CN101020919A - 一种利用环糊精的甾醇生物转化方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用环糊精的甾醇生物转化方法及其应用，本发明属于甾醇生物转化技术领域。具体涉及利用环糊精及其衍生物的甾醇生物转化方法及其应用。本发明提供一种利用环糊精及其衍生物的甾醇生物转化方法及应用。采用在转化系统中按比例添加环糊精或其衍生物或使底物与环糊精或其衍生物按一定比例形成包结物的方法，使转化更易进行。本发明方法特别适用于疏水性化合物的微生物转化，能够有效提高反应底物在水溶液中的溶解度，提高底物的利用率和反应速率，并在一定程度上解除底物和产物抑制，提高产物的转化率。采用本发明底物浓度为3～20g/L时，转化周期缩短为3～4d，对应的转化率为50％～95％，具有较好的工业应用价值。

Description

一种利用环糊精的甾醇生物转化方法及其应用

技术领域

本发明属于甾醇生物转化技术领域。具体涉及利用环糊精及其衍生物的甾醇生物转化方法及其应用。

背景技术

甾醇是环戊烷多氢菲为骨架(又称甾核)的一种物质，在自然界中以游离态和结合态形式存在。外观呈白色至类白色结晶性粉末。甾醇可分为动物性甾醇，植物性甾醇和微生物甾醇等三大类。动物性甾醇以胆固醇为主，植物性甾醇主要为谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇等，存在于植物种子中。

世界上合成甾体药物的原料80％以上是将甾醇侧链降解获得雄甾-4-烯-3，17-二酮(AD)和雄甾1，4-烯-3，17-二酮(ADD)，微生物转化甾醇后得到的AD和ADD最为重要，对4-AD和ADD的活性部位进行改造，可以合成出多种甾体药物。降解侧链有化学合成法、微生物转化法和酶转化法。微生物转化法因甾醇不溶于水，与微生物细胞内产生的生物酶较难有效接触，因而底物利用率低，反应速率低。袁东超等人2003年发表于天津轻工业学院学报第四期的文章“分枝杆菌降解大豆甾醇侧链的发酵研究”，该文章对分枝杆菌(Mycoba cterium sp.)JY-1降解大豆甾醇(BS)侧链至4-烯-雄甾-3，17-二酮(4-AD)和1，4-二烯-雄甾-3，17-二酮(ADD)的培养基组成、种子培养时间、通气量、投料方式及时间等发酵条件进行了研究，投料浓度为0.3％，但转化率最高不超过50％。

中国专利03142115.6公开了雄甾-1，4-双烯-3，17-双酮生物转化浊点系统的优化方法，该发明采用非离子表面活性剂Triton X-100和Triton X-114，底物胆固醇的浓度为0.5-2.0g/100ml，微生物转化时间5-9天。菌种采用分枝杆菌Mycobacterium sp NRRLB-3683对胆固醇的边链进行切除。张裕卿等人2006发表于微生物学通报第二期杂志上的文章“植物甾醇微生物转化制备甾体药物中间体的研究进展”报道了诺卡氏菌、分枝杆菌、节杆菌和假单胞杆菌等微生物都能将甾醇类化合物作为碳源利用，而使甾醇降解。其中分枝杆菌应用最为广泛。其中包括采用NRRL B-3805处理甾醇得到AD和ADD。申请人阿克佐诺贝尔公司申请的中国专利申请号为03804973.2，名称为将植物甾醇发酵制备雄二烯二酮的方法专利，该专利将植物甾醇组合物发酵以制备雄烯二酮(雄-4-烯-3，17-二酮)和随后的雄二烯二酮(雄-1，4-二烯-3，1-二酮)的方法，其包括：在第一营养培养基中增殖分枝杆菌属的微生物培养物；将微生物培养物和植物甾醇组合物在生物反应器中放置足够的时间以将组合物基本上转化为雄烯二酮(“AD溶液”)；在第二营养培养基中增殖镰孢属的真菌培养物；将1)镰孢属物种或2)真菌培养物培养基中的一种或多种注入生物反应器中，反应足够的时间以将AD溶液转化为雄二烯二酮。

