CN113913484A - 一种提高纳他霉素发酵产量的方法及其发酵培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种提高纳他霉素发酵产量的方法及其发酵培养基。包括步骤如下：在纳他霉素发酵0～24h内，按照每升发酵培养基10～50mg，将纳米材料添加至发酵培养基中继续发酵，得纳他霉素；所述的纳米材料为CuO纳米材料、Al2O3纳米材料或多壁碳纳米管；所述纳他霉素发酵的总时间为100～150h。本发明通过在纳他霉素发酵0～24h内，向发酵培养基中添加纳米材料，发现纳米材料可以显著提高生产菌株纳他霉素的产量，并且进一步发现CuO纳米材料、Al2O3纳米材料和多壁碳纳米管对纳他霉素发酵产量的提高作用最明显,使得纳他霉素发酵产量分别提高了1.41倍、2.73倍和1.35倍。

Description

一种提高纳他霉素发酵产量的方法及其发酵培养基
技术领域
本发明涉及一种提高纳他霉素发酵产量的方法及其发酵培养基，属于纳他霉素制备技术领域。
技术背景
纳他霉素(Natamycin)(又称匹马霉素，Pimaricin)是一种天然、广谱、高效的多烯大环内酯类抗真菌剂，其分子式为C33H47NOl3，分子量为665.75，熔点为280℃。纳他霉素的分子结构中含有一个由26个碳原子组成的内酯环骨架结构，其中4个共扼双键形成了多烯发色团，在内酯环外还连接了一个海藻氨基糖。纳他霉素成品为白色或奶油色无嗅、无味的结晶粉末，有三分子水以结晶水的形式结合于纳他霉素分子之上。纳他霉素分子中含有一个碱性基团与一个酸性基团，等电点为6.5。由于其性质稳定、低剂量、高效率、安全性的特点，不仅在食品原料保鲜、成品防腐方面具有较好的抗菌效果，而且在医药、青储饲料、粮储、家禽养殖等方面被广泛应用[Aparicio JF,Barreales EG,Payero TD,Vicente CM,dePedrol A,Santos-Aberturas J.Biotechnological production and application ofthe antibiotic pimaricin:biosynthesis and its regulation.Applied Microbiologyand Biotechnology,2016,100(1):61-78]。
纳米材料是指天然或人工合成的，三维尺度中至少有一维处于纳米尺度(1～100nm)或由它们作为基本单元构成的材料。纳米材料的小尺寸效应、机械强度、表面效应、量子效应和反应活性等，已经被广泛的应用于催化、电子、生物医药、环境和复合材料等领域。传统意义上，纳米材料被认为对微生物具有毒性。[Liu X,Tang J,Wang L,etal.Mechanisms of oxidative stress caused by CuO nanoparticles to membranes ofthe bacterium Streptomyces coelicolor M145.Ecotoxicol Environ Saf.2018；158:123-130]。但是，越来越多的研究表明，纳米材料对细菌中抗生素的产生具有显著提高作用。
然而，目前在纳他霉素发酵生产工艺中，纳米材料这一具有重大潜力的诱导因子尚未有应用，因此具有极大的开发价值。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种提高纳他霉素发酵产量的方法及其发酵培养基。本发明人首次发现纳米材料可以促进提高纳他霉素的发酵产量。
本发明的技术方案如下：
一种提高纳他霉素发酵产量的方法，步骤如下：
在纳他霉素发酵0～24h内，按照每升发酵培养基10～50mg，将纳米材料添加至发酵培养基中继续发酵，得纳他霉素；
所述的纳米材料为CuO纳米材料、Al2O3纳米材料或多壁碳纳米管；所述纳他霉素发酵的总时间为100～150h。所述CuO纳米材料、Al2O3纳米材料为纳米级别的CuO、Al2O3单质。
根据本发明优选的，所述提高纳他霉素发酵产量的方法，步骤如下：
