CN101078005B - 一株短小芽孢杆菌及其在生物转化异丁香酚生产天然香兰素中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株短小芽孢杆菌及其在生物转化异丁香酚生产天然香兰素中的应用。该菌株名为Bacillus pumilus S-1，于2006年1月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 205165。利用Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165转化异丁香酚生产天然香兰素的过程包括：(1)斜面培养，(2)制备种子培养液，(3)转化细胞培养，(4)转化。本发明属于生物技术领域，采用该方法可高转化率生产高浓度香兰素，解决生物法生产天然香兰素产物浓度低和产率低的问题，具有很大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物转化异丁香酚生产天然香兰素的方法，具体地说，尤其涉及使用一株短小芽孢杆菌生物转化异丁香酚生产天然香兰素的方法。
背景技术
香兰素，化学名为4-羟基-3-甲氧基苯甲醛(4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde)，又名香草醛、香荚兰素。英文名为vanillin，分子式为C8H8O3，分子量为152.14。香兰素外观为白色至微黄色针状结晶或粉末，呈香荚兰豆特有的香气，微甜，在潮湿的空气中缓慢氧化为香兰酸。沸点为284～285℃，相对密度为1.056，微溶于水，易溶于乙醇、乙醚、氯仿、冰醋酸、二硫化碳和吡啶等有机溶剂。香兰素有低微毒性，大白鼠经口LD50为1580毫克/千克。
香兰素是世界上产量最大、用途最广的香料之一，被誉为“香料之王”。香兰素广泛应用于巧克力、冰激凌、糖果等食品以及香烟、饮料和高档化妆品中。它不仅可以用作增香剂和定香剂，还可在食品中用作防腐剂、保鲜剂和抗氧化剂。在化学工业中，香兰素可抑制润滑剂发泡，用作镀锌槽的增白剂、锌电镀的活性剂。香兰素也是重要的医药合成中间体，用作生产L-多巴、L-甲基多巴和罂粟碱的基础原料。目前世界市场上香兰素的需求为每年1.5万吨，且以每年10％的速度增长。
目前常用的香兰素生产方法是植物原料提取法和化学合成法。香兰素是天然香荚兰的主要成分，其在香荚兰豆中的含量约为15～20克/千克。香荚兰在种植过程中需要对花朵进行人工授粉，劳动强度大，难以进行大规模栽种，从植物原料提取不能满足日益增长的天然香兰素市场需求，其年产量仅为2000吨左右。绝大多数的香兰素产品是通过化学合成的，常用的化学合成底物包括丁香酚、木质素、乙醛酸、黄樟素和愈创木酚等。国内常用的是采用愈创木酚和乌洛托品反应的亚硝化工艺，该方法线路长，分离过程复杂，收率低，环境污染严重，原料消耗高，国外早已被淘汰。国外主要采用愈创木酚和乙醛酸缩合工艺，该工艺设备简单，产率较高，但还处于研究阶段，未能应用于工业化生产。总体来说，化学合成法工艺成熟，产物纯度高，原料来源广泛，但存在严重的缺陷，比如环境污染严重，产品香气单一，易掺杂质，合成香兰素的安全性也受到质疑。
随着生活水平的提高，人们对天然绿色产品的需要也越来越高。与化学合成相比，生物法合成香兰素具有反应条件温和，副产物少，提取步骤简单，生产清洁，环境污染低，产品安全可靠等优点，正日益受到人们的重视。包括阿魏酸、木质素、香兰酸、丁香酚和异丁香酚在内的多种天然底物可用做生产香兰素的底物，其中研究得较为深入的是阿魏酸和丁香酚。以阿魏酸为底物生产香兰素，生产周期短，产物收率高，香兰素最终浓度可以达到1％以上。但天然阿魏酸本身就是一种重要的药用原料，价格昂贵，生产成本高。采用阿魏酸酯酶等在温和条件下水解麦麸、米糠和甜菜等植物废料可获得天然阿魏酸，但水解效率很低，产物分离提取困难，难以达到工业化规模生产的要求。