微生物转化甾醇等疏水性化合物常受到一些因素的严重制约：底物在水中的溶解度很小，限制了其生物利用度，产物/底物对微生物具有抑制作用，生物转化时间长，转化效率低等缺点。

环糊精是从淀粉得到的六个以上D-吡喃葡萄糖单元以alpha-1，4-糖苷键连结的具有环状疏水圆锥型结构(右上旋转的环糊精模型)的低聚糖非还原性化合物系列。在这个环糊精系列中，它们的命名基于环中葡萄糖基的数量，以6个D-吡喃葡萄糖单元组成的环状糊精，称为α-环糊精(alpha-CD)，以此类推，7个的称为β-环糊精(beta-CD)，8个的称为γ-环糊精(gamma-CD)。由于环糊精的外部亲水而内腔疏水，因而它能够像酶一样提供一个疏水的结合部位，作为主体包结各种适当的客体，如有机分子、无机离子以及气体分子等。这种选择性的包结作用即通常所说的分子识别，其结果是形成主客体包结物。在α-、β-、γ-CD基础之上，对其进行修饰如酯化、醚化，烷基化、羟基化得到环糊精衍生物。主要的衍生物有羟丙基、甲基及磺丁基醚-β-环糊精等。这些基团的引入，并不影响中央空穴对客体分子的容纳能力，但能够改善环糊精的某些理化性质和包结能力。环糊精通过改性，可提高包结物或超分子复合体在水中的溶解度，构筑立体几何关系，形成特殊的手性位点和弱作用力模型，这大大扩展了环糊精的应用领域。

如何有效利用环糊精及其衍生物的特性提高甾醇的生物转化效率是一个值得探索和研究的课题。这方面的研究对于高效率获得甾醇生物转化产品具有重要意义。

本发明介绍的环糊精包结技术是利用环糊精及其衍生物的包埋作用可有效提高转化底物的溶解性，选择合适的环糊精与底物之间的分子比率以及作用条件的控制，可提高反应的速率和产物的收率。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一种利用环糊精及其衍生物的甾醇生物转化方法，本发明也提供了环糊精及其衍生物在甾醇生物转化方面的应用。

本发明技术方案如下：

即在添加有甾醇的微生物转化反应体系中按一定比例添加环糊精或环糊精衍生物，生物转化的主要微生物有分枝杆菌和节杆菌，生物转化的基本过程包括如下步骤：

1.微生物菌种活化培养：微生物菌种斜面培养后转接到液体培养基中培养。

2.甾醇生物转化：将活化的液体种子接入加有甾醇的转化培养基中，在0h～60h时加入环糊精或其衍生物，培养到72h～110h时将培养液加热至微沸，中止转化，自然降至室温，待分析。

微生物菌种活化培养：菌种转接于新鲜斜面上，27～32℃培养2～4d，制备菌悬液，按1％～10％的接种量接入液体培养基中，在27～32℃、160～220r/min条件下培养20～50h；

甾醇生物转化工艺条件：将液体种子按照4％～20％的接种量接入转化培养基中，在27～32℃、160～200r/min条件下培养。

本发明中转化培养基的合适微生物接种量为4％～15％；本发明中转化培养基用微生物合适种龄在30-40h；

本发明中微生物菌种活化培养合适温度为27～30℃，优选温度29℃。

本发明中甾醇与环糊精或其衍生物的摩尔比为1∶0.3～4；甾醇与环糊精或其衍生物的合适摩尔比为1∶1～3。

本发明所用甾醇包括胆固醇、谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇及由各种甾醇按照任意比组成的甾醇混合物。

本发明中所用环糊精及其衍生物包括：本发明所述的环糊精或其衍生物分别选用β-环糊精(beta-CD)，γ-环糊精(gamma-CD)，羟丙基-β-环糊精、磺丁基醚-β-环糊精，双糖基-β-环糊精，二甲基-β-环糊精，羟乙基-β-环糊精。

