CN113061552A - 一种紫菜丝状体白化病致病菌 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种紫菜丝状体白化病致病菌，其保藏编号为CGMCCNo.21174。本发明所提供的菌株在筛选抗白化病的紫菜品系中的应用。本发明所筛选获得的紫菜丝状体白化病致病菌洛克氏菌GN‑R‑1株经自由丝状体感染实验证实，可引起健康紫菜丝状体产生白化病症，是紫菜苗期白化病的致病菌；该菌株分离发现有利于紫菜白化病鉴定和疾病防控，可以用于筛选具有抗白化病的紫菜品系。

Description

一种紫菜丝状体白化病致病菌

技术领域

本发明属于养殖海藻病害防治技术领域，具体涉及一种紫菜丝状体白化病致病菌。

背景技术

紫菜是一种重要的经济藻类，被誉为海鲜佳品，味美可口，营养丰济。我国山东和江苏等地以栽培条斑紫菜为主，浙江和福建等地则以栽培坛紫菜为主。目前，我国是世界最大的紫菜生产国，每年栽培面积上百万公顷，年产量可达170万吨以上，是我国海藻养殖业的重要支柱。随着养殖规模扩大、养殖环境恶化、苗种退化以及养殖管理不当等问题日益严峻，栽培紫菜严重病害频发与生产需求增长之间的矛盾也愈发突出。

紫菜的生产过程分为贝壳丝状体室内育苗和叶状体海区栽培两个阶段。在这两个阶段中都会发生各种各样的疾病，给紫菜生产带来巨大损失。在丝状体育苗期间，由细菌引发的黄斑病和由真菌引发的白斑病都是会导致育苗失败的严重病害。此外，贝壳丝状体在养殖过程中还有可能出现一种白色条纹状或斑块样的病变，俗称“刮大白”、“鬼剃头”或“白条”。这种病害发生后，贝壳被漂白，丝状体损失，且漂白部位的贝壳呈现粗糙质感，该病症不同于黄斑病和白斑病引起的病变，被感染的藻体内部会出现空胞化，但细胞壁可以在一段时间内保留。并且，该病扩散与蔓延的速度较黄斑病缓慢。基于这些特征，将其命名为紫菜贝壳丝状体白化病。

迄今为止，对于紫菜丝状体白化病的报道尚属首次，且其致病原因也未得到解决。

发明内容

本发明的目的是提供一种紫菜丝状体白化病致病菌，该致病菌可用于进行紫菜丝状体白化病的鉴定，建立紫菜丝状体白化病的治疗方法，从而弥补现有技术的不足。

本发明所提供的紫菜丝状体白化病致病菌为洛克氏菌 (Loktanella sp.)GN-R-1株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21174，保藏日期为2020 年11月13日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

GN-R-1菌株的最佳培养条件为22℃，盐度20，pH 7.0。

由于白斑病、黄斑病后期均会产生白化病征，易产生混淆。本发明所提供的菌株可以用于藻类白化病的鉴定。

本发明所提供的菌株可应用于抗白化病的紫菜品系的筛选；

本发明所提供的菌株还可以用于筛选预防和治疗紫菜丝状体白化病的方法。

本发明所筛选获得的紫菜丝状体白化病致病菌洛克氏菌GN-R-1 株经科赫法则验证，可引起健康紫菜丝状体产生白化病症，是紫菜苗期白化病的致病菌；该菌株的分离发现有利于紫菜白化病疾病鉴定与防控，可以用于筛选具有抗白化病的紫菜品系。

附图说明

图1：患有白化病的紫菜贝壳丝状体照片图；

图2：使用GN-R-1菌株感染自由丝状体病症观察照片图，蓝色部分为由伊文思蓝染色的丝状体，死细胞呈蓝色，存活细胞呈红色。

图3：GN-R-1菌株感染丝状体的电镜观察图，a为感染前期，b 为感染后期。其中Pyropia为紫菜丝状体，GN-R-1为菌株。

图4：GN-R-1菌株16s rDNA片段系统聚类结果。

图5：GN-R-1菌株的最佳生长条件的响应面实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明进行详细的描述。

实施例1：致病菌的分离与纯化

2018年10月从江苏连云港某紫菜育苗场的白化病紫菜贝壳丝状体(图1)中分离细菌。用灭菌海水(使用玻璃纤维滤膜过滤，加热至沸腾，持续沸腾2分钟后冷却待用)将患病贝壳表面冲洗3～2次，然后用灭菌棉球(经湿热灭菌)擦干。用灭菌刀片刮取贝壳丝状体发病部位，直至露出白色钙质部分。用1mL灭菌海水溶解刮取物装入 1.2mL无菌离心管中。随后用灭菌海水将溶解物梯度稀释至10^-2、10^-3倍。

