CN111471737A - 伯克霍尔德菌转化制备甾醇衍生物的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了伯克霍尔德菌转化制备甾醇衍生物的方法及应用，属于甾醇微生物转化技术领域。在向含有环糊精或其衍生物的反应体系中添加伯克霍尔德菌，能够使得产物转化得率由对照的0.1％～0.3％提高为12％～15％；且该方法在制备过程中无需添加有机溶剂，更加环保、经济、安全。

Description

伯克霍尔德菌转化制备甾醇衍生物的方法及应用

技术领域

本发明涉及伯克霍尔德菌转化制备甾醇衍生物的方法及应用，属于甾醇微生物转化技术领域。

背景技术

胆固醇是一种重要的甾醇化合物，可以作为甾体类药物的原料。有些微生物可以切除胆固醇饱和侧链、氧化甾核特定部位，从而得到多种有药用价值的衍生物。Liu WH等利用Mycobacterium sp.将胆固醇转化为睾酮(TS)；Nagasawa等利用Arthrobacter simplex降解胆固醇成功生产了雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)；郭倩等利用Rhodococcus sp.将胆固醇转化为胆甾-4-烯-3-酮。除上述衍生物外，胆固醇还可被微生物转化为胆甾-4-烯-3,6-二酮。

胆甾-4-烯-3,6-二酮可应用于制备治疗或预防神经元损伤药物；亦可用于制造脂质代谢改善剂、饮食品和动物饲料，比胆甾-4-烯-3-酮具有更高的医药用价值。胆甾-4-烯-3,6-二酮可通过化学方法合成，但化学合成法需使用大量强氧化剂且反应条件剧烈，也可通过微生物的甾体转化获得胆甾-4-烯-3,6-二酮。目前微生物转化甾醇获得胆甾-4-烯-3-酮的报道较多，但获得胆甾-4-烯-3,6-二酮的报道较少。

底物胆固醇为疏水性有机化合物，不利于与转化体系中细胞的接触和反应，降低了产物的得率。Rikizo Aono等将胆固醇用有机溶剂溶解后加入转化体系来解决这一问题,但有机溶剂易挥发、易燃易爆、污染环境，对菌体的生长毒害较大，且操作者长时间暴露于环境中，会对其神经系统及呼吸系统造成损伤。因此可选取更环保廉价的促溶剂。

环糊精(cyclodextrin，简称CD)就是这样一种促溶剂，Umesh Luthra等利用Nocardioides simplex在转化AD生成ADD的过程中，添加β-环糊精(β-CD)进行转化，可提高转化效率；

等报道了在β-CD存在下，能显著提高Rhizopus nigricans对孕酮的生物转化反应速率。然而，在甾体生物转化体系中应用环糊精促溶获得胆甾-4-烯-3,6-二酮的研究目前尚未有文献报道。

已报道的伯克霍尔德菌多用于生产脂肪酶等的研究。李相等以自制的洋葱伯克霍尔德菌固定化脂肪酶为催化剂，在微水相、无溶剂体系中研究了大豆油和甲醇合成生物柴油的工艺。汪小锋等发现洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶对有机溶剂(醇)、热、氧化剂、表面活性剂、去污剂、蛋白酶等具有良好的抗性，在有机合成、对映体拆分、非水相催化等领域应用十分广泛。

本实验室筛得的伯克霍尔德菌不仅能够产胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶，还能够降解胆固醇、谷甾醇、豆甾醇等甾醇物质，且应用伯克霍尔德菌转化胆固醇生成胆甾-4-烯-3,6-二酮的研究目前尚未有文献明确报道。

发明内容

本发明解决的技术问题是利用伯克霍尔德菌在环糊精及其衍生物环境中，转化甾醇生成甾醇3,6-二酮衍生物的方法。

本发明提供了一种制备胆甾-4-烯-3,6-二酮的方法，所述方法是利用伯克霍尔德菌ZWS15进行转化。

在本发明的一种实施方式中，所述伯克霍尔德菌ZWS15记载于公布号CN110004121A的专利中；所述伯克霍尔德菌已于2017年11月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017661。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为：先将所述伯克霍尔德菌ZWS15进行活化、培养，得到菌液；再将得到的菌液接种至转化培养基中进行培养，培养后得到胆甾-4-烯-3,6-二酮。