本发明中采用的微生物主要有分枝杆菌和节杆菌。分枝杆菌有Mycobacteriumsp.NRRL B-3683，分枝杆菌(Mycobacterium sp.)JY-1，Mycobacterium sp.NRRL B-3805；节杆菌为Arthrobacter sp.CICC 10193。

本发明所用的转化培养基成分主要包括葡萄糖，柠檬酸，柠檬酸亚铁按，硫酸镁，磷酸氢二钾，磷酸氢二铵，pH7.0～pH7.4。本发明所用的转化培养基组成为(g/L)：葡萄糖10，柠檬酸2，柠檬酸亚铁按0.05，硫酸镁0.5，磷酸氢二钾0.5，磷酸氢二铵3.5，pH7.2。

本发明中甾醇可以在转化培养基配制时加入或转化培养的30小时内加入，甾醇添加量为转化培养基的0.3％-2％。

本发明的另一技术方案步骤如下：

即在微生物转化培养基中添加环糊精或环糊精衍生物与甾醇的混合体，生物转化的主要微生物有分枝杆菌和节杆菌，生物转化的基本过程包括如下步骤：

1.微生物菌种活化培养：微生物菌种斜面培养后转接到液体培养基中培养。

2.甾醇生物转化：将活化的液体种子接入转化培养基中，在0h-60h时加入甾醇，环糊精或其衍生物，培养到72h-170h时将培养液加热至微沸，中止转化，自然降至室温，待分析。

微生物菌种活化培养：菌种转接于新鲜斜面上，27～32℃培养2～4d，制备菌悬液，按1％～10％的接种量接入液体培养基中，在27～32℃、160～220r/min条件下培养20-50h；

甾醇生物转化工艺条件：将液体种子按照4％-20％的接种量接入转化培养基中，在27～32℃、160～220r/min条件下培养。

本发明中转化培养基的合适微生物接种量为4％～15％；本发明中转化培养基用微生物合适种龄在30～40h；

本发明所用甾醇为菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇、胆固醇或由菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇、胆固醇按照任意比组成的混合物。

本发明中所用环糊精及其衍生物包括：本发明所述的环糊精或其衍生物分别选用β-环糊精(beta-CD)，γ-环糊精(gamma-CD)，羟丙基-β-环糊精、磺丁基醚-β-环糊精，双糖基-β-环糊精，二甲基-β-环糊精，羟乙基-β-环糊精。本发明微生物转化实验条件

本发明中采用的微生物主要有分枝杆菌和节杆菌。

分枝杆菌有Mycobacterium sp.NRRL B-3683，分枝杆菌(Mycobacterium sp.)JY-1，Mycobacterium sp.NRRL B-3805；节杆菌为Arthrobacter sp.CICC 10193。

本发明中转化率是产物与所加底物的摩尔比。

本发明中环糊精或其衍生物与甾醇混合物的制备包括下列及其他混合方法：

1.高速组织捣碎法：将环糊精或其衍生物置于高速捣碎机中，加入150ml蒸馏水捣至溶解，将用乙酸乙酯溶解的甾醇加入饱和液中，转速8000r/min，搅拌30min。

2.超声波法：用0.5％的Tween80乳化甾醇，然后将环糊精或其衍生物加入，用30W-60W的超声波乳化3min左右。

分析检测方法

用乙酸乙酯萃取发酵液，离心，取乙酸乙酯相1mL于1.5ml的小离心管中，自然风干后加1mL的流动相，离心后进行HPLC分析。用Phenomenex C18柱，流动相为甲醇∶水(4∶1)，流速为1mL/min，检测波长为254nm。

有益效果：

添加环糊精或其衍生物后甾醇生物转化的周期缩短，由对照的7d缩短至3-6d；底物浓度和转化率均大幅度提高，在底物浓度为0.3％～2％的浓度范围内；转化率由对照的5％～35％提高为50％～95％；