丁香酚和异丁香酚是天然丁香油的主要成分，原料来源广泛，价格低廉，是生物转化法生产天然香兰素的合适底物。通过丁香酚和异丁香酚的生物转化生产香兰素的对比发现，以丁香酚为原料生产香兰素的生产工艺，香兰素终浓度远远低于1克/升，且转化时间一般很长，大部分研究者认为，异丁香酚更适合作为天然香兰素生产的底物。截止到目前为止，文献报道仅有几株芽孢杆菌、黑曲霉、沙雷氏菌和红球菌有转化异丁香酚累积香兰素的能力，但香兰素产率低，达不到工业化生产的要求。Abraham首次报道黑曲霉能转化异丁香酚产生香兰素，但累积的香兰素浓度仅为0.1克/升。Chatterjee使用一株红球菌Rhodococcus rhodochrousMTCC 289转化异丁香酚，香兰素摩尔产率高达58％，但最终香兰素浓度低于1克/升。Furukawa从土壤中筛选到一株转化异丁香酚为香兰素的芽孢杆菌Bacillus sp.B2，使用生长体系转化时香兰素浓度为0.8克/升，使用粗酶液转化时提高到0.9克/升，转化率不到10％。Furukawa筛选到的另外一株恶臭假单胞菌Pseudomonasputida I58有较高的异丁香酚降解活力，在30分钟内能完全降解1.5克/升的异丁香酚，但终产物为香兰酸，不累积香兰素。到目前为止有报道的以异丁香酚为底物通过微生物转化生产香兰素产量最高的是一株粘质沙雷氏菌Serratia marcescens DSM 30126，据报道其香兰素浓度在9天内最高可达3.8克/升，但其缺点是转化时间过长，且转化率很低，仅为20.5％。
发明内容
针对目前天然香兰素需求逐年增加，以天然阿魏酸为底物生产香兰素成本过高，而以丁香酚底物的生产过程香兰素浓度低，转化率低的不足，本发明提供了一株从土壤中筛选得到的短小芽孢杆菌Bacillus pumilusS-1CCTCC M 205165，以及利用该菌株以廉价天然异丁香酚为底物高转化率生产高浓度天然香兰素的方法。
本发明提供了一株能够转化异丁香酚生产高浓度香兰素的短小芽孢杆菌Bacilluspumilus S-1。该菌株于2006年1月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM 205165。
上述Bacillus pumilus S-1CCTCC M 205165具有如下生物学特征：革兰氏阳性，好氧，产芽孢，菌落淡黄色，平坦，不透明，可利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇、果糖产酸，不能水解淀粉，不能利用硝酸盐，不能利用3-酮基乳糖，接触酶阳性，明胶液化阳性，其16S rDNA序列与多株短小芽孢杆菌的16S rDNA序列比对相似性达到100％。
本发明涉及的Bacillus pumilus S-1CCTCC M 205165转化异丁香酚生产天然香兰素，其涉及的详细步骤如下：
(1)斜面培养：将Bacillus pumilus S-1CCTCC M 205165接种到添加质量体积比为1％葡萄糖的LB固体培养基上，在30℃条件下，静置培养20小时；
(2)制备种子培养液：用步骤(1)所得的斜面培养物，接种到添加质量体积比为1％葡萄糖的LB液体培养基中，在30℃条件下，120转/分钟振荡培养15小时，制得种子培养液；
(3)转化细胞培养：使用步骤(2)所得的种子培养液，按体积百分比6％的接种量接入转化培养基中，在30℃条件下，120转/分钟振荡培养20～40小时；
(4)转化：使用步骤(3)所得的转化细胞培养液，加入1～20克/升的异丁香酚，28℃～37℃条件下，120转/分钟振荡培养90～150小时。
其中，步骤(3)中所述的菌体培养时间优选是25～35小时。
其中，步骤(4)中所述的转化温度优选是30～37℃。
其中，步骤(4)中所述的加入的异丁香酚浓度优选为5～15克/升。
其中，步骤(4)中所述的转化时间优选是90～150小时。
在上述利用短小芽孢杆菌转化异丁香酚生产天然香兰素的方法中，种子培养使用的添加质量体积比为1％葡萄糖的LB液体培养基配方为：酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，氯化钠5克/升，调节pH至7.0。115℃条件下灭菌20分钟。LB固体培养基配方为在LB液体培养基基础上添加质量体积比1.6％的琼脂。
