CN105154341B - 一种耐辐射出芽短梗霉及其在制备黑色素中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种耐辐射出芽短梗霉及其在制备黑色素中的应用。通过在新疆某辐射污染环境地表土壤中分离、筛选、选育、驯化，获得出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)MF1 CGMCC No.CGMCC11275，通过在改良查氏培养基的装添量为100mL，葡萄糖添加量10.3g/L，酵母浸粉添加量2.02g/L,硫酸铵添加量2.0g/L，NaCl添加量0.5g/L，菌种接种量为2mL，30℃，180r/min摇床培养96h的条件下，获得黑色素，本发明制备的黑色素可有效的提高菌株在紫外照射下的存活率，具有现实的意义和作用。
Description
技术领域
本发明涉及微生物应用技术领域，具体地说，本发明涉及一种出芽短梗霉及及其在黑色素发酵中应用的技术领域。
背景技术
天然黑色素是一种广泛存在于动植物和微生物中的非均质类多酚聚合体，是一类高分子量褐色-黑色素的总称。黑色素在紫外线和可见光波长均具有良好的光吸收作用，特别是在紫外光下具有极强的吸收(最大吸收波长为210nm)，其一般可溶于碱性溶液，不溶于酸性溶液，微溶于水，不溶于常见有机溶剂。黑色素具有较强的清除自由基、抗氧化等功能，均优于SOD、维生素E等常规抗氧化产品，同时部分可溶性黑色素在体外对爱滋病病毒有显著的抑制作用，可广泛应用于农业、食品以及医药等领域。另外，部分黑色素具有电导性等功能，可广泛应用于材料及化学领域。因此，黑色素应用潜力巨大。
微生物来源黑色素因种类多样，且不受地域、季节限制，易于工业化生产等特点，是理想的黑色素开发资源。研究表明，自然界中多种微生物可产黑色素，包括细菌中的大肠杆菌、链球菌、蜡状芽孢杆菌、嗜麦芽假单孢菌及部分固氮菌，放线菌如链霉菌，霉菌如黑曲霉、链格孢霉、构巢曲霉、米曲霉以及出芽短梗霉等。一般认为，黑色素能提高微生物抗重金属毒害、抗紫外射线损害的能力，还能增强其抗氧化能力，从而提高其生存能力，但黑色素不是微生物生长、繁殖、代谢所必须的代谢产物，所以代谢产量一般都不高。
出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)是一种具有酵母型和菌丝型形态的多形真菌，因生长后期易产生黑色素而一度被认为是“黑酵母”，是工业生产中重要生物材料短梗霉多糖的生产菌株。出芽短梗霉为半知菌类短梗霉属，其厚垣孢子积累黑色素，可抵抗紫外线、高渗胁迫及重金属毒害等多种逆境，还可作为单细胞蛋白、细胞壁多糖、胞外多糖、果胶酶、色素等的生产菌株。目前对真菌耐辐射特性和机理方面研究发现，黑色素的产生对真菌的耐辐射作用至关重要，可令其具有较高耐γ-射线辐照的能力，部分真菌黑色素甚至可以俘获离子辐射能量作为能源。
尽管有许多关于利用菌种发酵生产黑色素的研究和报道，但是有关从从辐射污染环境地表土壤中筛选出耐辐射菌种，以及利用自行选育筛选驯化获得的具有耐辐射的出芽短梗霉进行发酵制备黑色素的研究还未见报道。
发明内容
针对现有技术中未见有关从辐射污染环境地表土壤中筛选出具有耐辐射的芽短梗霉作为优良菌种并利用筛选的菌种发酵制备黑色素的技术现状，本发明旨在提供一种耐辐射出芽短梗霉及其在制备黑色素中的应用。本发明通过在新疆某辐射污染环境地表土壤中分离、筛选出一株编号为MF1的菌株，并通过利用编号为MF1的出芽短梗霉发酵制备获得黑色素，发酵制备的黑色素具有良好的水溶性，较高的热稳定性，不易被氧化还原，金属离子对黑色素稳定性影响不显著；对大肠杆菌及苏云金芽孢杆菌的紫外保护特性研究发现，本发明制备的黑色素可有效的提高菌株在紫外照射下的存活率，为天然水溶性黑色素的开发利用提供理论依据和现实的开发来源，具有现实的意义和作用。
本发明采用主要的技术方案：
通过微生物菌种的分离筛选，在新疆某辐射污染环境地表土壤中分离出一批微生物菌株，经过进一步分离、筛选、选育、驯化，获得一株编号为MF1的出芽短梗霉菌株。通过对所获菌株进行形态特征、生理生化特性、LSU rDNA D1/D2区序列测定及系统发育分析，初步确定了其分类地位。同时，将编号为MF1的出芽短梗霉在改良查氏培养基的装添量为100mL，葡萄糖添加量10.3g/L，酵母浸粉添加量2.02g/L,硫酸铵添加量2.0g/L，NaCl添加量0.5g/L，菌种接种量为2mL，30℃，180r/min摇床培养96h的条件下，获得黑色素；制备的黑色素具有良好的水溶性，较高的热稳定性，不易被氧化还原，金属离子对色素稳定性影响不显著，对大肠杆菌及苏云金芽孢杆菌的紫外保护特性研究发现，本发明制备的黑色素可有效的提高菌株在紫外照射下的存活率，具有现实的意义和作用。
本发明具体提供一种出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)，通过对新疆某辐射污染环境地表5cm-20cm土壤中微生物进行分离、筛选和培养，获得一批微生物菌株，从中筛选出一株序列号为MF1的菌株，经微生物学分类与鉴定，该菌株属于Aureobasidiumpullulans。