在发酵培养基中添加纳米材料，在115～121℃高压灭菌20～30min后，将活化好的纳他霉素种子液按5～10％接种量接种至纳他霉素发酵培养基中，发酵100～150h，得纳他霉素；
所述的纳米材料为CuO纳米材料、Al2O3纳米材料或多壁碳纳米管；所述纳他霉素发酵的总时间为100～150h。
根据本发明优选的，所述的纳米材料为多壁碳纳米管；所述发酵培养基为：大豆蛋白胨10～30g/L，酵母提取物4～5g/L，氯化钠1～3g/L，结晶硫酸镁0.5～1.5g/L，葡萄糖50～70g/L，pH7～8。
根据本发明优选的，所述的CuO纳米材料纯度为99.5％，形状为球形，直径为35～45nm；所述Al2O3纳米材料纯度为99.9％，形状为球形，直径为8～12nm；所述多壁碳纳米管纯度为95％，直径为3-5nm，长度为40～50μm。
另一方面，本发明还提供一种提高纳他霉素发酵产量的培养基，配方为：大豆蛋白胨10～30g/L，酵母提取物4～5g/L，氯化钠1～3g/L，结晶硫酸镁0.5～1.5g/L，葡萄糖50～70g/L，纳米材料10～50mg/L，pH7～8；
所述的纳米材料为CuO纳米材料、Al2O3纳米材料或多壁碳纳米管。所述培养基可以用于发酵培养纳他霉素发酵生产所用菌株。
进一步优选的，所述提高纳他霉素发酵产量的培养基的配方为：大豆蛋白胨20g/L，酵母提取物4.5g/L，氯化钠2g/L，结晶硫酸镁2g/L，葡萄糖60g/L，多壁碳纳米管20mg/L，pH7.5。所述培养基可以用于发酵培养纳他霉素发酵生产所用菌株。
根据本发明优选的，所述纳他霉素发酵的总时间为120h。
一种提高纳他霉素发酵产量的方法，具体包括步骤如下：
(1)在发酵培养基中，按照终浓度为10～50mg/L添加纳米材料，115～121℃高压灭菌20～30min高压灭菌后，得到提高纳他霉素发酵产量的发酵培养基；
(2)无菌条件下，取纳他霉素发酵生产所用菌株的孢子涂布于琼脂斜面培养基中活化，然后将活化好的孢子刮入种子培养基中进行摇床培养，得种子液；
(3)将步骤(2)中的种子液按5～10％的接种量接入步骤(1)配制的发酵培养基中，发酵120h～150h，将发酵液经9000～11000rpm离心12～18min后，得纳他霉素。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述发酵培养基的配方为：大豆蛋白胨10～30g/L，酵母提取物4～5g/L，氯化钠1～3g/L，结晶硫酸镁0.5～1.5g/L，葡萄糖50～70g/L，pH 7～8。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述琼脂斜面培养基的配方为：葡萄糖5.0～15.0g/L，麦芽浸粉1.0～5.0g/L，酵母浸膏1.0～5.0g/L，蛋白胨3.0～10.0g/L，琼脂粉10.0～20.0g/L，pH 7.0～7.2；所述种子培养基的配方为：葡萄糖10.0～30.0g/L，酵母浸膏3.0～10.0g/L，黄豆饼粉30.0～50.0g/L，pH 7.0～7.2。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述摇床培养的条件为转速150～200rpm，温度26～30℃，培养时间36～48h。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述纳他霉素发酵生产所用菌株为褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)、纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalensis)、恰塔努加链霉菌(Streptomyces chattanoogensis)或利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)。
本发明中未详细说明的实验步骤，尤其是纳他霉素发酵过程，均按照本领域现有技术记载的方法进行。
