，需进行超声分散。
下面通过具体的实施例来对本发明前述的诱导雨生红球藻高效积累虾青素的方法及其有益效果进行说明。
实施例1
步骤1、藻种培养：将处于对数生长期的雨生红球藻(797菌株)接种到装有新鲜无菌的BBM培养液的三角瓶中，用含0.22μm滤膜的封口膜包裹瓶口。接种后置于照度为1500Lx(光暗比为12h:12h)、温度为23℃的环境中静置培养。每七天接种一次进行扩培；
步骤2、诱导雨生红球藻积累虾青素：于250mL锥形瓶中将步骤1培养得到的处于对数生长期的雨生红球藻、1g/L的无菌纳米材料储备液(用BBM培养基配置)以及无菌BBM培养基混合，混合液终体积为100mL，纳米材料储备液终浓度为1mg/L，藻细胞终密度达105±104个/mL。然后将上述加了无菌纳米材料储备液的雨生红球藻培养液和空白对照组(指的是没有加纳米材料储备液，其余条件基本相同的对照组)的雨生红球藻培养液同时放在照度为1500±100Lx(光照周期为24h)、温度为23℃的环境中静置培养。
实施例2
步骤1、与实施例1的步骤1相同；
步骤2、诱导雨生红球藻积累虾青素：于250mL锥形瓶中将步骤1培养得到的处于对数生长期的雨生红球藻、1g/L的无菌纳米材料储备液(用BBM培养基配置)以及无菌BBM培养基混合，混合液终体积为100mL，纳米材料储备液终浓度为5mg/L，藻细胞终密度达105±104个/mL。然后将上述加了无菌纳米材料储备液的雨生红球藻培养液和空白对照组的雨生红球藻培养液同时放在照度为1500±100Lx(光照周期为24h)、温度为23℃的环境中静置培养。
实施例3
步骤1、与实施例1的步骤1相同；
步骤2、诱导雨生红球藻积累虾青素：于250mL锥形瓶中将步骤1培养得到的处于对数生长期的雨生红球藻、1g/L的无菌纳米材料储备液(用BBM培养基配置)以及无菌BBM培养基混合，混合液终体积为100mL，纳米材料储备液终浓度为10mg/L，藻细胞终密度达105±104个/mL。然后将上述加了无菌纳米材料储备液的雨生红球藻培养液和空白对照组的雨生红球藻培养液同时放在照度为1500±100Lx(光照周期为24h)、温度为23℃的环境中静置培养。
实施例4
步骤1、与实施例1的步骤1相同；
步骤2、诱导雨生红球藻积累虾青素：于250mL锥形瓶中将步骤1培养得到的处于对数生长期的雨生红球藻、1g/L的无菌纳米材料储备液(用BBM培养基配置)以及无菌BBM培养基混合，混合液终体积为100mL，纳米材料终浓度为50mg/L，藻细胞终密度达105±104个/mL。然后将上述加了无菌纳米材料储备液的雨生红球藻培养液和空白对照组的雨生红球藻培养液同时放在照度为1500±100Lx(光照周期为24h)、温度为23℃的环境中静置培养。
上述4个实施例中所用的纳米材料以碳量子点为例。采用以下方法对前述4个实施例的8组(4个采用本发明方法的实验组和4个与之对应的空白对照组)雨生红球藻培养液定期用蔡司显微镜进行观察，具体是每天取培养中的少量藻液样品在显微镜下观察雨生红球藻的形态和颜色变化，并分别于诱导培养期内的第4、8、12、20天测定各组的藻细胞数、虾青素含量，测定步骤具体如下：
1)取各实验组和各空白对照组的藻液，于4℃、10000rpm离心10分钟，在藻细胞沉淀中加入含5％(w/v)KOH溶液的30％(v/v)甲醇溶液，70℃水浴10分钟除去叶绿素后，10000rpm离心10分钟收集沉淀；
2)向装沉淀的离心管中加入5～8滴乙酸和5mLDMSO(二甲基亚砜)的混合物，摇匀，70℃水浴10分钟后，将混合物10000rpm离心10分钟，并收集上清液，反复抽提多次至藻体发白；
3)取上清液于490nm下测定吸光值；
4)按公式C(mg/L)＝4.5×A490×Va/Vb测定各组上清液中单位体积虾青素含量，其中A490是步骤3)提取的上清液在490nm处的吸光值，Va是步骤3)提取的上清液的体积，Vb是步骤1)中所取的藻液体积；
