CN1782080A - 短小芽孢杆菌表达系统 - Google Patents

Abstract

本发明属基因工程技术领域，具体提供了一种短小芽孢杆菌中的启动子活性片断F1，及其融合基因构建体，携带该构建体的新的重组表达载体。还涉及所说的随机插入点突变、抗真菌蛋白获得、表达载体转化短小芽孢杆菌细胞，以及由转化细胞产生的抗真菌功能。本发明将所说启动子活性的改良，可抗高达900μg/mL氯霉素，启动子指导下获得的抗真菌蛋白分泌具有一定的抗真菌特性。

Description

短小芽孢杆菌表达系统

技术领域

本发明属于分子生物学、环境微生物学以及基因工程等技术领域，具体涉及一种短小芽孢杆菌表达系统，具体包括启动子活性片断F1、融合基因构建体、携带该构建体的新的组成表达载体。本发明还涉及随机插入点突变的方法和工程菌的抑菌研究。

背景技术

真菌病害是造成农作物产量损失的重要原因之一，利用天然的或经遗传改良的微生物进行植物真菌病害的防治是当前国际上较为活跃的研究领域之一。本发明人已从水稻叶片上分离出一株附生菌DX01，经试验证明该菌具有天然拮抗某些真菌的特性，若能进一步将其定向改造成具有更强抗真菌能力的工程菌，作为生物农药的有效组分，从而可以减少因使用化学农药而造成的环境污染，无疑具有重要的理论和现实意义。

采用PCR技术，亚克隆来自短小芽孢杆菌（Bacillus brevis）DX01菌株总基因组中的启动子活性片段F1，分别构建了大肠杆菌组成型表达载体pUC118-F1gfp和一个大肠杆菌-短小芽孢杆菌穿梭表达载体pHY300-F1gfp，以缺失启动子的绿色荧光蛋白(GFP)基因为报告基因，检测了该片段在大肠杆菌DH5a和短小芽孢杆菌DX01菌株中的启动活性，证实活性片段F1具有组成型启动子的功能，gfp基因在2种宿主细胞中实现了组成型表达。

运用来自噬菌体Mu的转座酶MuA，对启动子F1进行了随机插入突变，从中筛选出13个F1的突变体。对突变体的氯霉素抗性检测表明，与F1对照相比，7个含相应突变体的菌株其氯霉素抗性水平有显著提高，其中突变体Fm3和Fm10抗性提高了3.6倍，可抗高达900μg/mL氯霉素。在启动子F1的DNA序列上，存在着不同插入效应敏感位点，在这些位点附近的插入突变，可使启动活性急剧变化，并且相邻的插入位点，其突变效应可能完全不同。FACS分析表明，在大肠杆菌中表现为启动活性增强的F1突变体，转入短小芽孢杆菌DX01后其活性仍表现为增强。

在本发明中，我们在水稻叶片附生菌短小芽孢杆菌(Bacillus brevis)DX01菌株总基因组中亚克隆到启动子的活性片断F1。

在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及水稻叶片附生菌短小芽孢杆菌(Bacillus brevis)DX01菌株总基因组中启动子的活性片断F1的核苷酸序列。

发明内容

本发明的第一目的就是提供一种新的启动子活性片断F1，该活性片断是一个水稻叶片附生菌短小芽孢杆菌(Bacillus brevis)DX01菌株总基因组中启动子的活性片断。

本发明的第二目的是提供一种新的融合基因构建载体以及携带该构建体的新的组成表达载体。

本发明的第三目的是提供一种利用随机插入点突变获得短小芽孢杆菌表达系统的方法。

本发明的第四目的是提供一种萝卜抗真菌蛋白Rs-AFPs在细菌中的分泌表达，并讨论Rs-afp1基因在大肠杆菌中融合表达的可行性。以便进一步改造成抗真菌工程菌。

本发明还提供了这种随机插入点突变方法对获得短小芽孢杆菌表达系统的应用。

本发明提供了一种分离出的启动子活性片断F1，该活性片断编码具有短小芽孢杆菌(Bacillus brevis)DX01菌株总基因组中启动子活性片断的核苷酸序列，该序列是根据短小芽孢杆菌(Bacillus brevis)DX01菌株总基因组中启动子Pcp01序列(GenBank登录号：AF294434)设计引物，亚克隆得到的474bp的活性片断F1，记为SEQ.ID.NO1。其中，所述序列正向引物引入BamH I酶切位点，反向引物引入Pst I酶切位点及核糖体结合位点。