本发明包含以下有益效果：
1、本发明通过在纳他霉素发酵0～24h内，向发酵培养基中添加纳米材料，发现纳米材料可以显著提高生产菌株纳他霉素的产量，并且进一步发现CuO纳米材料、Al2O3纳米材料和多壁碳纳米管对纳他霉素发酵产量的提高作用最明显。CuO纳米材料、Al2O3纳米材料和多壁碳纳米管在链霉菌中能够发挥促进次级代谢产物尤其是抗生素的产量，其影响机制是通过纳米材料释放Cu2+、Al3+或小分子碳引起胞内活性氧(ROS)水平升高，引发氧化应激反应，刺激次级代谢产物的合成，使得纳他霉素发酵产量分别提高了1.41倍、2.73倍和1.35倍。同时由于纳米材料在水-甲醇环境中不溶解，因此不需要添加额外步骤，仅仅通过充分离心，就能够达到将发酵结束后的纳他霉素发酵液、菌体和纳米材料分离的效果，得到纳他霉素发酵产物。
2、本发明在实验中发现在发酵前将纳米材料添加至培养基中，对纳他霉素发酵产量的提高作用最明显，因此本发明进一步对纳他霉素发酵培养基进行了改良，提供一种提高纳他霉素发酵产量的发酵培养基，可以广泛的应用于纳他霉素的生产中，提高纳他霉素的产量至5.52g/L，显著高于未添加纳米材料组的2.02g/L，纳他霉素产量提高达到了276.19％，产生了极大的经济效益。
具体实施方式
以下实施例和试验例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明中所涉及材料均为普通市售产品。
琼脂斜面培养基的配制：葡萄糖10g/L，麦芽浸粉3g/L，酵母浸膏3g/L，蛋白胨5g/L，琼脂粉15g/L，pH 7.0，121℃×20min灭菌，冷却后备用。
摇瓶种子培养基的配制：葡萄糖20g/L，酵母浸膏5g/L，黄豆饼粉40g/L，pH 7.2，121℃×20min灭菌，冷却后备用。
发酵培养基的配制：大豆蛋白胨20g/L，酵母提取物4.5g/L，氯化钠2g/L，结晶硫酸镁1g/L，葡萄糖60g/L，pH7.5；121℃×20min灭菌，冷却后备用。
pH的测定：利用梅特勒pH计进行直接测定。
实施例1
一种提高纳他霉素发酵产量的方法，具体包括步骤如下：
(1)在发酵培养基中，按照终浓度为10mg/L添加纳米材料，121℃高压灭菌20min高压灭菌；其中，纳米材料添加情况为无添加(对照组)、CuO纳米材料(实验组1)、Al2O3纳米材料(实验组2)、多壁碳纳米管(实验组3)、镍纳米材料(实验组4)、石墨纳米材料(实验组5)、ZnO纳米材料(实验组6)，每个实验组6瓶；
(2)无菌条件下，取褐黄孢链霉菌的孢子涂布于琼脂斜面培养基中活化，然后将活化好的孢子刮入种子培养基中，在30℃下，以200rpm的转速在摇床中振荡培养24h，得种子液；
(3)将步骤(2)中的种子液分别按5％的接种量接入步骤(1)配制的发酵培养基中，发酵120h，将发酵液经10000rpm离心15min后，得纳他霉素。
测定以上7组的纳他霉素含量，结果如表1所示。
纳他霉素含量测定方法按照国标GB 25532-2010中规定的方法进行。
表1不同纳米材料对纳他霉素产量的影响
组别 纳米材料 添加量 纳他霉素产量(g/L)
对照组 0 10mg/L 2.02±0.107
实验组1 CuO 10mg/L 2.84±0.118
实验组2 Al<sub>2</sub>O<sub>3</sub> 10mg/L 2.73±0.265
实验组3 多壁碳纳米管 10mg/L 3.52±0.19
实验组4 镍 10mg/L 0.99±0.13
实验组5 石墨 10mg/L 1.836±0.25
实验组6 ZnO 10mg/L 2.04±0.235