具体的，本发明提供一种出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)，菌株编号为MF1。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期是2015年8月25日，保藏号是CGMCC No.11275。经微生物学鉴定为Aureobasidium pullulans。该菌株在MEA培养基培养后，其菌落初期均为酵母样，灰白色，菌落后期真菌菌丝体嵌入培养基，其中培养2天后菌落转暗为黑色或棕黑色，凸起，菌落边缘有或无菌丝体嵌入培养基，培养7天后，菌落大小为0.2cm-1.0cm；其最适生长温度为28℃，最适初始生长pH为6.0。显微观察，营养菌丝透明，光滑，薄壁，有横隔，培养中后期转换为黑色菌丝。分生孢子透明至黑褐色。透明分生孢子单细胞，光滑，椭圆形，4.5-10×3.0-10微米。利用BIOLOG酵母鉴定板进行培养，确定其可以利用琥珀酸、糊精、菊糖、麦芽糖、麦芽三糖、D-松三糖、异麦芽酮糖、D-蜜三糖、水苏糖、蔗糖、D-海藻糖、α-D-葡萄糖、L-山梨糖、水杨苷、D-阿拉伯醇、木糖醇作为唯一碳源。而在查氏培养基上，菌落生长初期就呈现黑色或棕黑色，无明显多糖产生，经微生物学鉴定为Aureobasidium pullulans菌，但是与常见的出芽短梗霉菌种有明显的菌落形态、生理生化的区别。参照《真菌鉴定手册》对编号MF1菌株进行系统生理生化鉴定，经生理生化检测确定编号MF1菌株为短梗霉属(Aureobasidium)中的成员。通过BLAST同源比对，将菌株MF1所得的LSU rDNA D1/D2区序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较，构建系统进化树，该编号为菌株MF1与Aureobasidium pullulans var pullulans CBS 146.30T(FJ150916)处于最小分支，是其近似种，其同源性为98.5％；进而将该菌株MF1确定为Aureobasidium pullulans，经过上述系统分类学鉴定分类，证明了本发明提供的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)与常见的出芽短梗霉有明显的生理生化特性差异和分子水平的差异性，依据菌种生理生化特性分析，分子水平分析及系统分类学的综合鉴定，编号为MF1的菌种尽管在生理生化特性和分子水平方面与常见的出芽短梗霉有明显的差异，是一种新菌，但从分类学上，鉴定为出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)。
同时，本发明具体提供一种利用出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)MF1CGMCC No.CGMCC11275提取和制备黑色素的方法，具体制备方法步骤如下：
(1)菌种的活化：将出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)MF1 CGMCCNo.CGMCC11275接种于改良的改良查氏固体培养基，28℃培养48h，进行菌种的活化。
所述的改良查氏固体培养基：硝酸钠3g，酵母浸粉0.5g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，葡萄糖30g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，PH自然，分装，灭菌。
(2)菌种的培养：将步骤(1)活化的菌株接种于改良查氏液体培养基，其中改良查氏液体培养基的装添量为100mL，葡萄糖添加量为10.3g/L，酵母浸粉添加量为2.02g/L，硫酸铵添加量为2.0g/L，NaCl添加量为0.5g/L，菌种接种量为2mL，30℃，180r/min摇床培养96h，获得液体培养物。
所述的改良查氏液体培养基：硝酸钠3g，酵母浸粉0.5g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，葡萄糖30g，蒸馏水1000mL，PH自然，分装，灭菌。
(3)黑色素初提液的制备：将步骤(2)制备的液体培养物进行10000r/min离心5min处理，去除菌体，获得上清液即为黑色素初提液。
(4)黑色素粗提取物的制备：将步骤(3)制备的黑色素初提液使用与黑色素初提液等量的无水乙醇沉淀，并用与黑色素初提液等量的50％乙醇洗涤一次，于100℃干燥至恒重，即可获得黑色素。
进一步，本发明提供采用上述利用出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)MF1CGMCC No.CGMCC11275制备黑色素粗提取物的方法制备获得的黑色素粗提取物。