在上述利用短小芽孢杆菌转化异丁香酚生产天然香兰素的方法中，菌株转化异丁香酚生产香兰素使用的转化培养基配方为：葡萄糖32克/升，酵母粉14克/升，硫酸镁0.8克/升，氯化钠0.2克/升，调节pH至7.0。115℃条件下灭菌20分钟。
异丁香酚原料来源广泛，价格低廉，使用Bacillus pumilus S-1CCTCC M 205165转化异丁香酚生产天然香兰素的方法有反应条件温和，环境污染小，产物浓度高，副产物少，提取步骤简单，生产清洁，产品环境友好，安全可靠等优点，解决了长期以来采用植物原料提取法和化学合成法遇到的多种难题。本发明属于生物技术领域，采用该方法可高转化率生产高浓度香兰素，具有很大的应用前景。
附图说明
本发明提供的一株Bacillus pumilus S-1，于2006年1月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 205165。
附图为Bacillus pumilus S-1CCTCC M 205165转化异丁香酚生产香兰素的过程中异丁香酚和香兰素的变化曲线。
具体实施方式
实施例1：Bacillus pumilus S-1CCTCC M 205165的筛选
取丁香树周围的土壤，称取5克溶于100毫升生理盐水，充分混匀后取10毫升加入50毫升转化培养基中，在30℃条件下，120转/分钟振荡培养24小时后加入质量体积比为1％的异丁香酚，120转/分钟振荡培养48小时，重复这一过程3～5次。将培养的菌液稀释1,000,000倍涂布添加质量体积比为1％的葡萄糖的LB固体培养基上，在30℃条件下静置培养20小时。选取长出的单菌落接种50毫升的转化培养基中，振荡培养24小时后加入1％质量体积比的异丁香酚，120转/分钟振荡培养120小时，筛选能够转化异丁香酚生成香兰素菌株，最终获得一株降解能力较好、能大量积累香兰素的菌株，即Bacillus pumilusS-1 CCTCC M 205165，实验表明该菌株具有非常高的稳定性，多次传代后降解异丁香酚的能力没有降低。
该菌株为革兰氏阳性菌，好氧，不运动，菌落为淡黄色、平坦、不透明，可利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇、果糖产酸，不能水解淀粉，不能利用硝酸盐，不能利用3-酮基乳糖，接触酶阳性，明胶液化阳性，所述Bacillus pumilus S-1CCTCC M 205165的16S rDNA与多株短小芽孢杆菌的16S rDNA序列相似性达到100％，确定该菌株属于短小芽孢杆菌。
在上述利用短小芽孢杆菌转化异丁香酚生产天然香兰素的方法中，使用的添加质量体积比为1％葡萄糖的LB固体培养基配方为：酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，氯化钠5克/升，琼脂16克/升，调节pH至7.0。115℃条件下灭菌20分钟。
在上述筛选能转化异丁香酚生成香兰素的菌株过程中，使用的转化培养基配方为：葡萄糖32克/升，酵母粉14克/升，硫酸镁0.8克/升，氯化钠0.2克/升，调节pH至7.0。115℃条件下灭菌20分钟。
实施例2：
Bacillus pumilus S-1CCTCC M 205165菌体在种子培养15小时后以体积百分比6％接种量接入转化培养基中，菌体培养25小时后加入10克/升异丁香酚，在30℃条件下120转/分钟振荡培养。120小时后取样测定香兰素浓度。
本实施例涉及的Bacillus pumilus S-1CCTCC M 205165转化异丁香酚生产天然香兰素，其涉及的详细步骤如下：
(1)斜面培养：将Bacillus pumilus S-1CCTCC M 205165接种到添加1％的葡萄糖的LB固体培养基上，在30℃条件下静置培养20小时；
(2)制备种子培养液：用步骤(1)所得的斜面培养物，接种到添加质量体积比为1％葡萄糖的LB液体培养基中，在30℃条件下，120转/分钟振荡培养15小时，制得种子培养液；