本发明还提供了一种突变库，它包括：在体外转座反应过程中，质粒pUC118-F1上的任意5碱基序列作为转座位点，最终导致质粒内产生一个15bp的插入序列。其中，10bp因为来自Entranceposon而固定不变，其序列为TGCGGCCGCA；另外的5bp依据转座位点的不同而产生5个重复碱基。本实验随机挑选了227个单克隆，从中筛选到13个不同的F1突变体，以期筛选出转录功能增强的突变体。

本发明还提供了一种萝卜抗真菌蛋白Rs-AFPs基因在大肠杆菌中融合表达的可行性的方法。

本发明还提供了一种短小芽孢杆菌gfp(荧光蛋白基因)基因组成型表达载体pHY300-F1gfp的构建方法，其步骤如下：

(1)用BamH I和Pst I双酶切pGEM-T转化子质粒，切下启动子片段F1，与经同样双酶切的克隆载体pUC118连接，转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆，命名为pUC118-F1；

(2)质粒pSG1164经EcoR I和Xba I双酶切，切下720bp的gfp基因，该基因带有起始密码子ATG，但缺失了木糖诱导型启动子Pxyl，因而不能在大肠杆菌中表达。gfp基因与作同样双酶切的pUC118连接，转化DH5a，重组子命名为pUC118-gfp；

(3)pUC118-F1与pUC118-gfp作Pst I酶切，经去磷酸化后，连接产物转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆，重组体命名为pUC118-F1gfp；

(4)用BamH I和HindIII双酶切pUC118-F1gfp，切下约1.2kb的片段，回收后与经同样双酶切的穿梭载体pHY300PLK连接，连接产物转化大肠杆菌TG1，筛选阳性克隆，经酶切和PCR双重鉴定后，构建好的重组体命名为pHY300-F1gfp；

(5)提取重组子质粒，电击转化短小芽孢杆菌菌株DX01，筛选阳性克隆。经鉴定后保存备用。

在本发明的另一方面，还提供了利用噬菌体Mu的转座机制，将cat基因作报告基因，建立了一种启动子随机插入突变筛选体系，通过宿主菌的氯霉素抗性变化以及CAT蛋白总量变化来筛选活性增强的突变启动子的方法，其步骤如下：

(1)以质粒pUC118-F1gfp或pHY300-F1gfp为模板，采用PCR方法扩增组成型启动子F1，所用引物对为A00780和A00781，外加酶切位点，克隆到pGEM-T载体上；

(2)用BamH I和Pst I双酶切pGEM-T转化子质粒，切下启动子片段F1，与经同样双酶切的克隆载体pUC118连接，转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆，命名为pUC118-F1；

(3)转化感受态DH5a，筛选阳性克隆，初选出的阳性转化子再用F1引物作PCR鉴定，以确保插入位点在启动子中间，而不是在载体上。提取转化子质粒，用BamH I和Pst I双切出突变启动子，经凝胶回收，重新克隆到载体pUC118上，筛选双抗转化子，提取质粒，Not I酶切掉Entranceposon，连接后转化DH5a，筛选阳性克隆，测序，得到的含启动子F1突变体的重组载体记为pUC118-FmX，其中X为转化子编号；

(4)F1随机插入突变体Cm抗性水平的测定；

(5)短小芽孢杆菌DX01表达载体pHY300-FmX′gAFP的构建。

以表达载体pUC118-F1gfp为模板，设计PCR引物，扩增出1.2kb的F1-gfp片段，经BamHI和SalI双切后，与同样双酶切过的质粒pUC118-Flgfp连接，转化DH5a，得到重组质粒pUC118-F1′gfp。提取萝卜总RNA，通过RT-PCR方法扩增出243bp的萝卜抗真菌蛋白基因1(Rs-AFP1)cDNA；由于载体pUC118-F1′gfp上有两个PstI酶切位点，通过SalI+HindIII酶切Rs-AFP1cDNA，连入同样双切过的pUC118-F1′gfp上的gfp基因的3′末端，构成融合表达载体pUC118-F1′gAFP；以质粒ECE7-FmX DNA为模板，扩增出各突变启动子FmX，经BamHI和PstI双切后，克隆到pUC118-F1′gAFP上，替换启动子F1，构建成系列表达载体pUC118-FmX′gAFP；最后，BamHI+HindIII双酶切pUC118-FmX′gAFP，切下约1.4kb FmX-gAFP大片段，克隆到穿梭载体pHY300PLK上，得到表达载体pHY300-FmX′gAFP；电击转化DX01菌，得到系列转化子，通过FACS分析确认各突变启动子在短小芽孢杆菌中的启动强度。

