CN101475920B

CN101475920B - 一种治疗烧伤的短小芽孢杆菌及其代谢产物的制备方法

Info

Publication number: CN101475920B
Application number: CN2008102397617A
Authority: CN
Inventors: 闫海; 关珊珊
Original assignee: University of Science and Technology Beijing USTB
Current assignee: University of Science and Technology Beijing USTB
Priority date: 2008-12-16
Filing date: 2008-12-16
Publication date: 2010-11-10
Anticipated expiration: 2028-12-16
Also published as: CN101475920A

Abstract

一种治疗烧伤的短小芽孢杆菌及其代谢产物的制备方法，属于生物技术领域。该方法采用短小芽孢杆菌USTB-06(Bacilluspumilus USTB-06)(菌种保藏号：CGMCC No.2703，菌种保藏日：2008年10月14日)，经过短小芽孢杆菌培养基培养短小芽孢杆菌4～5天后，通过离心取上清液，经高温高压灭菌后，即可获得短小芽孢杆菌代谢产物发酵液。短小芽孢杆菌代谢产物发酵液主要用于治疗烧伤，不仅能够明显抑制导致烧伤伤口创面感染的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的生长，而且可以通过喷洒于烧伤伤口创面达到防止感染和促进伤口愈合的效果。

Description

一种治疗烧伤的短小芽孢杆菌及其代谢产物的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，提供一种培养短小芽孢杆菌USTB-06代谢产物的制备方法，此代谢产物发酵液在防止烧伤创面感染，促进创面快速结痂愈合，降低伤口愈后留疤率方面具有重要的应用价值和前景。

背景技术

烧伤是一种常见病、多发病，也是致残率较高的创伤性疾病。据调查，每年烧伤人群的发病率为2％人次，留疤率为30％左右。目前，临床烧伤常采用先进行创面早期处理，然后采用包扎疗法或暴露疗法进行治疗。清理烧伤创面所选用的抗感染药物主要有三类：一是中草药制剂如四季青、毛冬青、黄连、黄柏、桉树叶等。二是化学药物制剂如双氧水、新洁尔灭、甲磺灭脓等。三是抗生素制剂如青霉素、庆大霉素等。在治疗过程中，包扎疗法是用经灭菌吸水的厚敷料包扎创面，使之与外界隔离以保护创面。但存在包扎内层敷料与烧伤伤口创面粘连，且创面潮湿容易诱发感染等不足之处。暴露疗法是将烧伤创面直接暴露于空气中，使创面的渗液及坏死组织干燥成痂，以暂时保护创面。此法虽然在一定程度上可以防止感染，但存在对外部环境无菌要求高，并导致淤滞区组织干枯坏死治愈时间长等缺点。

如上所述，由于大多数清创药物均可从创面吸收，一次大面积使用这些药物，尤其是浓度过大可引起中毒或内脏损害。另外，这些药物在制备和使用时由于使用有机试剂而常常造成环境污染；同时因为药物具有一定的刺激性，在使用时会给患者增加痛苦。而在治疗过程中，因缺少治愈烧伤的特效药物，疗效不尽如人意，愈合后多出现瘢痕甚至形成各种挛缩畸形，一直是烧伤外科学领域研究与治疗的重点和难点。因此研究开发既能够避免烧伤创面感染，又能够促进烧伤创面尽快愈合，有效控制后期瘢痕增生的安全无污染、绿色环保、治疗烧伤的高效药物具有非常重要的应用价值。

本实验室研究开发的短小芽孢杆菌代谢产物发酵液，具有明显抑制导致烧伤创面感染的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的生长的特点，能促进白鼠深二度烧伤创面快速结痂愈合，降低伤口愈后留疤率，不仅在治愈烧伤方面具有重要的应用价值，而且具有制备过程安全无污染，制备流程简单易行，产品稳定，容易保存，便于使用的特点。

目前，国内外尚无有关短小芽孢杆菌代谢产物发酵液治愈烧伤方面的相关研究和报道，而与市面上现已推出的枯草芽孢杆菌活菌制剂相比，短小芽孢杆菌代谢产物发酵液具有明显加快烧伤创面愈合，疗效好的优点。