本发明生产的黑色素，易溶于水，不溶于浓度大于50％以上的乙醇和甲醇溶液，不溶于乙醚，丙酮，丙醇，氯仿等常见试剂；在测定全波长范围内具有明显的光吸收作用，特别在紫外光谱下具有一定的吸收作用，在225nm处有一特殊吸收峰，与此前报道Aureobasidium属来源的黑色素有明显的差异；可抵抗双氧水、次氯酸盐及其他氧化物的氧化作用，说明本发明制备的黑色素具有抗氧化功能，同时对硫代硫酸钠具有一定的抗还原功能，但高浓度的还原剂对本发明制备的黑色素影响较大；本发明制备的黑色素在0.05M金属离子环境下具有较好的稳定性，但不同离子的影响不同，K+、Na+无影响，Al3+、Zn2+、Mg2+、Mn2+具有增效作用，而Cu2+、Ca2+具有降效的作用。同时实验过程，随着离子浓度增高，黑色素稳定性明显降低，通过黑色素对大肠杆菌及苏云金芽孢杆菌的紫外保护特性研究发现，本发明制备的黑色素可有效的提高菌株在紫外照射下的存活率。
通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果:
(1)本发明筛选的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)MF1 CGMCCNo.CGMCC11275菌株具有较强的生长繁殖能力，生长速率快，遗传特性稳定，并对发酵制备黑色素具有特定的作用。
(2)本发明利用出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)MF1 CGMCCNo.CGMCC11275菌株制备的黑色素具有良好的水溶性，较高的热稳定性，不易被氧化还原，金属离子对色素稳定性影响不显著，对大肠杆菌及苏云金芽孢杆菌的紫外保护特性研究发现，该黑色素可有效的提高菌株在紫外照射下的存活率。
(3)本发明一种耐辐射短梗霉及其在黑色素发酵中的应用，本发明制备的黑色素能有效的保护苏云金芽胞杆菌，减少紫外线对其的杀伤。
(4)本发明方法提供的制备黑色素的方法中，使用本发明方法时，黑色素的提取率最高为0.53g/L
附图说明
图1显示为出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)MF1 CGMCC No.CGMCC11275菌落形态图。
图2显示为出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)MF1 CGMCC No.CGMCC11275菌丝体显微形态图。
图3显示为出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)MF1 CGMCC No.CGMCC11275的系统进化树图。
图4显示为出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)MF1 CGMCC No.CGMCC11275产生黑色素光吸收扫描曲线图。
图5显示为pH对黑色素溶液的影响图。
图6显示为金属离子对黑色素溶液的影响图。
图7显示为葡萄糖、酵母浸粉与黑色素产量的交互作用图，图中R1为黑色素产量；A为葡萄糖量；B为酵母浸粉量。
图8显示为酵母浸粉、装填量与黑色素产量的交互作用图，图中R1为黑色素产量；B为酵母浸粉量；C为装填量。
图9显示为葡萄糖、装填量与黑色素产量的交互作用图，图中R1为黑色素产量；A为葡萄糖量；C为装填量。
图10显示为黑色素对苏云金芽胞杆菌的紫外辐照保护作用图；T1为菌液0.5ml稀释至10-3倍；T2为菌液0.5ml稀释至10-4倍。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
主要仪器与设备：PL202电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；HPX-9272数显电热培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；LDZX-40BI高压灭菌器，上海申安医疗器械厂；GZX-9420电热恒温鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司；SW-CJ-2F超净工作台，上海博迅实业有限公司；HHW.21.600电热恒温水浴箱，北京永光明医疗仪器厂；fcycler96孔PCR反应仪，Bio-Rad公司；DYY-6C型电泳仪，北京六一仪器厂；GEL Doc2000凝胶成像分析仪，Bio-Rad公司；LDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；Biolog，美国BioTekInstruments公司；游标卡尺，上海工量具有限公司；WHB 96微孔板，上海市蔚宏生物科技有限公司；1000ml移液枪，上海艾本德生物技术国际贸易有限公司；C21-RT2103电磁炉、EG720FF1-NR微波炉，广东美的生活电器制造有限公司；BL3100电子天平，德国Sartorius公司；PHS-3B型pH计，上海红益仪器仪表有限公司。
本发明中选用的所有原辅材料，以及选用的菌种培养基、培养方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的％都为重量百分比，除非特别指出除外。