本发明还提供了萝卜抗真菌蛋白Rs-AFPs在细菌中的分泌表达的方法，其步骤如下：

(1)抽提萝卜幼苗总DNA，PCR克隆萝卜抗真菌蛋白1(Rs-AFP1)基因；

(2)构建表达载体pUC118-F1SPAFP以及Rs-AFP1蛋白融合表达载体；

(3)工程菌活性鉴定；

(4)短小芽孢杆菌DX01菌株对玉米小斑病病原菌的拮抗作用。

在本发明中，术语“噬菌体Mu专座机制”指将一个记为Entranceposon(1254bp)的人工转座子随机插入到靶质粒的任意位点，体外转座反应仅由MuA转座酶催化完成。转座反应所产生的插入克隆通过稀有酶NotI酶切以去除Entranceposon，酶切产物自连后通过大肠杆菌自身的修复作用在靶DNA上产生一个15bp的碱基插入。如果转座子插入到靶基因的编码区内，则产生5个额外氨基酸。

本发明还提供了一种鉴定短小芽孢杆菌表达系统活性的方法，其步骤如下：

(1)通过PCR扩增的方法扩增到短小芽孢杆菌(Bacillus brevis)DX01菌株总基因组中启动子的活性片断F1；

(2)构建原核表达gfp基因组成型表达载体，进行荧光检测；

(3)启动子活性片段F1随机插入突变，并进行氯霉素抗性检测；

(4)该启动子指导下获得的萝卜抗真菌蛋白分泌具有一定的抗真菌特性。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒等。

本发明的启动子活性片断F1可以通过PCR扩增法获得。即根据短小芽孢杆菌(Bacillusbrevis)DX01菌株总基因组中启动子Pcp01序列(GenBank登录号：AF294434)设计引物，亚克隆得到474bp的活性片断F1(SEQ.ID.NO1)。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。通常是将其克隆入载体，在转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离到有关序列。

本发明的萝卜抗真菌蛋白1(Rs-AFP1)基因全序列(SEQ.ID.NO2)可以通过RT-PCR的方法敲除其内含子，得到Rs-afp1 cDNA，全长243bp。该cDNA片段与gfp基因一起可构建成AFP-GFP融合蛋白表达载体。

最终，本发明的工程菌DH5a∷pUC118-F1SPAFPT7与BL21∷pET-F1SPAFPT7两者差异明显，前者与对照相比，具有拮抗真菌作用，真菌数/板平均减少了23.3％，后者则无抑制真菌的作用。DX01∷pHY300-F1SPAFPT7较之DX01，拮抗真菌能力更强，真菌数/板平均减少了26.1％。

附图说明

图1为本发明的gfp基因在大肠杆菌中的组成型表达。

图2为本发明的gfp基因在短小芽孢杆菌中实现组成型表达，发出明亮的绿色荧光。

图3DX01菌株对玉米小斑病病原菌的拮抗曲线。

图4为本发明的大肠杆菌与短小芽孢杆菌工程菌抗真菌的相对活力测定。

图5为本发明的为改造的工程菌抗真菌生长。

表1为本发明的启动子F1各转座突变体的活性测定。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验手册(NewYork：Cold Spring Harbor Labortary Press，1989)中所叙述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1，短小芽孢杆菌组成型启动子活性片段F1的亚克隆

根据曹清玉等(2001)发表的短小芽孢杆菌DX01菌株的启动子pCP01序列(GenBank登录号：AF294434)设计PCR引物，亚克隆其中一段长为474bp的活性片段F1(SEQ.ID.NO1)。

实施例2，短小芽孢杆菌gfp基因组成型表达载体pHY300-F1gfp的构建

双酶切pGEM-T转化子质粒，切下启动子片段F1，与经同样双酶切的克隆载体pUC118连接，转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆，。质粒pSG1164经双酶切，切下720bp的gfp基因，该基因带有起始密码子ATG，但缺失了木糖诱导型启动子Pxyl，因而不能在大肠杆菌中表达。gfp基因与pUC118连接，转化DH5a，经去磷酸化后，连接产物转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆。

双酶切pUC118-F1gfp，切下约1.2kb的片段，回收后与经同样双酶切的穿梭载体pHY300PLK连接，连接产物转化大肠杆菌TG1，筛选阳性克隆，经酶切和PCR双重鉴定后，构建好的重组体。提取重组子质粒，电击转化短小芽孢杆菌菌株DX01，筛选阳性克隆，经鉴定后保存备用。

