CN101845396A

CN101845396A - 一种耐辐射真菌及其制备的红色素粗制剂

Info

Publication number: CN101845396A
Application number: CN 201010160446
Authority: CN
Inventors: 茆军; 张志东; 谢玉清; 唐琦勇
Original assignee: INSTITUTE OF MICROBIOLOGY XINJIANG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Current assignee: INSTITUTE OF MICROBIOLOGY XINJIANG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority date: 2010-04-30
Filing date: 2010-04-30
Publication date: 2010-09-29
Anticipated expiration: 2030-04-30
Also published as: CN101845396B

Abstract

本发明公开一种红色素产生菌的耐辐射真菌Fusarium chlamydosporum R36CGMCC No.3702及其制备的红色素制剂。将菌种接种于液体PDA培养基中，30℃培养、200rpm恒温培养12-24小时，以10％的接种量接种于PDA培养基，500ml三角瓶装150ml发酵液，发酵培养48-72小时；离心收集或过滤收集发酵培养物，加入酸溶液将菌体调至变为黄色，然后使用95％乙醇溶液提取，提取物经浓缩干燥后获得红色素制剂。该菌种对于⁶⁰Coγ射线具有强耐受性，是一种具有良好抗辐射真菌，不仅为天然红色素获得提供了新的菌种，同时也增加了一个新的天然红色素品种，具有广泛的应用领域。

Description

一种耐辐射真菌及其制备的红色素粗制剂

技术领域

本发明涉及微生物菌种及其应用领域，具体的说，本发明涉及天然色素的生产菌及其制备获得色素制剂的技术领域。

背景技术

红色素作为三个基本色素之一，可以与黄色素、蓝色素可相互搭配呈现出丰富色调，具有极高的应用价值。天然色素因无毒副作用，生物相容性安全性高、具有多种保健功能等特点，可广泛应用于食品、化妆品、保健品等行业。天然色素可从植物、动物、微生物中提取获得，而微生物来源因生产不受环境、气候、季节等因素影响，生产、提取方法简单，成本相对较低，是获得天然色素的理想途径。

目前，利用微生物发酵提取天然红色素所涉及的菌种包括真菌、放线菌和细菌，如红曲霉[林元山等，从红曲霉菌丝体中提取红色素的工艺，湖南农业大学学报(自然科学版)，2008，3：355-358)]、子囊菌[温春红等，子囊菌SD一9701产天然红色素的稳定性研究，天津师范大学学报(自然科学版)，2007，27(1)：24-29.]、绛红小单孢菌(王飞等，绛红小单孢菌227所产生红色素的理化性质研究，江苏农业科学，2009，2：243-245.)、海洋细菌Loktanella sp.(唐华等，产红色素海洋细菌Loktanella sp.发酵培养基的优化，浙江农业科学，2009，7：30-34.)、沙雷氏菌属菌[唐克华等，一株G-短杆菌红色素的特性研究，湖南农业大学学报(自然科学版)，2004，30(6)：522-525.]等。这些菌种的种类、数量及其产生的色素特性远不能满足各行业对天然红色素研究开发的需要。因此，筛选出能大量生产红色素的新型微生物菌种和具有不同特性红色素具有重要的科学研究和应用价值。