从表1的结果可以看出，向摇瓶发酵培养基中加入10mg/L的CuO纳米材料(实验组1)、Al2O3纳米材料(实验组2)、多壁碳纳米管材料(实验组3)能够有效地提高纳他霉素的产量。实验组1～3与对照组相比，纳他霉素产量提高了35.15～74.25％。实验组1与对照组相比，纳他霉素产量提高了40.59％。实验组2与对照组相比，纳他霉素产量提高了35.15％。实验组3对照组相比，纳他霉素产量提高了74.25％。添加镍纳米材料(实验组4)、石墨纳米材料(实验组5)、ZnO纳米材料(实验组6)则对纳他霉素的提高没有作用，实验组4对照组相比，纳他霉素产量降低了104.04％。实验组5对照组相比，纳他霉素产量降低了10.02％。实验组6对照组相比，纳他霉素产量无变化。根据以上的数据结果，在本发明此后的实施例中纳米材料优选为多壁碳纳米管材料。
实施例2
一种提高纳他霉素发酵产量的方法，具体包括步骤如下：
(1)在发酵培养基中添加多壁碳纳米管，121℃高压灭菌20min高压灭菌，得到提高纳他霉素发酵产量的发酵培养基；
其中多壁碳纳米管材料添加量为：0mg/L(对照组)、5mg/L(实验组1)、10mg/L(实验组2)、20mg/L(实验组3)、30mg/L(实验组4)、40mg/L(实验组5)和50mg/L(实验组6)，每个实验组6瓶；
(2)无菌条件下，取褐黄孢链霉菌的孢子涂布于琼脂斜面培养基中活化，然后将活化好的孢子刮入种子培养基中，在30℃下，以200rpm的转速在摇床中振荡培养24h，得种子液；
(3)将步骤(2)中的种子液分别按5％的接种量接入步骤(1)配制的发酵培养基中，发酵120h，将发酵液经10000rpm离心15min后，得纳他霉素。
测定以上7组的纳他霉素含量，结果如表2所示。
纳他霉素含量测定方法按照国标GB 25532-2010中规定的方法进行。
表2不同多壁碳纳米管添加量对纳他霉素产量的影响
组别 添加时间 添加量 纳他霉素产量(g/L)
对照组 0h 0mg/L 2.02±0.121
实验组1 0h 5mg/L 2.154±0.118
实验组2 0h 10mg/L 3.49±0.105
实验组3 0h 20mg/L 5.52±0.137
实验组4 0h 30mg/L 2.91±0.082
实验组5 0h 40mg/L 2.52±0.086
实验组6 0h 50mg/L 0.963±0.143
从表2的结果可以看出，向摇瓶发酵培养基中加入多壁碳纳米管能够有效地提高纳他霉素的产量。添加5mg/L多壁碳纳米管的实验组1与对照组相比，纳他霉素产量没有显著提高。添加10～40mg/L多壁碳纳米管的实验组2～5，纳他霉素产量提高了24.75～173.3％，其中添加20mg/L多壁碳纳米管的实验组3，纳他霉素产量最高。当多壁碳纳米管添加量达到50mg/L，纳他霉素产量则显著降低。根据以上的数据结果，在本发明此后的实施例中多壁碳纳米管的添加量为20mg/L。
实施例3
一种提高纳他霉素发酵产量的方法，具体包括步骤如下：
(1)无菌条件下，取褐黄孢链霉菌的孢子涂布于琼脂斜面培养基中活化，然后将活化好的孢子刮入种子培养基中，在30℃下，以200rpm的转速在摇床中振荡培养24h，得种子液；
(2)将步骤(2)中的种子液分别按5％的接种量接入的发酵培养基中，在发酵过程中向发酵培养基中按照终浓度为20mg/L添加多壁碳纳米管，然后继续发酵，发酵总时间为120h，将发酵液经10000rpm离心15min后，得纳他霉素。
其中，多壁碳纳米管添加时机分别为：不添加(对照组)、0h(实验组1)、24h(实验组2)、48h(实验组3)、72h(实验组4)和96h(实验组5)。
测定以上6组的纳他霉素含量，结果如表3所示。
纳他霉素含量测定方法按照国标GB 25532-2010中规定的方法进行。
表3多壁碳纳米管添加时间对纳他霉素产量的影响
组别 添加时间 添加量 纳他霉素产量(g/L)
对照组 / 0mg/L 2.04±0.154
实验组1 0h 20mg/L 5.50±0.24
实验组2 24h 20mg/L 4.43±0.167
实验组3 48h 20mg/L 2.06±0.213
实验组4 72h 20mg/L 2.39±0.206
实验组5 96h 20mg/L 2.26±0.158
从表3的结果可以看出，在不同发酵时间点，向摇瓶发酵培养基中加入20mg/L多壁碳纳米管，对纳他霉素产量的影响不同。发酵开始前24h内，添加20mg/L多壁碳纳米管的对照组，纳他霉素产量提高；其中最高产量为发酵0h添加。当发酵进行至48h后，添加多壁碳纳米管，对纳他霉素的最终发酵产量，影响不大。根据以上的数据结果，在本发明此后的实施例中多壁碳纳米管的添加时间优选为发酵开始前。