5)使用血球计数板测定单位体积藻细胞个数，按公式C(mg/cell)＝C(mg/L)/n测定各组上清液中单位细胞虾青素含量，其中n为单位体积藻细胞个数。
结果如下：
①以添加浓度为50mg/L纳米材料CQDs组(即实施例4)为例，培养至第20天时纳米材料组雨生红球藻虾青素的单位体积产量和单位细胞产量分别为6.48mg/L、2.05*10-5mg/cell，分别是空白组产量的1.62倍、1.98倍；
②以添加浓度为5mg/L纳米材料CQDs组(实施例2)为例，培养至第20天时纳米材料组雨生红球藻虾青素单位体积产量为6.02mg/L，是空白组产量的1.53倍；
③以添加浓度为50mg/L纳米材料CQDs组(实施例4)为例，培养至第20天时纳米材料组雨生红球藻虾青素单位体积平均日产量为0.31mg/(L·d)，是空白组日产量最低(培养至第4天)时的3.44倍；
④添加了不同浓度纳米材料的实验组，培养至第20天时雨生红球藻虾青素单位体积产量4.76～6.48mg/L，是空白对照组产量的1.19～1.62倍；单位细胞产量为1.27*10-5～2.05*10-5mg/cell，是空白对照组的1.22～1.98倍。
可见，在诱导雨生红球藻积累虾青素的培养过程中添加纳米材料能大幅促进雨生红球藻积累虾青素，从而显著提高虾青素生产效率。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干等同替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (11)

1.一种添加纳米材料诱导雨生红球藻高效积累虾青素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、藻种培养：将处于对数生长期的雨生红球藻接种到BBM培养液中进行藻种培养，并扩培；
S2、诱导雨生红球藻积累虾青素：将预先配置的纳米材料储备液、BBM培养液与经步骤S1培养得到的处于对数生长期的雨生红球藻混合培养，得到培养后的雨生红球藻；
S3、收集所述培养后的雨生红球藻并从中提取虾青素。
2.如权利要求1所述的添加纳米材料诱导雨生红球藻高效积累虾青素的方法，其特征在于：所述纳米材料储备液是纳米材料与BBM培养液混合的混合液。
3.如权利要求2所述的添加纳米材料诱导雨生红球藻高效积累虾青素的方法，其特征在于：所用的纳米材料为碳量子点、富勒烯或者纳米二氧化钛。
4.如权利要求3所述的添加纳米材料诱导雨生红球藻高效积累虾青素的方法，其特征在于：所述预先配置的纳米材料储备液的浓度为0.25～1.0g/L。
5.如权利要求4所述的添加纳米材料诱导雨生红球藻高效积累虾青素的方法，其特征在于：在纳米材料储备液、BBM培养液与经步骤S1培养得到的处于对数生长期的雨生红球藻混合得到的终溶液中，所述纳米材料储备液的浓度为1～100mg/L，雨生红球藻的藻细胞密度为105±104个/mL，混合培养的时间为20天。
6.如权利要求1所述的添加纳米材料诱导雨生红球藻高效积累虾青素的方法，其特征在于：步骤S2在一照度为1500±100Lx、光照周期为24h的室温环境中进行。
7.如权利要求1至6任一项所述的添加纳米材料诱导雨生红球藻高效积累虾青素的方法，其特征在于：步骤S1在一照度为1500±100Lx、光照周期为12h的室温环境中进行。
8.如权利要求1所述的添加纳米材料诱导雨生红球藻高效积累虾青素的方法，其特征在于：雨生红球藻采用797菌株。
9.如权利要求3所述的添加纳米材料诱导雨生红球藻高效积累虾青素的方法，其特征在于，还包括：以柠檬酸为碳源、乙二胺为钝化剂，采用水热合成法制备所述碳量子点。
10.如权利要求3所述的添加纳米材料诱导雨生红球藻高效积累虾青素的方法，其特征在于：所用的纳米二氧化钛为粉末状，纯度大于99.5％。
11.如权利要求3所述的添加纳米材料诱导雨生红球藻高效积累虾青素的方法，其特征在于：所用的富勒烯为粉末状，纯度大于99.5％。
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