实施例一：出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)MF1 CGMCC No.CGMCC 11275的分离和筛选
本发明所使用的出芽短梗霉从新疆某辐射污染环境地表5cm-20cm土壤中进行取样分离。取采集的土样1.0g分装于15mm×150mm无菌试管中，置于60Coγ射线下进行10kGry剂量辐照处理，然后向试管中加入5mL液体查氏培养基，28℃振荡富集3d。取1mL上述富集液移入装有9mL无菌生理水的试管中，依次进行梯度稀释后，取0.2mL稀释液涂布于查氏培养基平板上，于28℃恒温条件下培养7d，观察菌落生长情况，挑取单菌落进行纯化。将纯化后的菌株一部分采用冻干物安瓿管、甘油管和液氮等方式保藏，一部分保存于4℃直接用于后续研究。
通过分离筛选，编号为MF1的出芽短梗霉，经形态学和生理生化鉴定发现，其在MEA培养基上培养后，其菌落初期为酵母样、灰白色，菌落后期为真菌菌丝体嵌入培养基；其中培养2天后菌落转暗变为黑色或棕黑色，凸起，菌落边缘有或无菌丝体嵌入培养基；培养7天后，菌落大小为0.2cm-1.0cm；其最适生长温度为28℃，最适初始生长pH为6.0。显微观察，编号为MF1的出芽短梗霉的营养菌丝透明，光滑，薄壁，有横隔，培养中后期转换为黑色菌丝；分生孢子透明至黑褐色，透明分生孢子单细胞，光滑，椭圆形，4.5-10×3.0-10微米。利用BIOLOG酵母鉴定板进行培养，确定编号为MF1的出芽短梗霉可以利用琥珀酸、糊精、菊糖、麦芽糖、麦芽三糖、D-松三糖、异麦芽酮糖、D-蜜三糖、水苏糖、蔗糖、D-海藻糖、α-D-葡萄糖、L-山梨糖、水杨苷、D-阿拉伯醇、木糖醇作为唯一碳源。而在改良查氏培养基上，编号为MF1的出芽短梗霉的菌落生长初期呈现黑色或棕黑色，无明显多糖产生，因此，改良查氏培养基更利于该菌株大量产生黑色素。其中，出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)MF1CGMCCNo.CGMCC11275菌落形态参见附图1，出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)MF1 CGMCCNo.CGMCC11275菌丝体显微形态参见附图2。
所述改良查氏培养基的制备为：硝酸钠3g，酵母浸粉0.5g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，葡萄糖30g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，PH自然，分装，灭菌，即可制备获得改良查氏培养基。
通过对新疆某辐射污染环境地表土壤中微生物进行分离、筛选和培养，获得一批微生物菌株，从中筛选出一株序列号为MF1的菌株，经微生物学分类与鉴定，该菌株属于Aureobasidium pullulans。本发明提供一种出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)，菌株编号为MF1。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期是2015年8月25日，保藏号是CGMCCNo.11275。经微生物学鉴定为Aureobasidium pullulans。该菌株在MEA培养基培养后，其菌落初期均为酵母样，灰白色，菌落后期真菌菌丝体嵌入培养基，其中培养2天后菌落转暗为黑色或棕黑色，凸起，菌落边缘有或无菌丝体嵌入培养基，培养7天后，菌落大小为0.2cm-1.0cm；其最适生长温度为28℃，最适初始生长pH为6.0。显微观察，营养菌丝透明，光滑，薄壁，有横隔，培养中后期转换为黑色菌丝。分生孢子透明至黑褐色。透明分生孢子单细胞，光滑，椭圆形，4.5-10×3.0-10微米。利用BIOLOG酵母鉴定板进行培养，确定其可以利用琥珀酸、糊精、菊糖、麦芽糖、麦芽三糖、D-松三糖、异麦芽酮糖、D-蜜三糖、水苏糖、蔗糖、D-海藻糖、α-D-葡萄糖、L-山梨糖、水杨苷、D-阿拉伯醇、木糖醇作为唯一碳源。而在查氏培养基上，菌落生长初期就呈现黑色或棕黑色，无明显多糖产生，经微生物学鉴定为Aureobasidiumpullulans菌，但是与常见的出芽短梗霉菌种有明显的菌落形态、生理生化的区别。参照《真菌鉴定手册》对编号MF1菌株进行系统生理生化鉴定，经生理生化检测确定编号MF1菌株为短梗霉属(Aureobasidium)中的成员。通过BLAST同源比对，将菌株MF1所得的LSU rDNA D1/D2区序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较，构建系统进化树，该编号为菌株MF1与Aureobasidium pullulans var pullulans CBS 146.30T(FJ150916)处于最小分支,是其近似种，其同源性为98.5％；进而将该菌株MF1确定为Aureobasidium pullulans，经过上述系统分类学鉴定分类，证明了本发明提供的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)与常见的出芽短梗霉有明显的生理生化特性差异和分子水平的差异性，依据菌种生理生化特性分析，分子水平分析及系统分类学的综合鉴定，编号为MF1的菌种尽管在生理生化特性和分子水平方面与常见的出芽短梗霉有明显的差异，是一种新菌，但从分类学上，鉴定为出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)。