发明内容

本发明的目的在于利用本发明所提供的微生物菌种，通过发酵培养、提取制备获得红色素粗制剂。

本发明提供一种红色素产生菌的耐辐射真菌Fusarium chlamydosporumR36。

本发明通过从新疆干旱荒漠环境中取样，分离筛选得到多株菌，经过多级筛选，确定一株编号为R36，命名为Fusarium chlamydosporum R36。该菌株已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏日期为2010年3月26日，保藏号为CGMCCNo.3702。该菌种R36能在30kGray ⁶⁰Co辐照后良好存活。生长于固体PDA培养基(土豆200g、葡萄糖20g，琼脂15g、水1000mL)上菌落呈圆形、平坦、绒毛状、殷红色；菌丝有隔膜、分枝；分生孢子梗分枝或不分枝；分生孢子有大小两种类型，大型的是多细胞镰刀形，有1-3个平行隔膜，小型的呈卵圆形，多为单细胞，少数为多细胞(有1-2个隔膜)。使用Biolog Microstation System的FN测试卡检测其生理代谢活性，确定其除不能以N-乙酰基D-半乳糖胺、N-乙酰胺-β-D-甘露糖胺、D-阿拉伯糖、糊精、D果糖、L-海藻糖、D-半乳糖醛酸、a-D-葡萄糖-1-磷酸盐、葡萄醛酰胺、乳果糖、景天庚醛聚糖、D-塔格糖、溴代琥珀酸、y-羟基丁酸、D-乳酸甲基酯、琥珀酸、琥珀酸甲基酯、L-丙胺酸酰胺、甲基酰-L-谷氨酸、L-丙胺酸、尿苷、腺苷-5’一磷酸盐等作为唯一碳源，其它测试结果均为阳性，依照《真菌鉴定手册》对R36菌株进行形态学测定，生理生化检测确定R36菌株为Fusarium chlamydosporum中的成员。与Fusariumchlamydosporum具有最大的相似性为0.143，ITS1序列比对及进化分析确定该菌与Fusarium chlamydosporum同源性99.1％，建议分类地位为Fusariumchlamydosporum，暂定菌种名称为Fusarium chlamydosporum R36。

本发明具体提供的红色素产生菌Fusarium chlamydosporum R36，其生长对营养条件无特殊的要求，可以适合于真菌生长繁殖的常规培养基中繁育。

R36菌种可以采取斜面传代方式或真空冷冻干燥方式等常用微生物菌种保藏方法进行保藏。其中斜面传代保藏方法只要是在适合于菌种生长的固体培养基上，25℃下恒温培养48-72小时，待菌落完成生长时后置于4℃下恒温保藏，约6个月进行传代一次。利用真空冷冻干燥法保藏的菌种可在常温或低温条件下保藏1年以上。

进一步。本发明提供了由耐辐射真菌Fusarium chlamydosporum R36发酵提取制备获得的红色素制剂。将增殖培养的Fusarium chlamydosporum R36培养物接种于液体PDA培养基中，30℃培养、200rpm恒温培养12-24小时，以10％的接种量接种于PDA培养基，500ml三角瓶装150ml发酵液，发酵培养48-72小时；离心收集或四层纱布过滤收集发酵培养物中的菌体。加入酸溶液将菌体调至变为黄色(pH＜2)，然后使用95％乙醇溶液提取，提取物经浓缩干燥后所得的物质为红色素制剂，即为红色素粗提物。

本发明制备的红色素制剂，即为红色素粗提取物，是一种混合物，该红色素制剂干燥时呈红色粉末状，与常见微生物提取天然红色素溶解性不同，该色素在pH＞7时微溶于水、乙醇、甲醇，不溶于氯仿、乙酸乙酯、乙醚、丙酮等有机试剂；在pH＜4极易溶于水及乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯、乙醚、丙酮等有机试剂；在pH＞7呈红色，在可见区530nm处有一特异吸收峰；pH5.5左右呈橙色，pH＜4时呈黄色，在可见区400nm处有一特异吸收峰。该色素在pH 1～9.0范围内较为稳定；在pH＞7时具有较好的热稳定性和光稳定性，并具有一定的抗氧化特性；0.01M的Hg²⁺、Zn²⁺、Al³⁺、Pb²⁺、Sn²等离子对色素稳定性极小，Cu²⁺具有明显的增色作用。

通过实施本发明具体的技术指标，可以达到以下有益效果。

本发明提供的Fusarium chlamydosporum R36，对于⁶⁰Co γ射线具有强耐受性，是一种具有良好抗辐射真菌，不仅为天然红色素获得提供了新的菌种，同时也增加了一个新的天然红色素品种，为工业化生产天然红色素提供了新的途径；另外，本发明提供的红色素一些特性为其在食品添加剂、化妆品以及抗辐射保健品中的应用提供了可能。