在本发明的一种实施方式中，将所述伯克霍尔德菌ZWS15于固体培养基划线分离，在35～40℃恒温培养箱倒置培养20～36h至长出单菌落，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，于35～40℃、180～220r·min^-1摇床培养12～20h，培养至OD₆₀₀为4.0～6.0，再以4～6％(v/v)接种至转化培养基。

在本发明的一种实施方式中，所述转化培养基中含有胆固醇的添加量为5.00～5.50mM。

在本发明的一种实施方式中，所述转化培养基中含有环糊精或其衍生物。

在本发明的一种实施方式中，所述环糊精或其衍生物与胆固醇的摩尔比为(1～3):(1～3)。

在本发明的一种实施方式中，所述环糊精或其衍生物包括α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、甲基-β-环糊精、羟乙基-β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、磺丁基-β-环糊精。

本发明还保护所述方法在医药、食品、农业领域制备胆甾-4-烯-3,6-二酮中的应用。

本发明的有益效果：

本发明利用了一种能将胆固醇转化为甾醇衍生物的伯克霍尔德菌，在向含有环糊精或其衍生物的反应体系中添加该菌株，能够使得产物转化得率由对照的0.1％～0.3％提高为12％～15％；且该方法在制备过程中无需添加有机溶剂，更加环保、经济、安全。

附图说明

图1为环糊精及其衍生物的结构式。

图2为甾醇及3,6-二酮衍生物结构式。

图3为胆甾-4-烯-3,6-二酮结构式及质谱鉴定。

具体实施方式

LB固体培养基：每1L蒸馏水中添加酵母粉5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，琼脂粉20g。

LB液体培养基：每1L蒸馏水中添加酵母粉5g，蛋白胨10g，NaCl 10g。

转化培养基组成为(g/L)：蔗糖5，酵母粉15；NaNO₃，K₂HPO₄·3H₂O 2，KCl 0.5，MgCl₂1.35，MnCl₂ 0.01，CaCl₂ 0.055，MgSO₄ 10mmol/L，胆固醇2；α-环糊精(其中，固定胆固醇的添加量为2g/L，即5.18mM；α-环糊精与胆固醇的摩尔比为1:2、1:1和2:1。且二者预先经60W超声处理10～15min加入到转化培养基中)。

TLC分离提取胆固醇转化产物：将步骤(3)的转化液用2倍体积乙酸乙酯萃取，于200rpm摇床中充分振荡20min，6000rpm离心10min，收集上层乙酸乙酯。如此重复三次，合并乙酸乙酯，于真空旋转蒸发仪中浓缩至干。浓缩物用200μL异丙醇复溶，在GF254硅胶板(20×20cm，1.5-2mm)上密集点样，随后置于层析缸中展层，使用正己烷-无水乙醚(2/3，v/v)作为展开剂。待展层结束，取出硅胶板风干。在254nm紫外灯下将处于同一水平线吸收紫外线的阴影区域标记并将该处硅胶刮下。用乙酸乙酯洗涤硅胶2～3次后，抽滤收集乙酸乙酯，再次用真空旋转蒸发仪将乙酸乙酯浓缩至干，所得即为转化产物纯品。

胆固醇转化产物结构鉴定：

将样品用异丙醇溶解并稀释到0.1～1mg/mL，经LC-MS(沃特世质谱仪MALDISYNAPT MS)检测产物的摩尔分子量；将浓缩至干的纯化产物通过傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)利用全反射法检测产物的官能团(赛默飞红外光谱仪Nicolet is10)；核磁共振碳谱(¹³C-NMR)、核磁共振氢谱(¹H-NMR)测定产物碳和质子的信号(布鲁克核磁共振波谱仪AduanceⅢ400MHZ)，温度25℃，溶剂CDCl₃，以四甲基硅烷(TMS)作为内标，其中用于测定¹³C-NMR样品浓度为8～25mg/mL，¹H-NMR样品浓度为3～15mg/mL。