实施例二：出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)MF1 CGMCC No.CGMCC11275的分离、筛选及鉴定
1、PCR扩增绿色木霉的rDNA ITS区段及其测序
将菌株接种于改良查氏培养基，于28℃恒温条件下培养4d，离心收集菌体，参照Gerrits等提取总DNA提取方法，利用LSU rDNA D1/D2区的真菌通用引物PCR扩增，引物设计如下：
NL1：5′-GCATATCGGTAAGCGGAGGAAAAG-3′，
NL4：5′-GGTCCGTGT-TT CAAGACGG-3′；
PCR产物经切胶纯化回收，加去离子水溶解，进行测序。
2、LSU rDNA D1/D2区序列比对及系统发育分析
将菌株所得的LSU rDNA D1/D2区序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较，确定与实验菌株亲缘关系最近的种属。从数据库获得相关种属的序列，并结合真菌生物多样性研究中心数据库的标准模式菌序列，利用MEGA 5.0软件包采用常用的邻接法进行聚类分析和系统进化树构建，确定菌种生物学分类地位，系统进化树参见附图3。结果表明，实验菌株为Aureobasidium属，其与Aureobasidium pullulans var pullulans CBS146.30T(FJ150916)聚在同一个分支中，同源性也最高，最大同源性为98.5％，根据真菌新种鉴定规则以及该属分类现状，为潜在新变种。本发明提供的出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)MF1CGMCC No.CGMCC11275与常见的出芽短梗霉有明显的生理生化特性差异和分子水平的差异性，依据菌种生理生化特性分析，分子水平分析及系统分类学的综合鉴定，编号为MF1的菌种尽管在生理生化特性和分子水平方面与常见的出芽短梗霉有明显的差异，是一种新菌，但从分类学上，鉴定为出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)。
实施例三：利用出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)MF1 CGMCCNo.CGMCC11275提取和制备黑色素粗提取物
(1)菌种的活化：将出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)MF1 CGMCCNo.CGMCC11275接种于改良的改良查氏固体培养基，28℃培养48h，进行菌种的活化。
所述的改良查氏固体培养基：硝酸钠3g，酵母浸粉0.5g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，葡萄糖30g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，PH自然，分装，灭菌。
(2)菌种的培养：将步骤(1)活化的菌株接种于改良查氏液体培养基，其中改良查氏液体培养基的装添量为100mL，葡萄糖10.3g/L，酵母浸粉2.02g/L,硫酸铵2.0g/L，NaCl0.5g/L，菌种接种量为2mL，30℃，180r/min摇床培养96h，获得液体培养物。
所述的改良查氏液体培养基：硝酸钠3g，酵母浸粉0.5g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，葡萄糖30g，蒸馏水1000mL，PH自然，分装，灭菌。
(3)黑色素初提液的制备：将步骤(2)制备的液体培养物进行10000r/min离心5min处理，去除菌体，获得上清液即为黑色素初提液。
(4)黑色素粗提取物的制备：将步骤(3)的黑色素初提液使用与黑色素初提液等量的无水乙醇沉淀，并用与黑色素初提液等量的50％乙醇洗涤一次，于100℃干燥至恒重，即可获得黑色素粗提取物。
实施例四：出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)MF1 CGMCC No.CGMCC11275的黑色素发酵工艺优化
1.Placket-Burman优化