(3)转化细胞培养：使用步骤(2)所得的种子培养液，按体积百分比6％的接种量接入转化培养基中，在30℃条件下，120转/分钟振荡培养20小时；
(4)转化：使用步骤(3)所得的转化细胞培养液，加入10克/升的异丁香酚，在30℃条件下，120转/分钟振荡培养120小时；
(5)香兰素浓度检测：转化样品经分析纯乙酸丁酯萃取后使用瓦里安3380气相色谱仪检测香兰素浓度，最终香兰素浓度达到2.2克/升，摩尔转化率为23.7％。
在上述利用短小芽孢杆菌转化异丁香酚生产天然香兰素的方法中，种子培养使用的添加质量体积比为1％葡萄糖的LB液体培养基配方为：酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，氯化钠5克/升，调节pH至7.0。115℃条件下灭菌20分钟。LB固体培养基配方为在LB液体培养基基础上添加质量体积比1.6％的琼脂。
在上述利用短小芽孢杆菌转化异丁香酚生产天然香兰素的方法中，菌株转化异丁香酚生产香兰素使用的转化培养基配方为：葡萄糖32克/升，酵母粉14克/升，硫酸镁0.8克/升，氯化钠0.2克/升，调节pH至7.0。115℃条件下灭菌20分钟。
实施例3：
Bacillus pumilus S-1CCTCC M 205165菌体在种子培养15小时后以体积百分比6％接种量接入转化培养基中，菌体培养35小时后加入10克/升异丁香酚，在30℃条件下120转/分钟振荡培养。120小时后取样测定香兰素浓度。
本实施例涉及的Bacillus pumilus S-1CCTCC M 205165转化异丁香酚生产天然香兰素，其涉及的详细步骤如下：
(1)斜面培养：将Bacillus pumilus S-1CCTCC M 205165接种到添加1％的葡萄糖的LB固体培养基上，在30℃条件下静置培养20小时；
(2)制备种子培养液：用步骤(1)所得的斜面培养物，接种到添加质量体积比为1％葡萄糖的LB液体培养基中，在30℃条件下，120转/分钟振荡培养15小时，制得种子培养液；
(3)转化细胞培养：使用步骤(2)所得的种子培养液，按体积百分比6％的接种量接入转化培养基中，在30℃条件下，120转/分钟振荡培养40小时；
(4)转化：使用步骤(3)所得的转化细胞培养液，加入10克/升的异丁香酚，在30℃条件下，120转/分钟振荡培养120小时；
(5)香兰素浓度检测：转化样品经分析纯乙酸丁酯萃取后使用瓦里安3380气相色谱仪检测香兰素浓度，最终香兰素浓度达到3.2克/升，摩尔转化率为34.5％。
在上述利用短小芽孢杆菌转化异丁香酚生产天然香兰素的方法中，种子培养使用的添加质量体积比为1％葡萄糖的LB液体培养基配方为：酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，氯化钠5克/升，调节pH至7.0。115℃条件下灭菌20分钟。LB固体培养基配方为在LB液体培养基基础上添加质量体积比1.6％的琼脂。
在上述利用短小芽孢杆菌转化异丁香酚生产天然香兰素的方法中，菌株转化异丁香酚生产香兰素使用的转化培养基，配方为：葡萄糖32克/升，酵母粉14克/升，硫酸镁0.8克/升，氯化钠0.2克/升，调节pH至7.0。115℃条件下灭菌20分钟。
实施例4：
Bacillus pumilus S-1CCTCC M 205165菌体在种子培养15小时后以6％接种量接入转化培养基中，菌体培养30小时后加入10克/升异丁香酚，在30℃条件下120转/分钟振荡培养。120小时后取样测定香兰素浓度。
本实施例涉及的Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165转化异丁香酚生产天然香兰素，其涉及的详细步骤如下：
(1)斜面培养：将Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165接种到添加1％的葡萄糖的LB固体培养基上，在30℃条件下静置培养20小时；
(2)制备种子培养液：用步骤(1)所得的斜面培养物，接种到添加质量体积比为1％葡萄糖的LB液体培养基中，在30℃条件下，120转/分钟振荡培养15小时，制得种子培养液；