HPLC定量分析胆甾-4-烯-3,6-二酮：

(1)色谱仪为安捷伦高效液相色谱仪，色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6by250mm，5μm)，乙腈:异丙醇＝90:10(体积比)作为流动相，流速0.8mL/min，进样量10μL，检测波长238nm，柱温30℃。

(2)取分离鉴定后的纯产物作为标准品。用异丙醇溶解产物，配制成不同浓度梯度的溶液，0.45μm有机膜过滤后进行HPLC测定。以产物质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标做曲线，所得即为产物标准曲线。

根据上述标准曲线计算产物产量，根据下列公式计算产物的摩尔转化得率：

式中，c₁为产物质量浓度(mg/mL)，c₂为底物初始质量浓度(mg/mL)，M₁为产物摩尔质量(g/mol)，M₂为底物摩尔质量(g/mol)。

实施例1：α-环糊精体系B.cepacia转化胆固醇制备胆甾-4-烯-3,6-二酮

(1)斜面培养：取在-40℃甘油管保存的伯克霍尔德菌ZWS15，吸取30μL接种于LB固体培养基，37℃恒温培养箱中静置，培养24h至长出单菌落；

(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株，在无菌条件下挑取单菌落接种于50mL LB液体培养基中，于37℃、转速为200rpm的摇床中振荡培养9-13h至OD₆₀₀为5.0～6.0。

(3)B.cepacia转化胆固醇：将步骤(2)培养的种子液按体积分数5％的接种量接入转化培养基中，30℃、200rpm培养48h。以不添加环糊精或其衍生物的组作为对照。

(4)TLC分离提取胆固醇转化产物：将步骤(3)的转化液用2倍体积乙酸乙酯萃取后得到转化产物纯品。

(5)将纯化后的胆固醇转化产物进行结构鉴定。

经检测，该产物M＝398.4；¹³C NMR谱完整信息如下：¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ(ppm)202.31，199.48，161.07，125.44，56.55，55.97，50.99，46.81，42.54，39.81，39.46，39.14，36.07，35.67，35.54，34.22，33.97，29.71，28.01，23.97，23.80，22.81，22.55，20.88，18.65，17.51，11.89；¹³H NMR谱特征如下：δ(ppm)2.47(C₂-βH)，2.62(C₇-αH)，6.17(C₄-H)，0.72(18-CH₃)，1.12(19-CH₃)，0.92(21-CH₃)，0.87(26-CH₃)，0.87(27-CH₃)；经红外光谱分析，在1700.32和1682.67cm^-1、1603.52cm^-1处的吸收峰分别是-C＝O、-C＝C-的伸缩振动吸收峰，表明该物质中含有两个-C＝O和一个-C＝C-，推测其分子式为C₂₇H₄₂O₂。

综合上述数据，并结合文献与数据库中的信息，判定该产物为胆甾-4-烯-3,6-二酮。

(6)HPLC定量分析胆甾-4-烯-3,6-二酮。

经分析检测：当α-环糊精与胆固醇的摩尔比为1:2、1:1和2:1时，胆甾-4-烯-3,6-二酮摩尔转化得率分别为0.42％、0.38％和0.32％。同样条件下对照组的转化率为0.2％。

实施例2：β-环糊精体系B.cepacia转化胆固醇制备胆甾-4-烯-3,6-二酮

具体实施方式参见实施例1。

转化培养基中固定胆固醇的添加量为2g/L，即5.18mM；β-环糊精与胆固醇的摩尔比为1:2、1:1和2:1。二者经60W超声预处理10～15min后加入到转化培养基。

经分析检测：当β-环糊精与胆固醇的摩尔比为1:2、1:1和2:1时，胆甾-4-烯-3,6-二酮摩尔转化得率分别为0.38％、0.36％和0.42％。同样条件下对照组的转化率为0.2％。

实施例3：γ-环糊精体系B.cepacia转化胆固醇制备胆甾-4-烯-3,6-二酮

具体实施方式参见实施例1。

转化培养基中固定胆固醇的添加量为5.18mM；γ-环糊精与胆固醇的摩尔比为1:2、1:1和2:1。二者经60W超声预处理10～15min后加入到转化培养基。

经分析检测：当γ-环糊精与胆固醇的摩尔比为1:2、1:1和2:1时，胆甾-4-烯-3,6-二酮摩尔转化得率分别为0.51％、0.35％和0.26％。同样条件下对照组的转化率为0.2％。