附图说明：

图1显示为Fusarium chlamydosporum R36CGMCC No.3702发酵提取制备的天然红色素波长-吸收扫描图。

图2显示为自然光对Fusarium chlamydosporum R36CGMCC No.3702发酵提取制备的天然红色素的影响图。

图3显示为重金属对Fusarium chlamydosporum R36CGMCC No.3702发酵提取制备的天然红色素的影响图。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，仅在说明本发明所提供的菌种特性、该菌种的实验室生产制备方法及色素的特性，但本发明并不局限于此。

实施例1：Fusarium chlamydosporum R36CGMCC No.3702的分离纯化鉴定

1.分离

本发明所述的红色素产生菌Fusarium chlamydosporum R36CGMCC No.3702分离自新疆干旱荒漠地区，土样经⁶⁰Co γ射线20K Gray辐照处理后，采用的PDA培养基(土豆200g、葡萄糖20g，琼脂15g和水1000mL组成)培养基富集后稀释涂板，30℃恒温培养分离到获得。挑取该菌菌丝少许，连续划板纯化确认为纯菌株后，用于科研和保藏。菌种采用斜面传代方式或真空冷冻干燥方式等常用微生物菌种保藏方法进行保藏。

其中斜面传代保藏方法是在适合于菌种生长的固体培养基上，25℃下恒温培养48-72小时，待菌落完成生长时后置于4℃下恒温保藏，约6个月进行传代一次。利用真空冷冻干燥法保藏的菌种可在常温或低温条件下保藏1年以上。

2.培养条件：

培养基：PDA培养基；培养条件：30℃恒温培养48-72小时。

将保藏的R36菌种在PDA培养基上进行传代活化培养，检测菌落颜色变的同时检测是否有杂菌污染；将活化的菌种接种于液体PDA培养基中(无琼脂)，液体培养基装料量为150mL/瓶(500mL三角瓶)，30℃恒温，200rpm下培养72h，观察菌体生长情况与颜色变化。

3.繁殖：

用接种针取少量菌体于PDA琼脂培养基，37℃培养3天后，产生红色菌落，菌落呈圆形，平坦、绒毛状菌丝、殷红色。

4.菌种描述

本发明所述的Fusarium chlamydosporum R36CGMCC No.3702生长于固体PDA培养基(土豆200g、葡萄糖20g，琼脂15g、水1000mL)上菌落呈圆形、平坦、绒毛状、殷红色；菌丝有隔膜、分枝；分生孢子梗分枝或不分枝；分生孢子有大小两种类型，大型的是多细胞镰刀形，有1-3个平行隔膜，小型的呈卵圆形，多为单细胞，少数为多细胞(有1-2个隔膜)。使用Biolog MicrostationSystem的FN测试卡检测其生理代谢活性，确定其除不能以N-乙酰基D-半乳糖胺、N-乙酰胺-β-D-甘露糖胺、D-阿拉伯糖、糊精、D果糖、L-海藻糖、D-半乳糖醛酸、a-D-葡萄糖-1-磷酸盐、葡萄醛酰胺、乳果糖、景天庚醛聚糖、D-塔格糖、溴代琥珀酸、y-羟基丁酸、D-乳酸甲基酯、琥珀酸、琥珀酸甲基酯、L-丙胺酸酰胺、甲基酰-L-谷氨酸、L-丙胺酸、尿苷、腺苷-5’一磷酸盐等作为唯一碳源，其它测试结果均为阳性，

5.菌种的鉴定

依照《真菌鉴定手册》对R36菌株进行形态学测定，生理生化检测确定R36菌株为Fusarium chlamydosporum中的成员。与Fusarium chlamydosporum具有最大的相似性为0.143，ITS1序列比对及进化分析确定该菌与Fusariumchlamydosporum同源性99.1％，建议分类地位为Fusarium chlamydosporum，暂定菌种名称为Fusarium chlamydosporum R36。