选用试验次数N＝12的试验设计，对11因素进行考察，响应值为黑色素浓度OD。6个实际因素两水平分别取原水平的近±0.25倍，Placket-Burman设计及因素水平见表1，Placket-Burman设计表及试验结果见表2，通过二次项计算，各因素效应结果见表3。由上可知，葡萄糖，酵母浸粉，装填量对菌株产生黑色素的影响较大，影响率分别为29.05％，28.78％，10.07％。其中葡萄糖，酵母浸粉，装填量对产生黑色素的影响均为正相关，即随着葡萄糖，酵母浸粉，装填量的增加，黑色素的产生量也随之增加，而虚拟因素的影响也不大，结果可信。因此，可选择葡萄糖，酵母浸粉，装填量三个因素为主要因素进行下一步实验。
表1：Placket-Burman设计及因素水平
表2：Placket-Burman设计表及试验结果
| 编号 | A | B | C | D | E | F | G | H | I | Y |
| 1 | -1 | +1 | +1 | -1 | +1 | -1 | -1 | +1 | +1 | 0.17 |
| 2 | +1 | +1 | -1 | +1 | +1 | +1 | -1 | +1 | -1 | 0.12 |
| 3 | -1 | +1 | -1 | +1 | -1 | -1 | +1 | -1 | +1 | 0.16 |
| 4 | -1 | -1 | -1 | +1 | +1 | +1 | +1 | +1 | +1 | 0.16 |
| 5 | +1 | +1 | -1 | -1 | -1 | +1 | -1 | +1 | +1 | 0.22 |
| 6 | +1 | -1 | +1 | +1 | +1 | -1 | -1 | -1 | +1 | 0.18 |
| 7 | +1 | +1 | +1 | +1 | -1 | -1 | +1 | +1 | -1 | 0.17 |
| 8 | -1 | -1 | +1 | +1 | -1 | +1 | -1 | +1 | -1 | 0.13 |
| 9 | +1 | -1 | +1 | -1 | -1 | +1 | -1 | -1 | +1 | 0.14 |
| 10 | +1 | -1 | -1 | -1 | +1 | -1 | +1 | +1 | -1 | 0.18 |
| 11 | -1 | +1 | +1 | -1 | +1 | +1 | -1 | -1 | -1 | 0.21 |
| 12 | -1 | -1 | -1 | -1 | -1 | -1 | -1 | -1 | -1 | 0.16 |
表3：各因素的效因素表
| 因素 | 影响水平 | 平方和 | 影响率(％) | 重要性 |
| A葡萄糖 | 0.039 | 4.637 | 29.05 | 重要 |
| B酵母浸粉 | 0.023 | 4.592 | 28.78 | 重要 |
| C硫酸铵 | -8.380 | 2.107 | 0.013 | |
| D NaCl | -8.018 | 1.929 | 1.21 | |
| E装填量 | 0.020 | 1.607 | 10.07 | 重要 |
| F接种量 | 6.379 | 1.221 | 0.76 | |
| G(虚拟因素) | -0.039 | 1.216 | 7.62 | |
| H(虚拟因素) | 0.012 | 4.157 | 2.60 | |
| I(虚拟因素) | -0.012 | 4.188 | 2.62 |
2.响应面表设计及模型分析
依据Placket-Burman分析结果，实验采用Box-Behnken实验设计。其设计表与结果见表4；回归模型方差分析见表5。由表4中，F回归＝7.15>F0.0500，可知设计中不同处理间差异不显著；失拟项P＝0.0165<0.05，差异显著，说明残差均由随机误差引起；R2为0.9360，表明整体平均能够更好的预测反应；其二次方程为：
R＝167.50+15.62×A+8.87×B+14.75×C-2.25×A×B+14.50×A×C-9.00×B×C-22.62×A2-27.62×B2+3.62×C2
表4：响应面设计与结果
| 编号 | 葡萄糖(％) | 酵母浸粉(％) | 装添量(％) | OD |
| 1 | -1 | +1 | 0 | 0.16 |
| 2 | 0 | 0 | 0 | 0.18 |
| 3 | +1 | -1 | 0 | 0.24 |
| 4 | 0 | 0 | 0 | 0.20 |
| 5 | +1 | +1 | 0 | 0.16 |
| 6 | -1 | 0 | -1 | 0.23 |
| 7 | 0 | +1 | +1 | 0.28 |
| 8 | +1 | 0 | -1 | 0.29 |
| 9 | 0 | -1 | -1 | 0.28 |
| 10 | +1 | 0 | +1 | 0.28 |
| 11 | 0 | -1 | +1 | 0.22 |
| 12 | -1 | -1 | 0 | 0.22 |
| 13 | 0 | +1 | -1 | 0.25 |
| 14 | -1 | 0 | +1 | 0.31 |
表5：回归模型方差分析
| 变异来源 | 平方和 | 自由度 | 均方 | F值 | P值 |
| 模型 | 9.442 | 9 | 1.049 | 7.15 | 0.0165 |