实施例3，荧光检测

挑取含表达质粒DX01单菌落，37℃，250r/min振荡过夜，然后接种于50mL含相应抗生素的LB液体培养基中，摇菌，置于4℃冰箱中数小时至过夜，4000r/min离心15min，收集细菌沉淀，用PBS缓冲液洗涤2次后，重悬于30mL PBS中。取5～10μL菌液涂片，在OLYMPUS荧光显微镜下观察，激发光为485nm并照像。

实施例4，启动子活性片段F1随机插入突变

双酶切pGEM-T转化子质粒，切下启动子片段F1，与经同样双酶切的克隆载体pUC118连接，转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆，。以克隆在载体pUC118上的F1为靶DNA，设立转座反应体系。30℃反应1hr，75℃灭活10min。取5-10μL反应液转化感受态DH5a，在10μg/mL Cm和100μg/mL Amp平板上筛选阳性克隆，初选出的阳性转化子再用F1引物作PCR鉴定。提取转化子质粒，用双酶切切出突变启动子，经凝胶回收，重新克隆到载体pUC118上，筛选双抗转化子，提取质粒，切掉Entranceposon，连接后转化DH5a，在100μg/mL Amp平板上筛选阳性克隆，测序，得到的含启动子F1突变体的重组载体。

实施例5，F1随机插入突变体Cm抗性水平的测定

以各突变体质粒为模板，重新设计PCR引物，引物均加上EcoRI位点。PCR产物经EcoRI酶切后回收，然后与同样酶切过启动子探针载体ECE7连接，在附加10μg/mL Nm和10μg/mL Cm平板上筛选双抗转化子，测定各突变体最高Cm抗性。

测定方法：

挑单克隆，摇菌，分别在附加有不同浓度梯度的Cm LB培养基中培养，37℃，24hr内，取Cm最低抑制浓度(Minimum inhibitory concentration，MIC)记值，实验重复三次，以ECE7-F1重组载体作对照。

实施例6，萝卜抗真菌蛋白1(Rs-AFP1)基因在大肠杆菌中的融合表达

1.萝卜幼苗总RNA的提取

取新鲜的心叶材料，液氮充分研磨，加Trizol，用力摇15s，然后室温放置5min。4℃，12000r/min离心10min，转移上清至新的Eppendorf管，加0.2mL氯仿，用力摇15s，室温放置2～3min。4℃，13000r/min离心15min，上清转移至新的Eppendorf管，加等体积异丙醇，充分混合10min。4℃，13000r/min离心10min，弃上清，用DEPC配制的75％乙醇1mL洗涤，7500r/min离心30s，重复两次。室温干燥5～10min，溶于30～50μLDEPC水中，测OD值，电泳检测。

2.RT-PCR扩增Rs-afp1 cDNA

取1μL Rs-afp1 cDNA第一链的合成产物为模板，设计引物，作常规PCR反应，扩增无内含子的Rs-afp1基因。

3.表达载体pHY300-F1SP′Agfp的构建

(1)扩增Rs-afp1 cDNA片段，以人工设计的B.brevis中壁蛋白信号肽序列(MWPSP)替换掉Rs-afp1基因自身信号肽Rs-afp1完整的cDNA含有243bp，B.brevis中壁蛋白信号肽序列(MWPSP)来自GenBank数据库(登录号：E02644)。

(2)pUC118-F1′gAFP和以质粒pUC118-F1′gAFP DNA为模板所得到的扩增片段经PstI+HindIII双酶切后，连接，转化DH5a，得到转化子，命名为pUC118-F1SPAFP。以pUC118-F1SPAFP为模板，设计引物带有T7终止子。扩增产物经双酶切后，分别克隆入载体pUC118-F1SPAFP、pET-24(a)和pHY300PLK，转化子相应记为pUC118-F1SPAFPT7、pET-F1SPAFPT7和pHY300-F1SPAFPT7。

(3)以pUC118-F1SPAFP为模板，扩增大片段F1-SP-′AFP，该基因的终止密码子被突变掉，扩增产物经双酶切后，克隆到pUC118-F1gfp上，转化子记为pUC118-F1SP′AFP。

(4)以pUC118-F1gfp为模板，扩增gfp基因，扩增产物经双酶切后，克隆入载体pUC118-F1SP′AFP，重组载体记为pUC118-F1SP′Agfp。