发明内容

本发明通过筛选得到一株短小芽孢杆菌USTB-06，经培养获得代谢产物发酵液，提供一种用于防止烧伤创面感染、促进烧伤创面尽快愈合的生物制剂的制备方法。

采用筛选的1株芽孢杆菌，后经16S rDNA序列比对鉴定为短小芽孢杆菌USTB-06(Bacillus pumilus USTB-06)(保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号CGMCC No.2703，菌种保藏日：2008年10月14日)，配制短小芽孢杆菌USTB-06代谢产物发酵培养基，将培养基在121～130℃下灭菌20～30分钟，再将筛选的短小芽孢杆菌USTB-06接种到培养基中进行摇床培养，培养温度20～40℃，摇床转速200～300rpm。培养4～5天后，将培养物在10000～12000转/分下离心5～30分钟，取上清液进行滤膜过滤，滤液再经120～130℃温度20～30分钟的高温灭菌，即获得代谢产物发酵液。

短小芽孢杆菌USTB-06代谢产物发酵培养基的组成为(g/L)：葡萄糖1.0～10.0，K₂HPO₄·3H₂O 2.0～6.0，MgSO₄ 0.1～1.0，柠檬酸三钠0.1～1.0，CaCl₂ 0.01～0.10，酵母膏5.0～20.0，EDTA-2Na 0.1～1.0，小球藻粉1.0～5.0。

将此代谢产物发酵液用于体外抑菌实验，结果显示，此代谢产物发酵液对导致烧伤创面感染的主要菌群金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的生长具有很强抑制作用，在白鼠烧伤模型实验中，将此代谢产物发酵液直接喷洒在烧伤创面，具有防止白鼠烧伤创面感染，促进创面快速结痂愈合，且无不良反应的效果。

本发明短小芽孢杆菌USTB-06代谢产物发酵液在发酵培养过程中，产生的代谢产物能够抑制其它微生物特别是导致烧伤创面感染的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的生长。其代谢产物主要包括两大类：一是小分子的抗生素；二是大分子的拮抗蛋白或细胞壁降解酶类。芽孢杆菌可以产生有核糖体和非核糖体2类抗生素，但在对烧伤的治愈过程中，主要是通过产生拮抗蛋白或裂解酶来抑制病菌的侵染。另外，短小芽孢杆菌代谢产物中还包含各种不同类型的脂，有些脂类物质与哺乳动物皮肤表面的脂类物质非常相似，可与烧伤伤口创面的水分通过乳化作用产生脂类膜，对烧伤创面进行保护，促进烧伤伤口创面愈合。

本发明生物制剂的主要优点是：1)筛选的短小芽孢杆菌USTB-06容易培养。2)制备短小芽孢杆菌USTB-06发酵液作为治愈烧伤的生物制剂流程简单安全无污染，产品稳定便于存放。3)短小芽孢杆菌USTB-06发酵液抑制导致烧伤伤口感染的主要细菌如金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌作用明显。4)短小芽孢杆菌USTB-06代谢产物发酵液具有防止白鼠烧伤创面感染，促进创面快速结痂愈合的效果，并在治疗过程中尚未发现任何不良反应，具有非常重要的应用价值。

附图说明

图1是短小芽孢杆菌发酵液抑制金黄色葡萄球菌生长的效果。

图2是短小芽孢杆菌发酵液抑制铜绿假单胞菌生长的效果。

图3是采用本发明短小芽孢杆菌代谢产物发酵液对白鼠烧伤的治疗效果。

图4是喷洒无菌去离子水对白鼠烧伤的治疗效果。

具体实施方式

1、菌种：本发明实验所用菌种为筛选的短小芽孢杆菌USTB-06(菌种保藏号CGMCC No.2703，菌种保藏日：2008年10月14日)。在含2.0％琼脂的固体培养基上涂平板，在温度30℃下静置培养2～3天，以长出圆形的短小芽孢杆菌USTB-06单克隆菌落作为菌种。

2、短小芽孢杆菌USTB-06代谢产物发酵液制备：短小芽孢杆菌USTB-06代谢产物发酵培养基，其组成为(g/L)：葡萄糖5.0，K₂HPO₄·3H₂O 3.5，MgSO₄ 0.1，柠檬酸三钠0.2，CaCl₂ 0.01，酵母膏10.0，EDTA-2Na 0.1，小球藻粉1.0。配制的培养基在121℃下灭菌20分钟后在洁净工作台内按1.0％体积接种菌种后进行摇床培养，培养条件是采用500ml三角瓶，装液量100ml，培养温度30℃，摇床转速200rpm。经摇床无光照发酵培养5天后，将培养物在12000转/分下离心10分钟，取上清液进行滤膜(0.22μ)过滤，滤液再经121℃20分钟的高温灭菌，即获得的代谢产物发酵液。