本发明将环糊精或其衍生物加入转化底物体系中形成一种超分子反应介质系统，有效的增加了疏水性化合物的溶解并促进了生物转化的进行。

甾醇化合物在水中的溶解度很低，属难溶性或微溶性化合物。采用添加环糊精或其衍生物后溶解度增加，环糊精或其衍生物与甾醇混合物也同样达到上述目的；采用还有环糊精的特殊作用使反应底物由固相转移至反应相，使得底物与生物酶的接触更为方便，转化反应速率加快，并在一定程度上解除了底物/产物对生物酶活性的抑制作用，使反应的转化率提高，提高产物的收率，发酵转化周期明显缩短。环糊精作为超分子在生物转化中形成了一种特殊的超分子介质系统，其本身不参与生物转化反应，也不影响细胞的生长比速率和细胞密度，仅仅作为甾醇增溶剂和反应载体。

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例以混合植物甾醇为例：

实施例1

微生物菌体斜面活化培养：取一环斜面菌种转接于新鲜斜面上，29℃培养3d。

微生物菌体液体种子活化培养：用0.5％的Tween80无菌水溶液洗下斜面培养的种子，使菌悬液A₆₀₀值控制在1.0±0.2，按2％的接种量接入转化培养基中，在27℃、200r/min条件下活化培养36h。

植物甾醇转化：液体种子按5％的接种量接入转化培养基(预先加入1％的植物甾醇)中，在30h时加入羟丙基-β-环糊精，培养到72h时将培养液加热至微沸，中止转化，自然降至室温，待分析。

微生物菌种采用Mycob acterium sp.NRRL B-3683

斜面培养基(g/L)：磷酸氢二钾0.5，硫酸镁0.5，柠檬酸铁铵0.05，柠檬酸2，硝酸铵2，碳酸钙10，甘油20，葡萄糖5，琼脂15。

种子培养基(g/L)∶磷酸氢二钾0.5，硫酸镁0.5，柠檬酸2，硝酸铵2，柠檬酸铁铵0.05，碳酸钙10，甘油20，葡萄糖5。

转化培养基(g/L)∶葡萄糖10，柠檬酸2，柠檬酸亚铁按0.05，硫酸镁0.5，磷酸氢二钾0.5，磷酸氢二铵3.5，植物甾醇10，pH7.2。

植物甾醇由谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇以1∶1∶1的比例组成。植物甾醇与羟丙基-β-环糊精摩尔比为1∶2，经分析检测：转化率为80.8％。同等条件下对照的转化率为12.7％。

实施例2基本方法同例1

微生物斜面活化培养：取一环斜面菌种转接于新鲜斜面上，29℃培养3d。

微生物菌体液体种子活化培养：用0.5％的Tween80无菌水溶液洗下斜面培养的种子，使菌悬液A₆₀₀值控制在1.0±0.2，按2％的接种量接入转化培养基中，在30℃、200r/min条件下活化培养30h。

植物甾醇转化：液体种子按5％的接种量接入转化培养基(预先加入0.5％植物甾醇)中，在24h时加磺丁基醚-β-环糊精，培养到72h时将培养液加热至微沸，中止转化，自然降至室温，待分析。植物甾醇与磺丁基醚-β-环糊精摩尔比为1∶1.5，

微生物菌种采用Mycob acterium sp.NRRLB-3683。植物甾醇由谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇以1∶1∶2的比例组成。

经分析检测：转化率为90.8％。同等条件下对照的转化率为27.7％

实施例3基本方法同例1

微生物在28℃、200r/min条件下活化培养36h，10％的接种量接入转化培养基(预先加入1％植物甾醇)中，在36h时加入羟丙基-β-环糊精，摩尔比例为羟丙基-β-环糊精：植物甾醇＝2∶1，培养到84h时将培养液加热至微沸，中止转化，自然降至室温，待分析。植物甾醇与羟丙基-β-环糊精摩尔比为1∶2，

植物甾醇由谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇以2∶1∶1的比例组成。微生物菌种采用Mycobacterium sp.NRRL B-3683。转化率为81.9％，对照实验转化率是27.7％。

实施例4基本方法同例1

微生物在29℃、200r/min条件下活化培养30h，10％的接种量接入转化培养基中，在30h时加入羟丙基-β-环糊精，培养到120h时将培养液加热至微沸，中止转化，自然降至室温，待分析。