实施例2：Fusarium chlamydosporum R36CGMCC No.3702的抗辐射特性

将实施例1获得菌株经孢子刚萌发或较短的菌丝体4000rpm离心收集菌体，用生理盐水反复洗涤3次后重悬浮制菌丝体悬浮液，在100Gray/min条件下进行⁶⁰Co γ射线辐照处理，辐照剂量分别为0、5、10、20、30kGray；辐照后涂布于PDA培养基上恒温培养，观察其菌体生长情况。其结果如表1所示。

表1辐照剂量对菌体生长的影响

R36菌种培养实验表明，在PDA固体培养基上菌落呈圆形、平坦、绒毛状，菌丝呈殷红色。在液体PDA液体培养基中，培养24小时出现明显的白色菌丝体，72h后呈殷红色的毛球状或绒线状菌丝体。辐照处理实验结果表明R36菌种对⁶⁰Co γ射线具有强耐受性，此特性可以用来对污染的菌种进行纯化或改善发酵培养菌种中的应用。

实施例3：红色素提取及其提取物吸光特性

按实施例1中所述的方法进行菌种的培养；将培养好的菌体经离心收集或四层纱布过滤收集；加入少量1M盐酸将菌体调至变为黄色(pH＜4)，然后使用95％乙醇溶液萃取，萃取物经浓缩干燥后所得的物质为红色素，即为红色素粗提物。制备的红色素粗提取物即本发明的红色素制剂，是一种混合物。

在10mL 0.02M pH 5.5醋酸钠-醋酸缓冲液中加入0.01g上述红色素粗提物，充分混匀，分别以0.02M HC l和NaOH调节至pH4.0和pH7.0，再以1000rpm、30S离心去除悬浮颗粒后进行200-800nm的光扫描分析。结果参见附图1所示。

实验结果显示，色素在pH为10.0时在可见光下530nm处有特异吸收峰；在pH为4.0时，在400nm处有特异的吸收峰。

实施例4：Fusarium chlamydosporum R36CGMCC No.3702产生红色素的溶解特性

分别取0.05g的上述红色素粗提物，加入1ml水，以0.02M HCl和NaOH分别调节pH至pH4.0和pH7.0。向上述液体中分别加入10ml水、甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、乙醚、乙酸乙酯，充分混匀后以10000rpm、30S离心去除悬浮颗粒，目测色素在不同pH下的溶解特性。

目测观察发现色素在pH7.0时，色素微溶于水、甲醇、乙醇，不溶于氯仿、丙酮、乙醚、乙酸乙酯。在pH4.0时，色素易溶于水、甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、乙醚、乙酸乙酯。

实施例5：pH对产生红色素制剂的影响

将本发明得到的红色素粗提物配制成饱和水溶液，并于1000rpm离心30Sec去除不溶物。各吸取10ml上述溶液置于不同试管中，分别利用HCl、NaOH调至不同pH的色素水溶液，并观察不同pH下色素的颜色变化。室温避光放置2d后，加入10ml 0.02M pH 7.0的K₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液混匀，于530nm测定其吸光值，计算残余率；

结果见表2。由表2可以看出本发明的红色素在pH1.0-11.0处理下色素极为稳定，在pH＞7呈红色，pH5.5左右呈橙色，pH＜4时呈黄色。

表2pH对色素的影响

实施例6：Fusarium chlamydosporum R36 CGMCC No.3702产生红色素的热稳定特性

将本发明得到的红色素粗提物配制成饱和水溶液，并于1000rpm离心30Sec去除不溶物。各吸取5ml上述溶液置于不同试管中，置于20℃、40℃、60℃、80℃、100℃水浴2h，以及120℃灭菌30min，迅速冷却至室温，于室温下测定530nm下的收光值，以未作保温处理的样本为对照计算色素的残余量，结果如见表3所示。由表3可以看出温度在小于80度处理时对色素影响不大，在120℃灭菌30min后色素损失仅为15.6％。