取100μL上述稀释溶液分别涂布于已灭菌的NaCl浓度为1％的 TSA培养基、2216E海水培养基和TCBS培养基平板中，28℃培养 1～7d。

挑取形态不同的菌落，采用划线接种法进行分离菌种的纯化。 28℃恒温培养箱中培养36～48h后进行菌落形态观察。将得到的菌株进行编号。纯化菌株编号后置于40％甘油、-80℃保存。

纯化实验分离的GN-R-1经健康紫菜丝状体感染实验验证，具有致病性。

实施例2：菌株致病的研究

将GN-R-1菌株按1％(1:100)的比例接种于2216E液体培养基中，180r/min，28℃培养16h。收集菌液于无菌离心管中，以8000 r/min离心2min。离心完成后，弃上清，取沉淀。用适量灭菌营养海水重悬清洗，重复3次。重悬清洗完成后加入适量灭菌营养海水重悬制成菌悬液。利用平板菌落计数法计算细菌浓度。调整细菌浓度为 10⁷CFU/ml左右。

感染所用坛紫菜自由丝状体由浙江省海洋生物技术重点实验室藻种库提供。使用无菌海水培养丝状体，加入宁大三号母液，最终培养基中的营养物浓度为100mg/L KNO₃,10mg/L KH₂PO₄,2.2mg/L FeSO₄,0.22mg/L MnSO₄和20mg/L EDTA-Na₂，培养条件为20℃，光照强度30μmol·photons/m²s¹和光暗周期为12:12h(L:D)。在感染实验之前，将丝状体打碎至200～300μm的长度，恢复一周后使用抗生素进行无菌处理。抗生素终浓度为300μg/mL氨苄青霉素、100μg /mL卡那霉素和100μg/mL庆大霉素，黑暗培养18h。然后用无菌海水冲洗三次以去除抗生素残留，转移至新鲜培养基中后在正常光周期下继续培养(L:D＝12:12h)。12h后再次更换新鲜培养液，静置2d 后待用。

取适量经过预处理的坛紫菜自由丝状体于无菌六孔板中，孔板内加入2mL菌液与紫菜丝状体共培养。空白实验组加入2mL灭菌营养海水共培养。培养条件为：温度28℃，光照强度30 μmol·photons·m^-2·s^-1，光暗周期为L:D＝12:12。分别于培养0h、6h、 12h、24h、48h、72h取紫菜自由丝状体，经伊文思蓝避光染色10min 后进行光学显微观察。如图2所示，感染72h后丝状体最高死亡率高达92％，平均死亡率为62％左右。

取感染后的丝状体进行电镜观察，发现GN-R-1在丝状体表面分泌胞外物质，形成生物膜样结构(图3)。该菌富集的丝状体部分细胞壁破裂，丝状体细胞内容物流出，最终导致细胞空胞化。

选取GN-R-1侵染的紫菜丝状体，重复实施例1致病菌的分离、纯化步骤，经16SrDNA分子鉴定是同一株细菌。科赫法则验证该菌株是导致紫菜贝壳丝状体白化病的致病菌。

实施例3：GN-R-1的16S rRNA编码序列分析与菌株特征

提取细菌基因组DNA，用以下引物(序列信息如下：

27F：2'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；

1429R：2'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行16S rDNA的PCR 扩增。经过NCBI和系统发育树比对(图4)，鉴定该菌属于Loktanella 属。

将菌株命名为洛克氏菌(Loktanella sp.)GN-R-1株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21174，保藏日期为2020年11月13日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

洛克氏菌(Loktanella sp.)GN-R-1株菌落不透明，凸起，且边缘规则。扫描电子显微镜显示GN-R-1呈卵圆形，具有鞭毛。

设置环境因子梯度为温度(A：10、22、40℃)，盐度(B：10、 20、30)，pH为(C：2、7、9)，进行感染条件的响应面分析。预测 R1值对编码自变量A、B、C的二次多元回归方程为 R1＝+0.38+0.082*A+0.022*B+0.028*C+0.026*A*B+0.013*A*C-0.012* B*C-0.100*A²+7.166E-004*B²-0.036*C²。结果显示，菌株GN-R-1的最佳培养条件为22℃，盐度20，pH 7(图2)。

本发明所筛选的Loktanella sp.GN-R-1株可用于紫菜育苗期白化病疾病的鉴定、防控以及抗白化病种苗的筛选，以期预防紫菜苗期白化病的爆发，获得紫菜抗病种苗种质资源，减少经济损失。

Claims (5)

1.一种紫菜丝状体白化病致病菌，其特征在于，所述的紫菜丝状体白化病致病菌的保藏编号为CGMCC No.21174。

2.权利要求1所述紫菜丝状体白化病致病菌在紫菜白化病鉴定中的应用。

3.权利要求1所述紫菜丝状体白化病致病菌在筛选抗白化病的紫菜品系中的应用。

4.权利要求1所述紫菜丝状体白化病致病菌在筛选预防和治疗紫菜丝状体白化病的方法中的应用。

5.权利要求1所述紫菜丝状体的最佳培养条件为25℃，盐度20，pH 7.0。

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