转化培养基中预先加入由由谷甾醇、豆甾醇和胆固醇以2∶1∶1的比例组成的混合物。甾醇混合物的添加比例为转化培养基的2％。甾醇与羟丙基-β-环糊精摩尔比为1∶2，转化率为72.5％，对照实验转化率是7.2％。微生物菌种采用Mycobact eriumsp.NRRL B-3683。

实施例5基本方法同例1

微生物在29℃、200r/min条件下活化培养30h，10％的接种量接入转化培养基中，在30h时加双糖基-β-环糊精，培养到96h时将培养液加热至微沸，中止转化，自然降至室温，待分析。

转化培养基中预先加入由由谷甾醇、豆甾醇和胆固醇以2∶1∶1的比例组成的混合物。甾醇混合物的添加比例为转化培养基的1.5％。甾醇与双糖基-β-环糊精摩尔比为1∶1.5，转化率为78.5％，对照实验转化率是18.6％。微生物菌种采用Mycobacterium sp.NRRL B-3683。

实施例6基本方法同例1

微生物在30℃、200r/min条件下活化培养30h，15％的接种量接入转化培养基中，在48h时加入0.4倍(与甾醇摩尔比)的β-环糊精，培养到132h时将培养液加热至微沸，中止转化，自然降至室温，待分析。

转化培养基中预先加入由菜油甾醇、豆甾醇和胆固醇以2∶1∶1的比例组成的混合物。甾醇混合物的添加比例为转化培养基的0.5％。甾醇与β-环糊精摩尔比为1∶0.4。微生物菌种采用Mycobact erium sp.NRRL B-3683。

转化率为54.9％，对照实验转化率是35.7％。

实施例7基本方法同例1

微生物在30℃、200r/min条件下活化培养28h，15％的接种量接入转化培养基中，在50h时加入羟丙基-β-环糊精，培养到96h时将培养液加热至微沸，中止转化，自然降至室温，待分析。

转化培养基中预先加入0.5％的植物甾醇。羟丙基-β-环糊精/植物甾醇＝2∶1

转化率为91.5％，对照实验转化率是34.1％。微生物菌种采用Mycobacteriumsp.NRRL B-3683。

实施例8基本方法同例1

微生物在30℃、200r/min条件下活化培养30h，15％的接种量接入转化培养基中，在12h时加入羟丙基-β-环糊精，培养到108h时将培养液加热至微沸，中止转化，自然降至室温，待分析。转化培养基中预先加入2％的植物甾醇。微生物菌种采用Mycobacterium sp.NRRL B-3683。

羟丙基-β-环糊精/植物甾醇＝2∶1。转化率：77.3％对照：6.8％

实施例9基本方法同例1

微生物在30℃、200r/min条件下活化培养28h，15％的接种量接入转化培养基中，在30h时加入羟丙基-β-环糊精，培养到72h时将培养液加热至微沸，中止转化，自然降至室温，待分析。转化培养基中预先加入0.5％的植物甾醇。羟丙基-β-环糊精/植物甾醇＝1∶1。转化率：84.4％对照转化率：27.7％采用的微生物为节杆菌为Arthrobacter sp.CICC 10193。

实施例10基本方法同例1

微生物在30℃、200r/min条件下活化培养34h，10％的接种量接入转化培养基中，在30h时加入羟丙基-β-环糊精，培养到96h时将培养液加热至微沸，中止转化，自然降至室温，待分析。转化培养基中预先加入1.5％的植物甾醇。羟丙基-β-环糊精/植物甾醇＝2∶1。转化率：60.7％对照：18.5％。采用的微生物为Mycobacteriumsp.NRRL B-3805。

实施例11基本方法同例1

微生物在32℃、160r/min条件下活化培养24h，10％的接种量接入转化培养基中，在26h时加入羟丙基-β-环糊精，培养到70h时将培养液加热至微沸，中止转化，自然降至室温，待分析。在转化培养22h时加入0.5％的植物甾醇。羟丙基-β-环糊精/植物甾醇＝1∶1。转化率：55.4％对照：32.3％。采用的微生物为节杆菌Arthrobactersp.CICC 10193。