(3)转化细胞培养：使用步骤(2)所得的种子培养液，按体积百分比6％的接种量接入转化培养基中，在30℃条件下，120转/分钟振荡培养20小时；
(4)转化：使用步骤(3)所得的转化细胞培养液，加入10克/升的异丁香酚，在30℃条件下，120转/分钟振荡培养120小时；
(5)香兰素浓度检测：转化样品经分析纯乙酸丁酯萃取后使用瓦里安3380气相色谱仪检测香兰素浓度，最终香兰素浓度达到3.79克/升，摩尔转化率为40.5％。
在上述利用短小芽孢杆菌转化异丁香酚生产天然香兰素的方法中，种子培养使用的添加质量体积比为1％葡萄糖的LB液体培养基配方为：酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，氯化钠5克/升，调节pH至7.0。115℃条件下灭菌20分钟。LB固体培养基配方为在LB液体培养基基础上添加质量体积比1.6％的琼脂。
在上述利用短小芽孢杆菌转化异丁香酚生产天然香兰素的方法中，菌株转化异丁香酚生产香兰素使用的转化培养基配方为：葡萄糖32克/升，酵母粉14克/升，硫酸镁0.8克/升，氯化钠0.2克/升，调节pH至7.0。115℃条件下灭菌20分钟。
实施例5：
Bacillus pumilus S-1CCTCC M 205165菌体在种子培养15小时后以6％接种量接入转化培养基中，菌体培养30小时后加入10克/升异丁香酚，在35℃条件下120转/分钟振荡培养。120小时后取样测定香兰素浓度。
本实施例涉及的Bacillus pumilus S-1CCTCC M 205165转化异丁香酚生产天然香兰素，其涉及的详细步骤如下：
(1)斜面培养：将Bacillus pumilus S-1CCTCC M 205165接种到添加1％的葡萄糖的LB固体培养基上，在30℃条件下静置培养20小时；
(2)制备种子培养液：用步骤(1)所得的斜面培养物，接种到添加质量体积比为1％葡萄糖的LB液体培养基中，在30℃条件下，120转/分钟振荡培养15小时，制得种子培养液；
(3)转化细胞培养：使用步骤(2)所得的种子培养液，按体积百分比6％的接种量接入转化培养基中，在30℃条件下，120转/分钟振荡培养20小时；
(4)转化：使用步骤(3)所得的转化细胞培养液，加入10克/升的异丁香酚，在35℃条件下，120转/分钟振荡培养120小时；
(5)香兰素浓度检测：转化样品经分析纯乙酸丁酯萃取后使用瓦里安3380气相色谱仪检测香兰素浓度，最终香兰素浓度达到3.57克/升，摩尔转化率为38.5％。
在上述利用短小芽孢杆菌转化异丁香酚生产天然香兰素的方法中，种子培养使用的添加质量体积比为1％葡萄糖的LB液体培养基配方为：酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，氯化钠5克/升，调节pH至7.0。115℃条件下灭菌20分钟。LB固体培养基配方为在LB液体培养基基础上添加质量体积比1.6％的琼脂。
在上述利用短小芽孢杆菌转化异丁香酚生产天然香兰素的方法中，菌株转化异丁香酚生产香兰素使用的转化培养基配方为：葡萄糖32克/升，酵母粉14克/升，硫酸镁0.8克/升，氯化钠0.2克/升，调节pH至7.0。115℃条件下灭菌20分钟。
实施例6：
Bacillus pumilus S-1CCTCC M 205165菌体在种子培养15小时后以6％接种量接入转化培养基中，菌体培养30小时后加入10克/升异丁香酚，在37℃条件下120转/分钟振荡培养。120小时后取样测定香兰素浓度。
本实施例涉及的Bacillus pumilus S-1CCTCC M 205165转化异丁香酚生产天然香兰素，其涉及的详细步骤如下：
(1)斜面培养：将Bacillus pumilus S-1CCTCC M 205165接种到添加1％的葡萄糖的LB固体培养基上，在30℃条件下静置培养20小时；
(2)制备种子培养液：用步骤(1)所得的斜面培养物，接种到添加质量体积比为1％葡萄糖的LB液体培养基中，在30℃条件下，120转/分钟振荡培养15小时，制得种子培养液；
