CN102086440B - 一种产抗真菌蛋白菌株的筛选方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种产抗真菌蛋白菌株和该菌株的筛选方法以及利用该菌发酵生产抗真菌蛋白的方法。利用该方法筛选获得的菌株命名为巨大曲霉Aspergillus giganteus AF-11，保藏号为CGMCC NO.4342，该菌株具有更高的抗真菌蛋白产量。使用本发明提供的筛选菌种及方法生产的抗真菌蛋白能够高效抑制啤酒制麦过程的霉菌，尤其是镰刀霉属，提高麦芽质量，和常规处理方法相比较，更安全，更有效。具有很好的应用前景。

Description

一种产抗真菌蛋白菌株的筛选方法及应用
技术领域
本发明涉及一株产抗真菌蛋白的菌株，命名为Aspergillus giganteus AF-11，已于2010年11月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.4342。同时涉及获得该菌的诱变筛选方法和利用该菌株发酵抗真菌蛋白并在啤酒大麦制麦中的应用的方法，属于微生物制麦技术领域。 
背景技术
AFP(antifungal protein)是由Aspergillus giganteus分泌的小分子量碱性蛋白，可有效抑制丝状真菌的生长，尤其是动植物致病真菌。近几年的研究发现AFP对抑制丝状真菌具有安全、高效、广谱、稳定的特点，而这些显著的特点使其最有希望成为新的抗真菌抗生素、安全的天然食品防腐剂、可靠的生物农药和基因工程目的基因载体。1965年，Olson等从美国密歇根州农场土壤中分离筛选得到的一株Aspergillus giganteus菌株并发酵液中分离得到一种由51个氨基酸组成的小分子碱性蛋白——AFP(抗真菌蛋白)，并证明对丝状真菌具有明显的抑制作用。研究还发现AFP可高效抑制许多人类和动植物致病霉菌，而对细菌和酵母菌无抑制作用，这种选择性抑制作用在医学和应用生物技术上引起了人们的广泛兴趣和高度关注。2006年，Szappanos等研究分析了AFP对哺乳动物细胞功能的影响，通过实验发现AFP对哺乳动物细胞无细胞毒素效应和免疫反应，并认为AFP是具有很好应用前景和开发研究价值的新的抗真菌抗生素。 
目前，啤酒大麦在制麦过程由于潮湿的环境容易污染镰刀霉、烟曲霉和根霉等真菌。这些受污染的麦芽不但影响酿造性能还影响食品安全，目前一般采用制麦过程中加入石灰水来抑制菌的污染，但是这样也会带来食品安全的隐患。利用微生物自身产生的抗真菌蛋白来抑制污染很少有报道，尤其是关于Aspergillus giganteus的研究更是几乎没有看到。 
发明内容
本发明的目的是提供一株能广谱抗真菌的高产AFP菌株及其筛选方法。同时利用该菌株发酵生产AFP的方法在制麦过程中进行有害微生物控制。本发明的目的可以通过以下措施达到： 
1、土壤样品取样及前处理：取碱性土壤2g，用水浴、乙醇和蛋白胨处理。 
2、真菌培养：在28℃，筛选培养基(葡萄糖10g，NH4NO31g/L，酵母膏1g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，孟加拉红0.006g/L，链霉素0.003g/L，琼脂20g/L。)培养4-5天后，挑选可以抑制其它霉菌生长的菌株。 
3、驯化诱变：30℃条件下，将筛选的菌株YPD培养基上驯化培养4-5天，然后经EMS 诱变，挑选抑菌圈较大的菌株作为复筛菌株。 
4、摇瓶复筛：摇瓶发酵，采用纸片法或者牛津杯法检测发酵液菌株抑菌圈大小。 
5、选出抑菌能力最强的菌株，发酵生产AFP，用考马斯亮蓝比色法测定AFP含量。 
6、将AFP用于啤酒大麦的制麦过程中，抑制菌的污染。 
本发明取得以下优点和显著进步： 
1、得到了一株高产抗真菌蛋白的菌株，保藏号为CGMCC NO.4342。 
2、将该菌株发酵生产AFP用于啤酒大麦的制麦过程中，抑制菌的污染，减少了食品加工过程中化学试剂石灰水的加入，用生物的手段更加安全环保的解决了制麦污染问题。 
具体实施方式
实施例1产抗真菌蛋白菌株的筛选 
1、1.5g土样加入10ml无菌生理盐水，在60℃条件下，水浴30min 
2、去除无菌水，加入65％乙醇处理10min，加入0.1％浓度的蛋白胨溶液处理10min。 
3、将0.1ml溶液接种到肌氨酸蔗糖培养基，25℃条件下，培养7天。 
4、挑选不同形态特征的单菌落，转接到MEA(蔗糖25g/L，硝酸钠1.5g/L，磷酸氢二钾0.6g/L，氯化钾0.4g/L，硫酸镁0.3g/L，硫酸亚铁0.08g/L，琼脂20g/L)斜面固体培养基上。 
5、用10％甘油收集并保藏单菌落的孢子。 
6、分离的单菌落在MEA培养基pH4.525℃条件下培养4天。 
7、打孔器挖取直径25mm的菌苔，移至已灭菌的培养皿中，每皿三块。 
8、MEA培养基冷却至50℃，加入供试菌孢子1×106/ml，25℃，培养48h 
9、测量抑菌能力大小，将抑菌圈最大的Aspergillus giganteus AF-11接种保存。 
实施例2AFP发酵生产 
将AF-11接种到斜面固体培养基上，28℃，培养4天，用无10ml菌水冲洗斜面，制成孢子菌悬液用于种子培养。按10％接种量，将孢子菌悬液接种到种子培养液(葡萄糖13g/L，蛋白胨3g/L，酵母浸膏3g/L，NaCl 5g/L)中，28℃，220rpm培养4天。按10％接种量，将种子液接种到2L发酵培养中，30℃，220rpm培养，4天。阳离子交换层析分离纯化提取AFP，采用考马斯亮蓝比色法测定得到的AFP为10.2mg。 
实施例3AFP制麦微生物控制 
称取1000g大麦，在4000ml无菌水中浸泡4小时。经浸泡的大麦在15℃，发芽3～4天。AFP用水稀释到16μg/g大麦浓度，加入到大麦中。经4天后，检测大麦发芽污染情况，可以看到污染情况明显改善，与对照样相比，污染霉菌总数减少90％。 

Claims (2)

1.一种曲霉菌株，其分类命名为Aspergillus giganteus AF-11，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO 4342。
2.如权利要求1所述曲霉菌株在啤酒大麦制麦发芽过程中的应用。
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