| 残差 | 1.210 | 1 | 1.210 | ||
| 失拟 | 6.181 | 1 | 6.181 | 42.09 | 0.0074 |
| 误差 | 4.405 | 3 | 1.468 | ||
| 总和 | 9.883 | 13 |
对表4的结果作响应面及其等高线参见附图7-9，其中各图表示A(葡萄糖)、B(酵母浸粉)、C(接种量)中任意一个变量取零水平时，其余两个变量对其发酵优化的交互影响。从附图7-9中可以看出各因素交互作用对响应值的影响，图中等高线均存在极值，既响应面的最高点，说明试验所选范围较合理。从附图7-9中可以看出，三个响应面的等高线总体为圆形或椭圆形，说明相互交互作用不是很强。但是不同因素间交互仍然有着明显的差异。由附图7中可以看出葡萄糖量对黑色素产量的影响大，而酵母浸粉相对较为平缓，说明在这两者间酵母浸粉对黑色素产量的影响较小。由附图8可以知道，装填量对黑色素产量的响应面变化更明显，变化范围更大，相反，酵母浸粉变化较为平缓，从装填量的等高线与坐标轴的交点较多也可以看出装填量相对酵母浸粉，对黑色素产量的影响较大，等高线为椭圆形，极值对应的点接近椭圆形的中心，说明两因素间有很强的交互作用。从附图9可以看出，葡萄糖与装填量两者有一定的交互作用，但等高线几乎为圆形，说明作用不是很强。
结合回归模型分析结果可知，最佳发酵工艺条件为：装添量为100mL，葡萄糖10.3g/L，酵母浸粉2.02g/L,硫酸铵2.0g/L，NaCl 0.5g/L，接种量为2mL，30℃，180r/min摇床培养96h。通过实验验证，在此条件下黑色素的理论提取率为：0.57g/L，实际产量最高为0.53g/L。因此，响应面分析法所优化的最佳提取工艺数据真实可靠。
实施例五：黑色素的理化性质
1、溶解性
本发明生产的黑色素，易溶于水，不溶于浓度大于50％以上的乙醇和甲醇溶液，不溶于乙醚，丙酮，丙醇，氯仿等常见试剂。
2、黑色素的紫外光谱测定
将本发明生产的色素溶于去离子水中，并以去离子水作参比液，用紫外分光光度计于200-800nm进行光谱扫描，测定黑色素的光吸收曲线。
参见附图4,可见，黑色素在测定全波长范围内具有明显的光吸收作用，特别在紫外光谱下具有一定的吸收作用，在225nm处有一特殊吸收峰，与此前报道Aureobasidium属来源的黑色素有明显的差异，可能是由于黑色素为高度聚合的阴离子化合物，极易与带电荷的多粮结合而不易分开。
3、黑色素pH稳定性研究
使用HCl和NaOH分别调成不同pH的黑色素溶液，室温过夜放置，于波长400nm处测定其吸光度，测定其破坏程度。分别取3ml黑色素溶液，各加入氧化剂、还氧剂在不同条件下处理，于波长400nm处测定其吸光度，计算残余率。结果如附图5显示，黑色素具有极其高的pH稳定性，在酸性情况下黑色素有所下降，可能由于多糖消解，部分黑色素游离后其在酸性情况下沉淀。而碱性条件也可能多糖水解，但黑色素可良好的溶于碱性，所以影响不大。从表6，7中可以看出，该色素可抵抗双氧水、次氯酸盐及其他氧化物的氧化作用，说明该黑色素具有抗氧化功能。从表8可以看出，该色素对硫代硫酸钠具有一定的抗还原功能，但高浓度的还原剂对黑色素影响较大。
表6：NaClO对黑色素稳定性的影响
表7：H2O2对黑色素稳定性的影响
表8：Na2S2O3对黑色素稳定性的影响
4.金属离子对黑色素的影响
配制0.1M金属离子Cu2+、A13+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+、Na+、K+浓度为1×10-5的色素溶液，在30min、1h、2h时，在λ＝400处测定其OD值，计算残余率。结果如图6显示，该黑色素在0.05M金属离子环境下具有较好的稳定性，但不同离子的影响不同，K+、Na+无影响，Al3+、Zn2 +、Mg2+、Mn2+具有增效作用，而Cu2+、Ca2+具有降效的作用。同时实验过程，随着离子浓度增高，黑色素稳定性明显降低。
实施例六：出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)MF1 CGMCC No.CGMCC11275黑色素对苏云金芽胞杆菌的保护作用的实验
从新鲜斜面上挑取一环苏云金芽胞杆菌(Bt)菌苔接种于液体LB三角瓶中，于30℃180r/min震荡培养7d后，10000r/min离心5min，去上清，并用无菌水洗涤3遍，重悬于无菌水中，调节OD600至0.1。
取实施例三制备的黑色素发酵液经离心去菌体后，灭菌，使用无菌水调节OD400至1.0，分别取1mL和2mL黑色素发酵液，并用上述方法制备的Bt菌液补足至10mL，放置于电子搅拌器上匀速搅拌，并在254nm紫外灯15W下30cm照射。照射一定时间后，取菌液0.5ml，稀释至10-3、10-4倍，涂布于LB平板上，30℃过夜培养，计数。结果如附图10所示，在无黑色素保护的情况下，紫外照射1.0h时，Bt的存活率减少到辐照前的一半。而在黑色素溶液保护下，无论处理T1和T2，其在同样辐射条件下，致死率降低到50％以上，因而证明本研究的黑色素能有效的保护Bt，减少紫外线对其的杀伤。