实施例12基本方法同例1

即在微生物培养基中添加环糊精或环糊精衍生物与甾醇的混合体，生物转化的基本过程包括如下步骤：

1.微生物菌种活化培养：微生物菌种活化培养：菌种转接于新鲜斜面上，28℃培养2d，制备菌悬液，按10％的接种量接入液体培养基中，在28℃、200r/min条件下培养25h。

2.甾醇生物转化：将活化的液体种子接入转化培养基中，同时加入谷甾醇与羟丙基-β-环糊精的混合物，培养到96h时将培养液加热至微沸，中止转化，自然降至室温，待分析。

甾醇生物转化工艺条件：将液体种子按照5％的接种量接入转化培养基中，在28℃、200r/min条件下培养。谷甾醇添加量占培养基的1.5％。谷甾醇与羟丙基-β-环糊精比例为1∶3。采用的微生物为Mycobacterium sp NRRL B-3683。本例中环糊精或其衍生物与甾醇混合物的制备采取下列方法：高速组织捣碎法：将环糊精或其衍生物置于高速捣碎机中，加入150ml蒸馏水捣至溶解，将用乙酸乙酯溶解的甾醇加入饱和液中，转速8000r/min，搅拌30min。转化率为66.8％，转化时间4d。对照实验转化率是18.6％。

Claims (10)

1.一种利用环糊精的甾醇生物转化方法，其特征在于添加有甾醇的微生物转化反应体系中添加环糊精或环糊精衍生物，微生物为分枝杆菌和节杆菌，生物转化的基本过程包括如下

步骤：1.微生物菌种活化培养；2甾醇生物转化：将活化菌种加入有甾醇的转化培养基中，在0h-60h加入环糊精或其衍生物，培养结束后培养液加热至微沸，中止转化。

2.根据权利要求1所述的一种利用环糊精的甾醇生物转化方法，其特征在于环糊精及其衍生物为β-环糊精，γ-环糊精，羟丙基-β-环糊精、磺丁基醚-β-环糊精，双糖基-β-环糊精，二甲基-β-环糊精，羟乙基-β-环糊精。

3.根据权利要求1或2所述的一种利用环糊精的甾醇生物转化方法，其特征在于所述甾醇为菜油甾醇、菜籽甾醇、豆甾醇、谷甾醇、胆固醇或由菜油甾醇、菜籽甾醇、豆甾醇、谷甾醇、胆固醇按照任意比组成的混合物。

4.根据权利要求1或2所述的一种利用环糊精的甾醇生物转化方法，其特征在于所述活化菌种的合适种龄为20-50h。

5.根据权利要求1所述的一种利用环糊精的甾醇生物转化方法，其特征在于所述甾醇与环糊精或其衍生物的摩尔比为1∶0.3-4。

6.根据权利要求1或5所述的一种利用环糊精的甾醇生物转化方法，其特征在于所述甾醇与环糊精或其衍生物的摩尔比为1∶1-3。

7.根据权利要求1所述的一种利用环糊精的甾醇生物转化方法，其特征在于所述分枝杆菌为NRRL-B3683、NRRL-B3805或JY-1；节杆菌为CICC10193菌种。

8.甾醇生物转化用培养基组成为(g/L)：葡萄糖10，柠檬酸2，柠檬酸亚铁按0.05，硫酸镁0.5，磷酸氢二钾0.5，磷酸氢二铵3.5，pH7.2。

9.一种环糊精及其衍生物在甾醇生物转化方法，其特征在于甾醇生物转化培养基中添加环糊精或环糊精衍生物与甾醇的混合体，微生物为分枝杆菌和节杆菌，生物转化的基本过程包括如下步骤：1.微生物菌种活化培养：微生物菌种斜面培养后转接到液体培养基中培养；2甾醇生物转化：将活化的液体种子接入转化培养基中，在0h-60h时加入甾醇，环糊精或其衍生物，培养到72h-170h时将培养液加热至微沸，中止转化。

10.环糊精及其衍生物在甾醇生物转化中的应用。