(3)转化细胞培养：使用步骤(2)所得的种子培养液，按体积百分比6％的接种量接入转化培养基中，在30℃条件下，120转/分钟振荡培养30小时；
(4)转化：使用步骤(3)所得的转化细胞培养液，加入10克/升的异丁香酚，在37℃条件下，120转/分钟振荡培养120小时；
(5)香兰素浓度检测：转化样品经分析纯乙酸丁酯萃取后使用瓦里安3380气相色谱仪检测香兰素浓度，最终香兰素浓度达到3.4克/升，摩尔转化率为36.7％。
在上述利用短小芽孢杆菌转化异丁香酚生产天然香兰素的方法中，种子培养使用的添加质量体积比为1％葡萄糖的LB液体培养基配方为：酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，氯化钠5克/升，调节pH至7.0。115℃条件下灭菌20分钟。LB固体培养基配方为在LB液体培养基基础上添加质量体积比1.6％的琼脂。
在上述利用短小芽孢杆菌转化异丁香酚生产天然香兰素的方法中，菌株转化异丁香酚生产香兰素使用的转化培养基配方为：葡萄糖32克/升，酵母粉14克/升，硫酸镁0.8克/升，氯化钠0.2克/升，调节pH至7.0。115℃条件下灭菌20分钟。
实施例7：
Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165菌体在种子培养15小时后以6％接种量接入转化培养基中，菌体培养30小时后加入10克/升异丁香酚，在30℃条件下120转/分钟振荡培养。90小时后取样测定香兰素浓度。
本实施例涉及的Bacillus pumilus S-1CCTCC M 205165转化异丁香酚生产天然香兰素，其涉及的详细步骤如下：
(1)斜面培养：将Bacillus pumilus S-1CCTCC M 205165接种到添加1％葡萄糖的LB固体培养基上，在30℃条件下静置培养20小时；
(2)制备种子培养液：用步骤(1)所得的斜面培养物，接种到添加质量体积比为1％葡萄糖的LB液体培养基中，在30℃条件下，120转/分钟振荡培养15小时，制得种子培养液；
(3)转化细胞培养：使用步骤(2)所得的种子培养液，按体积百分比6％的接种量接入转化培养基中，在30℃条件下，120转/分钟振荡培养20小时；
(4)转化：使用步骤(3)所得的转化细胞培养液，加入10克/升的异丁香酚，在30℃条件下，120转/分钟振荡培养90小时；
(5)香兰素浓度检测：转化样品经分析纯乙酸丁酯萃取后使用瓦里安3380气相色谱仪检测香兰素浓度，最终香兰素浓度达到2.25克/升，摩尔转化率为24.3％。
在上述利用短小芽孢杆菌转化异丁香酚生产天然香兰素的方法中，种子培养使用的添加质量体积比为1％葡萄糖的LB液体培养基配方为：酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，氯化钠5克/升，调节pH至7.0。115℃条件下灭菌20分钟。LB固体培养基配方为在LB液体培养基基础上添加质量体积比1.6％的琼脂。
在上述利用短小芽孢杆菌转化异丁香酚生产天然香兰素的方法中，菌株转化异丁香酚生产香兰素使用的转化培养基配方为：葡萄糖32克/升，酵母粉14克/升，硫酸镁0.8克/升，氯化钠0.2克/升，调节pH至7.0。115℃条件下灭菌20分钟。
实施例8：
Bacillus pumilus S-1CCTCC M 205165菌体在种子培养15小时后以6％接种量接入转化培养基中，菌体培养30小时后加入10克/升异丁香酚，在30℃条件下120转/分钟振荡培养。150小时后取样测定香兰素浓度。
本实施例涉及的Bacillus pumilus S-1CCTCC M 205165转化异丁香酚生产天然香兰素，其涉及的详细步骤如下：
(1)斜面培养：将Bacillus pumilus S-1CCTCC M 205165接种到添加1％葡萄糖的LB固体培养基上，在30℃条件下静置培养20小时；
(2)制备种子培养液：用步骤(1)所得的斜面培养物，接种到添加质量体积比为1％葡萄糖的LB液体培养基中，在30℃条件下，120转/分钟振荡培养15小时，制得种子培养液；