(5)以pUC118-F1SP′Agfp为模板，扩增大片段F1-SP-′Agfp，扩增产物经双酶切，克隆到大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭载体pHY300PLK上，表达载体记为pHY300-F1SP′Agfp。

4.工程菌活性鉴定

(1)PDA真菌培养平板的铺制

挑取适当大小的玉米小斑病菌块，加入无菌水，在涡旋器上充分振荡，制成孢子悬液。同时，铺制固体培养基。加入链霉素(Str)，倒平板。凝固后，按每100mL培养基加入3mL孢子悬液的比例加入孢子液，涂布平板。

(2)抑菌试验

分别挑取大肠杆菌工程菌DH5a∷pUC118-F1SPAFPT7、BL21∷pET-F1SPAFPT7以及短小芽孢杆菌工程菌DX01∷pHY300-F1SPAFPT7单克隆，于37℃分别接种5mL表达培养基中，250r/min摇菌过夜。转接表达培养基，250r/min培养2hr后，加入终浓度为1mmol/LPMSF(苯甲基磺酰氟)，继续摇菌12hr，分别取1mL工程菌液离心，离心后上清液进一步用滤膜除菌。最后，取无菌300μL上清涂布(1)所铺制好的真菌培养板，同时加入链霉素和PMSF，置于4℃冰箱过夜，以使工程菌上清液完全渗透到整个平板中。然后，在28℃培养箱中暗培养48hr，测定抑菌圈大小。同时，以不含载体的各宿主菌为阴性对照，处理方法相同，设三次重复，结果取平均值。

(3)平板记数法测定工程菌相对抑菌活性

挑取直径约为0.6cm的真菌块，制成孢子悬浮液，取100μL 10-1～10-6的梯度稀释液，涂布含100μg/mL Str的PDA平板，于28℃暗培养48hr，统计单菌落数，以确定真菌孢子的最佳稀释度。然后，按每100mL 2％PDA固体培养基加入3mL工程菌的比例加入各工程菌，制成含Str平板，取最佳稀释度的孢子悬浮液100μL涂布，48hr后记数。

5.短小芽孢杆菌DX01菌株对玉米小斑病病原菌的拮抗作用

取过夜培养的DX01菌200μL涂布平板，待菌液完全渗透入培养基后，挑取一直径约为0.3cm的真菌块，置于PDA平板中央，28℃暗培养，每天测定真菌斑大小。同时，接种同样大小的真菌块于PDA培养基上，作为阴性对照，各培养5皿，菌斑大小取平均值。

表1启动子F1各转座突变体的活性测定

突变启动子	MIC(μg/mL)	CAT合成量(pg/mL)
			F1(CK)Fm-1Fm-2Fm-3Fm-4Fm-5Fm-6Fm-7Fm-8Fm-9Fm-10Fm-11Fm-12Fm-13	25015055090055030060550550250900150150250	880856887923916884866877917895930810850905

                         序列表

SEQ.ID.NO1启动子活性片段F1的PCR亚克隆序列

----TGCCACAATTCTTCCAAATACCAACGATCCGATTAATGGCAGAATATATCGACCAAGC

AGACACTGCTGCTTATCATGCGATTGAAAAAGCCGAAATGAAGGAGCATTATCCTCTGTC

GTCTGCGCAAAAACGGTTGTATCTCATGCAGCAAATGGATGTAAGCAGCACAGGATACAA

CGAATTTAAAGCAGGACGAATTAAAGGAAGGCTCGATATCAACAGGTTGGAATGGGCATT

TCAGCAGCTTATAAAGAGACACGAAAGTTTGCGAACAGCGTTTGTACTAGAGAATGGCGT

CCCTTTTCAAAAGATTGAAGAAGAGGTACCATTTGCAGTCACGTTGTTTGACCTCACAGAGGGAT

CGACACAAGGATCTGAGGAAGATCAAAAACAAGTGATTGAACAATTTTTGACTGC

CTTTACGTTAAGTGAGGCTCCATTGATGAGAGTTGGTGTG ATGAAGCTGG CAGAAG-------

SEQ.ID.NO2“穿心红”萝卜抗真菌蛋白1(Rs-AFP1)基因全序列

TAGTGATCGGTGAGTAGTGACCTGCTTATCACATGCT

GCGCATGAAAAATTAGATTTGTAGTTTTTT

TTAGTTTTCATATTAATTTGATATCTAACCTTGTGAGATCTATGTATTTACACAGAAGTTGTGCGA

AAGGCCAAGTGGGACATGGTCAGGAGTCTGTGGAAACAATAACGCATGCAAGAATCAGTG

ATTAACCTT

GAGAAAGCACGACATGGATCTTGCAACTATGTCTTCCCAGCTCACAAGTGTATCTGCTACTTTCC

TTGTTAA

Claims (7)