实施例4：甲基-β-环糊精体系B.cepacia转化胆固醇制备胆甾-4-烯-3,6-二酮

具体实施方式参见实施例1。

转化培养基中固定胆固醇的添加量为5.18mM；甲基-β-环糊精与胆固醇的摩尔比为1:2、1:1和2:1。二者经60W超声预处理10～15min后加入到转化培养基。

经分析检测：当甲基-β-环糊精与胆固醇的摩尔比为1:2、1:1和2:1时，胆甾-4-烯-3,6-二酮摩尔转化得率分别为1.26％、5.51％和9.11％。同样条件下对照组的转化率为0.2％。

实施例5：羟乙基-β-环糊精体系B.cepacia转化胆固醇制备胆甾-4-烯-3,6-二酮

具体实施方式参见实施例1。

转化培养基中固定胆固醇的添加量为5.18mM；羟乙基-β-环糊精与胆固醇的摩尔比为1:2、1:1和2:1。二者经60W超声预处理10～15min后加入到转化培养基。

经分析检测：当羟乙基-β-环糊精与胆固醇的摩尔比为1:2、1:1和2:1时，胆甾-4-烯-3,6-二酮摩尔转化得率分别为2.21％、7.59％和12.10％。同样条件下对照组的转化率为0.2％。

实施例6：羟丙基-β-环糊精体系B.cepacia转化胆固醇制备胆甾-4-烯-3,6-二酮

具体实施方式参见实施例1。

转化培养基中固定胆固醇的添加量为5.18mM；羟丙基-β-环糊精与胆固醇的摩尔比为1:2、1:1和2:1。二者经60W超声预处理10～15min后加入到转化培养基。

经分析检测：当羟丙基-β-环糊精与胆固醇的摩尔比为1:2、1:1和2:1时，胆甾-4-烯-3,6-二酮摩尔转化得率分别为0.46％、0.79％和1.84％。同样条件下对照组的转化率为0.2％。

实施例7：磺丁基-β-环糊精体系B.cepacia转化胆固醇制备胆甾-4-烯-3,6-二酮

具体实施方式参见实施例1。

转化培养基中固定胆固醇的添加量为5.18mM；磺丁基-β-环糊精与胆固醇的摩尔比为1:2、1:1和2:1。二者经60W超声预处理10～15min后加入到转化培养基。

经分析检测：当磺丁基-β-环糊精与胆固醇的摩尔比为1:2、1:1和2:1时，胆甾-4-烯-3,6-二酮摩尔转化得率分别为0.96％、1.48％和1.92％。同样条件下对照组的转化率为0.2％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种制备胆甾-4-烯-3,6-二酮的方法，其特征在于，所述方法以胆固醇为底物，利用伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)在含有环糊精或其衍生物的体系中转化生产胆甾-4-烯-3,6-二酮。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述伯克霍尔德菌已于2017年11月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017661。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述环糊精或其衍生物包括α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、甲基-β-环糊精、羟乙基-β-环糊精、羟丙基-β-环糊精或磺丁基-β-环糊精。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法为：先将所述伯克霍尔德菌培养，得到菌液；再将菌液加入转化体系中进行培养，培养后得到胆甾-4-烯-3,6-二酮。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述伯克霍尔德菌培养后的菌液OD₆₀₀为3.0～7.0。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将伯克霍尔德菌培养后的菌液以4～7％的接种量加入转化体系中。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述转化体系中含有胆固醇，胆固醇的含量为3.00～7.50mM。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述转化体系中含有胆固醇和环糊精或其衍生物，所述环糊精或其衍生物与胆固醇的摩尔比为(1～4):(1～4)。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述转化培养基中含有胆固醇和环糊精或其衍生物，所述环糊精或其衍生物与胆固醇的摩尔比为1:1或1:2或2:1。

10.权利要求1～9任一所述方法在医药、食品、农业领域制备胆甾-4-烯-3,6-二酮中的应用。

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