(3)转化细胞培养：使用步骤(2)所得的种子培养液，按体积百分比6％的接种量接入转化培养基中，在30℃条件下，120转/分钟振荡培养30小时；
(4)转化：使用步骤(4)所得的转化细胞培养液，加入10克/升的异丁香酚，在30℃条件下，120转/分钟振荡培养150小时；
(5)香兰素浓度检测：转化样品经分析纯乙酸丁酯萃取后使用瓦里安3380气相色谱仪检测香兰素浓度，最终香兰素浓度达到3.15克/升，摩尔转化率为34.0％。
在上述利用短小芽孢杆菌转化异丁香酚生产天然香兰素的方法中，种子培养使用的添加质量体积比为1％葡萄糖的LB液体培养基配方为：酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，氯化钠5克/升，调节pH至7.0。115℃条件下灭菌20分钟。LB固体培养基配方为在LB液体培养基基础上添加质量体积比1.6％的琼脂。
在上述利用短小芽孢杆菌转化异丁香酚生产天然香兰素的方法中，菌株转化异丁香酚生产香兰素使用的转化培养基配方为：葡萄糖32克/升，酵母粉14克/升，硫酸镁0.8克/升，氯化钠0.2克/升，调节pH至7.0。115℃条件下灭菌20分钟。
实施例9：
Bacillus pumilus S-1CCTCC M 205165菌体在种子培养15小时后以6％接种量接入转化培养基中，菌体培养30小时后加入5克/升异丁香酚，在30℃条件下120转/分钟振荡培养。120小时后取样测定香兰素浓度。
本实施例涉及的Bacillus pumilus S-1CCTCC M 205165转化异丁香酚生产天然香兰素，其涉及的详细步骤如下：
(1)斜面培养：将Bacillus pumilus S-1CCTCC M 205165接种到添加1％葡萄糖的LB固体培养基上，在30℃条件下静置培养20小时；
(2)制备种子培养液：用步骤(1)所得的斜面培养物，接种到添加质量体积比为1％葡萄糖的LB液体培养基中，在30℃条件下，120转/分钟振荡培养15小时，制得种子培养液；
(3)转化细胞培养：使用步骤(2)所得的种子培养液，按体积百分比6％的接种量接入转化培养基中，在30℃条件下，120转/分钟振荡培养30小时；
(4)转化：使用步骤(3)所得的转化细胞培养液，加入10克/升的异丁香酚，在30℃条件下，120转/分钟振荡培养150小时；
(5)香兰素浓度检测：转化样品经分析纯乙酸丁酯萃取后使用瓦里安3380气相色谱仪检测香兰素浓度，最终香兰素浓度达到1.8克/升，摩尔转化率为23.0％。
在上述利用短小芽孢杆菌转化异丁香酚生产天然香兰素的方法中，种子培养使用的添加质量体积比为1％葡萄糖的LB液体培养基配方为：酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，氯化钠5克/升，调节pH至7.0。115℃条件下灭菌20分钟。LB固体培养基配方为在LB液体培养基基础上添加质量体积比1.6％的琼脂。
在上述利用短小芽孢杆菌转化异丁香酚生产天然香兰素的方法中，菌株转化异丁香酚生产香兰素使用的转化培养基配方为：葡萄糖32克/升，酵母粉14克/升，硫酸镁0.8克/升，氯化钠0.2克/升，调节pH至7.0。115℃条件下灭菌20分钟。
实施例10：
Bacillus pumilus S-1CCTCC M 205165菌体在种子培养15小时后以6％接种量接入转化培养基中，菌体培养30小时后加入15克/升异丁香酚，在30℃条件下120转/分钟振荡培养。转化120小时后取样测定香兰素浓度。
本实施例涉及的Bacillus pumilus S-1CCTCC M 205165转化异丁香酚生产天然香兰素，其涉及的详细步骤如下：
(1)斜面培养：将Bacillus pumilus S-1CCTCC M 205165接种到添加1％葡萄糖的LB固体培养基上，在30℃条件下静置培养20小时；
(2)制备种子培养液：用步骤(1)所得的斜面培养物，接种到添加质量体积比为1％葡萄糖的LB液体培养基中，在30℃条件下，120转/分钟振荡培养15小时，制得种子培养液；