表3色素的热稳定性

实施例7：Fusarium chlamydosporum R36CGMCC No.3702产生红色素的光稳定特性

将本发明得到的红色素粗提物配制成饱和水溶液，并于1000rpm离心30Sec去除不溶物。各吸取5ml上述溶液置于不同试管中，密封置于自然光下照射1-9天，分别测定530nm下的吸光值，计算色素残余量。结果参见附图3所示。由附图2可以看出，本发明色素溶液在自然光照射下表现出一定的光稳定性，放置9d后仍有50％以上的残余量。

实施例8：Fusarium chlamydosporum R36CGMCC No.3702产生红色素的抗氧化特性

DPPH法：将本发明得到的红色素粗提物配制成饱和水溶液，并于1000rpm离心30Sec去除不溶物。分别吸取2ml色素溶液和2ml 0.2g/L DPPH标准溶液，快速混匀后置于扫描分光光度计上，515nm光波下进行时间-吸光值扫描(扫描时间为10min)，通过以下公式计算自由基消除率，消除率＝[1-(A_i-A_t)/A₀]×100％其中：A_i为色素与DPPH溶液混匀后的吸光值；A_t色素与DPPH溶液混匀，反应10min后的吸光值；A₀为水与DPPH溶液混匀后的吸光值。

Fenton法：加入1ml的0.15mol/L FeSO₄溶液，0.3ml的2mmol/L水杨酸，1ml上述红色素饱和水溶液，最后加入0.7ml 6mmol/L H₂O₂启动，25℃反应1h，测定OD510nm，按公式自由基清除率(％)＝[1-(Ai-A0i)/A0]×100％，计算，其中A0为对照不加样品，Ai为样品的吸光值，A0i为不加水杨酸样品的吸光值。

通过以上方法测定计算，DPPH法的自由基消除率为10.2％，Fenton法中自由基消除20.1％。

实施例9：金属离子对Fusarium chlamydosporum R36CGMCC No.3702产生红色素的影响

将本发明得到的红色素粗提物配制成饱和水溶液，并于1000rpm离心30Sec去除不溶物。各吸取5ml上述溶液置于不同试管中，分别加入等体积的0.02M的不同金属离子溶液，混匀，室温黑暗密闭放置1d后，采用差量法于530nm和700nm下测定其吸光值，计算吸光值差，并分析色素残余量，结果如图3所示。

参见附图3所示，可以看出0.01mol/L的金属离子对本发明红色素影响不大，铜离子具有明显的增色作用。

Claims

1.一种耐辐射真菌Fusarium chlamydosporum R36 CGMCC No.3702。

2.如权利要求1所述的耐辐射真菌Fusarium chlamydosporum R36 CGMCCNo.3702在对污染的菌种进行纯化或改善发酵培养菌种中的应用。

3.一种如权利要求1所述的耐辐射真菌Fusarium chlamydosporum R36 CGMCCNo.3702产生的红色素粗制剂。

4.如权利要求3所述的耐辐射真菌Fusarium chlamydosporum R36 CGMCCNo.3702产生的红色素粗制剂，其特征在于，所述的红色素粗制剂在pH＞7时微溶于水、乙醇、甲醇，不溶于氯仿、乙酸乙酯、乙醚、丙酮等有机试剂；在pH＜4极易溶于水及乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯、乙醚、丙酮等有机试剂；在pH＞7呈红色，在可见区530nm处有一特异吸收峰；pH5.5左右呈橙色，pH＜4时呈黄色，在可见区400nm处有一特异吸收峰；在pH 1～9.0范围内较为稳定；在pH＞7时具有较好的热稳定性和光稳定性，并具有抗氧化特性。

5.如权利要求3所述的耐辐射真菌Fusarium chlamydosporum R36 CGMCCNo.3702产生的红色素粗制剂，其特征在于，所述的红色素粗制剂，0.01M的Hg²⁺、Zn²⁺、Al³⁺、Pb²⁺、Sn²等离子对其色素稳定性极小，Cu²⁺具有明显的增色作用。