Claims (10)

1.一种提高纳他霉素发酵产量的方法，其特征在于，包括步骤如下：
在纳他霉素发酵0～24h内，按照每升发酵培养基10～50mg，将纳米材料添加至发酵培养基中继续发酵，得纳他霉素；
所述的纳米材料为CuO纳米材料、Al2O3纳米材料或多壁碳纳米管；所述纳他霉素发酵的总时间为100～150h。
2.如权利要求1所述的提高纳他霉素发酵产量的方法，其特征在于，包括步骤如下：
在发酵培养基中添加纳米材料，在115～121℃高压灭菌20～30min后，将活化好的纳他霉素种子液按5～10％接种量接种至纳他霉素发酵培养基中，发酵100～150h，得纳他霉素；
所述的纳米材料为CuO纳米材料、Al2O3纳米材料或多壁碳纳米管。
3.如权利要求1所述的提高纳他霉素发酵产量的方法，其特征在于，所述的纳米材料为多壁碳纳米管；所述发酵培养基为：大豆蛋白胨10～30g/L，酵母提取物4～5g/L，氯化钠1～3g/L，结晶硫酸镁0.5～1.5g/L，葡萄糖50～70g/L，pH7～8。
4.如权利要求1所述的提高纳他霉素发酵产量的方法，其特征在于，所述的CuO纳米材料纯度为99.5％，形状为球形，直径为35～45nm；所述Al2O3纳米材料纯度为99.9％，形状为球形，直径为8～12nm；所述多壁碳纳米管纯度为95％，直径为3-5nm，长度为40～50μm。
5.如权利要求1所述的提高纳他霉素发酵产量的方法，其特征在于，所述纳他霉素发酵的总时间为120h。
6.一种提高纳他霉素发酵产量的培养基，其特征在于，所述培养基的配方为：大豆蛋白胨10～30g/L，酵母提取物4～5g/L，氯化钠1～3g/L，结晶硫酸镁0.5～1.5g/L，葡萄糖50～70g/L，纳米材料10～50mg/L，pH7～8；
所述的纳米材料为CuO纳米材料、Al2O3纳米材料或多壁碳纳米管。
7.如权利要求6所述的提高纳他霉素发酵产量的培养基，其特征在于，所述培养基的配方为：大豆蛋白胨20g/L，酵母提取物4.5g/L，氯化钠2g/L，结晶硫酸镁2g/L，葡萄糖60g/L，多壁碳纳米管20mg/L，pH7.5。
8.如权利要求1所述的提高纳他霉素发酵产量的方法，其特征在于，具体包括步骤如下：
(1)在发酵培养基中，按照终浓度为10～50mg/L添加纳米材料，115～121℃高压灭菌20～30min高压灭菌后，得到提高纳他霉素发酵产量的发酵培养基；
(2)无菌条件下，取纳他霉素发酵生产所用菌株的孢子涂布于琼脂斜面培养基中活化，然后将活化好的孢子刮入种子培养基中进行摇床培养，得种子液；
(3)将步骤(2)中的种子液按5～10％的接种量接入步骤(1)配制的发酵培养基中，发酵120h～150h，将发酵液经9000～11000rpm离心12～18min后，得纳他霉素。
9.如权利要求8所述的提高纳他霉素发酵产量的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述琼脂斜面培养基的配方为：葡萄糖5.0～15.0g/L，麦芽浸粉1.0～5.0g/L，酵母浸膏1.0～5.0g/L，蛋白胨3.0～10.0g/L，琼脂粉10.0～20.0g/L，pH 7.0～7.2；所述种子培养基的配方为：葡萄糖10.0～30.0g/L，酵母浸膏3.0～10.0g/L，黄豆饼粉30.0～50.0g/L，pH 7.0～7.2。
10.如权利要求8所述的提高纳他霉素发酵产量的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述摇床培养的条件为转速150～200rpm，温度26～30℃，培养时间36～48h；所述纳他霉素发酵生产所用菌株为褐黄孢链霉菌、纳塔尔链霉菌、恰塔努加链霉菌或利迪链霉菌。
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