(3)转化细胞培养：使用步骤(2)所得的种子培养液，按体积百分比6％的接种量接入转化培养基中，在30℃条件下，120转/分钟振荡培养30小时；
(4)转化：使用步骤(3)所得的转化细胞培养液，加入20克/升的异丁香酚，在30℃条件下，120转/分钟振荡培养120小时；
(5)香兰素浓度检测：转化样品经分析纯乙酸丁酯萃取后使用瓦里安3380气相色谱仪检测香兰素浓度，最终香兰素浓度达到4.8克/升，摩尔转化率为34.5％。
在上述利用短小芽孢杆菌转化异丁香酚生产天然香兰素的方法中，种子培养使用的添加质量体积比为1％葡萄糖的LB液体培养基配方为：酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，氯化钠5克/升，调节pH至7.0。115℃条件下灭菌20分钟。LB固体培养基配方为在LB液体培养基基础上添加质量体积比1.6％的琼脂。
在上述利用短小芽孢杆菌转化异丁香酚生产天然香兰素的方法中，菌株转化异丁香酚生产香兰素使用的转化培养基配方为：葡萄糖32克/升，酵母粉14克/升，硫酸镁0.8克/升，氯化钠0.2克/升，调节pH至7.0。115℃条件下灭菌20分钟。
Claims (6)
1.一株短小芽孢杆菌，其特征在于：该菌株名为Bacillus pumilus S-1，于2006年1月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 205165，该短小芽孢杆菌Bacillus pumilusS-1 CCTCC M 205165的特征是：革兰氏阳性，好氧，产芽孢，菌落淡黄色、平坦、不透明，可利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇、果糖产酸，不能水解淀粉，不能利用硝酸盐，不能利用3-酮基乳糖，接触酶阳性，明胶液化阳性，其16S rDNA序列与多株短小芽孢杆菌的16S rDNA序列相似性达到100％。
2.一株短小芽孢杆菌在生物转化异丁香酚生产天然香兰素中的应用，其方法涉及的步骤如下：
(1)斜面培养：将Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165接种到添加质量体积比为1％葡萄糖的LB固体培养基上，在30℃条件下静置培养20小时，其中LB固体培养基为在LB液体培养基基础上添加质量体积比为1.6％的琼脂;
(2)制备种子培养液：用步骤(1)所得的斜面培养物，接种到添加质量体积比为1％的葡萄糖的LB液体培养基中，在30℃条件下，120转/分钟振荡培养15小时，制得种子培养液，其中LB液体培养基配方为：酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，氯化钠5克/升，调节pH至7.0；
(3)转化细胞培养：使用步骤(2)所得的种子培养液，按体积百分比6％的接种量接入转化培养基中，在30℃条件下，120转/分钟振荡培养20～40小时，其中转化培养基配方为：葡萄糖32克/升，酵母粉14克/升，硫酸镁0.8克/升，氯化钠0.2克/升，调节pH至7.0；
(4)转化：使用步骤(3)所得的转化细胞培养液，加入1～20克/升异丁香酚，在28℃～37℃条件下，120转/分钟振荡培养70～150小时。
3.如权利要求2所述的短小芽孢杆菌在生物转化异丁香酚生产天然香兰素中的应用，其特征在于：步骤(3)中所述的转化细胞培养时间是25～35小时。
4.如权利要求2所述的短小芽孢杆菌在生物转化异丁香酚生产天然香兰素中的应用，其特征在于：步骤(4)中所述的转化温度是30～37℃。
5.如权利要求2所述的短小芽孢杆菌在生物转化异丁香酚生产天然香兰素中的应用，其特征在于：步骤(4)中所述的异丁香酚的加入量为5～15克/升。
6.如权利要求2所述的短小芽孢杆菌在生物转化异丁香酚生产天然香兰素中的应用，其特征在于：步骤(4)中所述的培养时间为90～150小时。
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