3、短小芽孢杆菌USTB-06发酵液对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌生长的抑制：在含有牛肉膏蛋白胨固体培养基(含2％琼脂)的平板表面分别涂布一层金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌液，然后在每个平板上分别滴加3滴短小芽孢杆菌发酵液后在30℃下培养2天，发现在滴加短小芽孢杆菌发酵液处形成明显的抑菌圈，说明短小芽孢杆菌发酵液可以明显抑制通常导致皮肤烧伤创面感染的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的生长。

4、短小芽孢杆菌USTB-06发酵液对白鼠烧伤的治疗：采用20只雄性免疫实验用清洁级ICR白鼠，规格150～250克/只，分为2组每组10只进行皮肤烧伤模型实验。首先用1.0ml 3.0％戊巴比妥钠腹腔注射以麻醉白鼠，用10％硫化钠溶液在白鼠背部脱毛(面积为体表面积的10％左右)，用无菌去离子水将脱毛部分洗净。用直径4.0cm浸过酒精的滤纸放在大鼠背部脱毛区域，点燃滤纸片燃烧约10秒后，拿走滤纸片，熄灭火焰，鉴定达到深II°烧伤。治疗烧伤实验开始后每天早晚2次在白鼠烧伤处喷洒无菌去离子水2ml作为对照组，而实验组每次喷洒短小芽孢杆菌发酵液2ml。根据不同时间烧伤伤口的结痂程度和长出新毛时间来鉴别短小芽孢杆菌发酵液治愈白鼠烧伤的效果。实验7天后的结果表明，凡是喷洒短小芽孢杆菌发酵液的白鼠，烧伤伤口已经完全愈合并长出新毛，而对于喷洒无菌去离子水对照组的白鼠，其烧伤伤口创面结痂尚未脱落，说明短小芽孢杆菌发酵液具有明显的快速治愈白鼠烧伤的效果。

图1、2是短小芽孢杆菌发酵液抑制金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌生长的效果：在含有牛肉膏蛋白胨固体培养基(含2％琼脂)的平板表面分别涂布一层金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌液，然后在每个平板上分别滴加3滴短小芽孢杆菌发酵液后在30℃下培养2天，发现在滴加短小芽孢杆菌发酵液处没有发现菌苔生长，观察到明显抑菌圈形成(图1和2)，说明短小芽孢杆菌发酵液可以明显抑制通常导致皮肤烧伤创面感染的金黄色葡萄球菌(图1)和铜绿假单胞菌(图2)的生长。

图3、4是短小芽孢杆菌代谢产物发酵液对白鼠烧伤的治疗效果：采用白鼠烧伤模型，每天早晚2次在白鼠烧伤处喷洒无菌去离子水2ml作为对照组，实验组每次喷洒短小芽孢杆菌发酵液2ml。实验7天后的结果表明，凡是喷洒短小芽孢杆菌发酵液的白鼠(图3)，烧伤伤口已经完全愈合并长出新毛，而对于喷洒无菌去离子水对照组的白鼠(图4)，其烧伤伤口创面结痂尚未脱落，说明短小芽孢杆菌发酵液具有明显的快速治愈白鼠烧伤的效果。

Claims

1.一种治疗烧伤的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)USTB-06，其特征在于，短小芽孢杆菌USTB-06，菌种保藏号为CGMCC No.2703，菌种保藏日为2008年10月14日。

2.利用权利要求1短小芽孢杆菌USTB-06制备代谢产物的方法，其特征在于，配制短小芽孢杆菌代谢产物发酵培养基，将培养基在121～130℃下灭菌20～30分钟，再将筛选的短小芽孢杆菌USTB-06接种到培养基中，然后进行摇床培养，培养温度20～40℃，摇床转速200～300rpm，培养4～5天后，将培养物在10000～12000转/分下离心5～30分钟，取上清液进行滤膜过滤，滤液再经120～130℃温度20～30分钟的高温灭菌，获得代谢产物发酵液；

所述短小芽孢杆菌代谢产物发酵培养基的组成为：葡萄糖5.0g/L，K₂HPO₄·3H₂O 3.5g/L，MgSO₄ 0.1g/L，柠檬酸三钠0.2g/L，CaCl₂ 0.01g/L，酵母膏10.0g/L，EDTA-2Na0.1g/L，小球藻粉1.0g/L。