1、一种分离出的启动子活性片断F1，其特征在于，它编码具有一个水稻叶片附生菌短小芽孢杆菌(Bacillus brevis)DX01菌株总基因组中启动子的活性片断，所述的活性片断的核苷酸序列根据短小芽孢杆菌(Bacillus brevis))DX01菌株总基因组中启动子Pcp01序列(GenBank登录号：AF294434)设计引物，亚克隆得到，长度为474bp，记为SEQ.ID.NO1。

2、如权利要求1所述的启动子活性片断F1，其特征在于，在该启动子指导下获得的萝卜抗真菌蛋白分泌具有抗真菌特性。

3、一种短小芽孢杆菌gfp基因组成型表达载体的构建方法，其特征在于具体步骤如下：

(1)用BamHI和PstI双酶切pGEM-T转化子质粒，切下启动子片段F1，与经同样双酶切的克隆载体pUC118连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，命名为pUC118-F1；

(2)质粒pSG1164经EcoRI和XbaI双酶切，切下720bp的gfp基因，该基因带有起始密码子ATG，但缺失了木糖诱导型启动子Pxyl，gfp基因与作同样双酶切的pUC118连接，转化DH5α，重组子命名为pUC118-gfp；

(3)pUC118-F1与pUC118-gfp作PstI酶切，经去磷酸化后，连接产物转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，重组体命名为pUC118-F1gfp；

(4)用BamHI和HindIII双酶切pUC118-F1gfp，切下约1.2kb的片段，回收后与经同样双酶切的穿梭载体pHY300PLK连接，连接产物转化大肠杆菌TG1，筛选阳性克隆，经酶切和PCR双重鉴定后，构建好的重组体命名为pHY300-F1gfp；

(5)提取重组子质粒，电击转化短小芽孢杆菌菌株DX01，筛选阳性克隆。

4、一种筛选活性增强的突变启动子的方法，其特征在于具体步骤如下：

(1)以质粒pUC118-F1gfp或pHY300-F1gfp为模板，采用PCR方法扩增组成型启动子F1，所用引物对为A00780和A00781，外加酶切位点，克隆到pGEM-T载体上；

(2)用BamHI和PstI双酶切pGEM-T转化子质粒，切下启动子片段F1，与经同样双酶切的克隆载体pUC118连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，命名为pUC118-F1；

(3)转化感受态DH5α，筛选阳性克隆，初选出的阳性转化子再用F1引物作PCR鉴定，以确保插入位点在启动子中间，提取转化子质粒，用BamHI和PstI双切出突变启动子，经凝胶回收，重新克隆到载体pUC118上，筛选双抗转化子，提取质粒，NotI酶切掉Entranceposon，连接后转化DH5α，筛选阳性克隆，测序，得到的含启动子F1突变体的重组载体记为pUC118-FmX，其中X为转化子编号；

(4)F1随机插入突变体Cm抗性水平的测定；

(5)短小芽孢杆菌DX01表达载体pHY300-FmX′gAFP的构建。

5、一种萝卜抗真菌蛋白Rs-AFPs在细菌中分泌表达的方法，其特征在于具体步骤如下：

(1)抽提萝卜幼苗总DNA，PCR克隆萝卜抗真菌蛋白1(Rs-AFP1)基因；

(2)构建表达载体pUC118-F1SPAFP以及Rs-AFP1蛋白融合表达载体；

(3)工程菌活性鉴定；

(4)短小芽孢杆菌DX01菌株对玉米小斑病病原菌的拮抗作用。

6、一种载体，其特征在于，它包含权利要求1所述的启动子活性片断F1。

7、一种鉴定短小芽孢杆菌表达系统活性的方法，其特征在于其步骤如下：

(1)通过PCR扩增的方法扩增到短小芽孢杆菌(Bacillus brevis)DX01菌株总基因组中启动子的活性片断F1；

(2)构建原核表达gfp基因组成型表达载体，进行荧光检测；

(3)启动子活性片段F1随机插入突变，并进行氯霉素抗性检测；

(4)该启动子指导下获得的萝卜抗真菌蛋白分泌具有一定的抗真菌特性。

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