通过上述系列实施例试验验证获得本发明筛选选育驯化获得的本发明筛选的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)MF1 CGMCC No.CGMCC11275菌株具有较强的生长繁殖能力，生长速率快，遗传特性稳定，并对发酵制备黑色素具有特定的作用；出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)MF1 CGMCC No.CGMCC11275菌株制备的黑色素具有良好的水溶性，较高的热稳定性，不易被氧化还原，金属离子对色素稳定性影响不显著，对大肠杆菌及苏云金芽孢杆菌的紫外保护特性研究发现，该黑色素可有效的提高菌株在紫外照射下的存活率；本发明制备的黑色素能有效的保护苏云金芽胞杆菌，减少紫外线对其的杀伤。具有现实的意义和作用。
上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 新疆农业科学院微生物应用研究所
<120> 一种耐辐射出芽短梗霉及其在制备黑色素中的应用
<130> 出芽短梗霉
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 596
<212> DNA
<213> 出芽短梗霉
<220>
<221> LSU rDNA D1/D2
<222> (1)..(596)
<400> 1
ggaggaaaag aaaccaacag ggattgccct agtaacggcg agtgaagcgg caatagctca 60
aatttgaaag ctagccttcg ggttcgcatt gtaatttgta gaggatgtat tggggaagcc 120
gcctgtctaa gttccttgga acaggacgtc atagagggtg agaatccggt atgtgacagg 180
aaatggcacc ctatgtaaat ctccttcgac gagtcgagtt gtttgggaat gcagctctaa 240
atgggaggta aatttcttct aaagctaaat attggcgaga gaccgatagc gcacaagtag 300
agtgatcgaa agatgaaaag cactttggaa agagagttaa aaagcacgtg aaattgttga 360
aagggaagcg cttgcattca gacttgttta aactgttcgg ccggtcttct gacccgttta 420
ctcagtttgg acaggccagc atcagtttcg gcggcccgat aaaggctctg ggaatgtggc 480
ctccacttcg gtggaggtgt tatagcccag ggtgtaatac ggccagccgg gactgaggtt 540
cgcgcttcgg ctaggatgct ggcgtaatgg ttgtaagcga cccgtcttga aacacg 596
Claims (2)
1.一种耐辐射出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)MF1，其特征在于，所述的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)MF1的CGMCC保藏号为No.CGMCC11275。
2.如权利要求1所述耐辐射出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)MF1在制备黑色素的应用，其特征在于，所述的应用的制备方法通过如下制备方法获得：
(1)菌种的活化：将出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)MF1 CGMCCNo.CGMCC11275接种于改良的改良查氏固体培养基，28℃培养48h，进行菌种的活化；
(2)菌种的培养：将步骤(1)活化的菌株接种于改良查氏液体培养基，其中改良查氏液体培养基的装添量为100mL，葡萄糖添加量为10.3g/L，酵母浸粉添加量为2.02g/L，硫酸铵添加量为2.0g/L，NaCl添加量为0.5g/L，菌种接种量为2mL，30℃，180r/min摇床培养96h，获得液体培养物；所述的改良查氏液体培养基：硝酸钠3g，酵母浸粉0.5g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，葡萄糖30g，蒸馏水1000mL，PH自然，分装，灭菌；
(3)黑色素初提液的制备：将步骤(2)制备的液体培养物进行10000r/min离心5min处理，去除菌体，获得上清液即为黑色素初提液；
(4)黑色素粗提取物的制备：将步骤(3)制备的黑色素初提液使用与黑色素初提液等量的无水乙醇沉淀，并用与黑色素初提液等量的50％乙醇洗涤一次，于100℃干燥至恒重，即可获得黑色素。
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