CN115747123B - 一种海带致病菌的拮抗菌 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种海带白化病致病菌的拮抗菌，为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)X‑2株，其保藏编号为CGMCC No.24995。本发明所提供的菌株可用于预防和治疗海带白化病。本发明所筛选获得的海水弧菌X‑2株经侵染健康海带幼孢子体证实可缓解由海水假交替单胞菌X‑8株引起的白化病症，是海带苗期白化病致病菌的拮抗菌；使用该菌株可显著降低海带白化病的发病率。
Description
技术领域
本发明属于养殖海藻病害防治技术领域，具体涉及一种海带白化病致病菌的拮抗菌。
背景技术
海带是世界上最重要的养殖海藻之一，中国海带的产量及海藻胶的产量分别占世界的60％和90％。与陆地作物一样，海带在苗期和养殖期间也会发生各种病害。目前认为海带的病害几乎是由细菌引起的，中国已经开展了大量的致病菌分离、鉴定研究，以确定海带病害的致病菌。
近期，在海带育苗开始后一个半月或两个月时频繁爆发白化病。发病时，海带幼苗的尖端(远离分生组织)会变白腐烂，最后白化组织脱落，严重影响健康海带种苗的供应以及后续的养殖生产。海水假交替单胞菌X-8株(Pesudoalteromonas X-8)已被证实为海带白化病致病菌，但目前尚无有效的白化病的控制策略。
考虑到条件致病菌可能来自宿主相关的微生物群和/或周围环境，有效的疾病控制需要考虑宿主附生微生物群之间的相互作用。研究表明：宿主的表面的附生菌具有保护宿主免受致病菌的侵染的作用。但迄今为止，水产养殖生物宿主致病菌拮抗菌的研究主要用于水产养殖动物领域，海藻致病菌的拮抗菌的筛选仍是空白。
发明内容
本发明的目的是提供一种海带白化病致病菌的拮抗菌，从而预防白化病的发生。
本发明所提供的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)X-2株为海带白化病致病菌假交替单胞菌X-8株的拮抗菌，X-2株的保藏编号为CGMCC No.24995，保藏日期为2022年05月30日；保藏单位为中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明所提供的菌株用于拮抗海带白化病致病菌。
本发明提供的海水弧菌X-2株可用于预防和治疗海带白化病。
所述的海水弧菌X-2株，其培养温度优选为25℃。
本发明再一个方面提供一种用于拮抗海带白化病致病菌的制品，其中包含有所述的海水弧菌X-2株的活菌。
本发明所筛选获得的海水弧菌X-2株经侵染健康海带幼孢子体证实可缓解由海水假交替单胞菌X-8株引起的白化病症，是海带苗期白化病致病菌的拮抗菌；使用该菌株可显著降低海带白化病的发病率。
附图说明
图1：X-2对X-8的拮抗作用图，其中透明圈代表X-2对X-8的抑制效果，Bar：10mm。
图2：侵染健康海带幼孢子体的照片图，其中A：显微镜观察下健康海带幼孢子体组织；B：显微镜下观察接种假交替单胞菌X-8株后白化病组织，Bar:50μm；C：显微镜下观察同时接种弧菌X-2株与假交替单胞菌X-8株后白化病组织，Bar:50μm；D：各处理组健康海带组织块所占的比例。
图3：X-2的菌落形态及透射电镜图像，其中A：X-2菌落形态特征，Bar：2cm；B：X-2的透射电子显微镜图像(负染法)，Bar：1μm；C：X-2的透射电子显微镜图像(超薄切片法)，Bar：200nm。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1：菌株的分离、纯化
2017年12月从山东荣成某海带育苗场采集白化病的海带幼苗，存放在装有冰袋的采样箱中，运回实验室，分离纯化表面附生菌。用无菌海水冲洗白化病的海带幼苗，去除表面杂质。将患病的幼苗切成小块并研磨成匀浆。然后用十倍稀释法将匀浆稀释，并取120μL各稀释液分别涂布于Zobell 2216E固体培养基上，25℃培养培养24-72小时。根据形态学特征，选择不同的单菌落在新的Zobell 2216E固体培养基上至少三次划线纯化。纯化后的菌株储存在30％甘油中，于-80℃保存。在本次纯化实验中，共分离出10株纯化的菌株。
实施例2：筛选海带白化病致病菌的拮抗菌
从-80℃冰箱取出保存的菌液，经过三次活化后根据伯克霍尔德琼脂扩散实验，筛选对致病菌假交替单胞菌X-8具有拮抗活性的菌株。将活化的1mL X-8(OD≈1.0)接种至100mL含0.6％琼脂的Zobell2216E培养基中，倒入无菌培养皿中。将2μL的待测菌株滴在上述制备好的培养基中，25℃培养一周。抑菌圈半径≥5mm，表明具有抑菌活性。经验证X-2菌株有明显的抑菌活性(图1)。
实施例3：海带幼孢子体侵染实验
将活化好X-2菌株4000×g离心20min后重悬于无菌海水中。侵染前选取生长状态良好、健康的海带幼孢子体，置于盛有无菌海水的培养皿中，然后用灭菌刀片将孢子体切割成小块(1.0cm×1.0cm)。将海带组织块随机分配至三个处理组：(1)无菌海水(对照组)；(2)接种致病菌假交替单胞菌X-8(OD≈1.0)；(3)同时接种X-2和致病菌假交替单胞菌X-8，置于光照培养箱中培养。培养温度为10±0.5℃，光照强度为160μmol·m-2·s-1，光周期为L：D＝12h：12h。侵染16小时后，健康海带幼孢子体在对照组中所占比例为96.7％；在假交替单胞菌X-8处理组中所占比例为13.3％；同时接种X-2与X-8处理组中所占比例为50％。接种X-2显著降低了X-8引起的白化病的致病率(图2)。
实施例4：海带致病菌的拮抗菌株的分子鉴定
对X-2菌株进行基因组测序，经过NCBI比对，所筛选的菌株X-2株与来自中国的新喀里多尼亚弧菌--Vibrio alginolyticus的相似度最高。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24995，保藏日期为2022年05月30日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
X-2株于TCBS培养基中培养，菌落的颜色为橙色，不透明，凸起，且边缘规则。透射电子显微镜(负染法)显示X-2是杆状，具有极生单鞭毛(图3)。
X-2株的培养条件如下：将处于对数生长期的X-2菌液稀释成10-6，在TCBS培养基上涂布；培养基：TCBS培养基，培养条件：25℃；培养时间：24h，可有效扩增X-2菌株。
本发明所筛选获得的海水弧菌X-2可缓解由海水假交替单胞菌X-8株引起的白化病症，使用该菌株可用于预防和减轻海带白化病的发生。
Claims (4)
1.一种溶藻弧菌，其特征在于，所述的溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）的保藏编号为CGMCC No.24995。
2.权利要求1所述的溶藻弧菌在拮抗海带白化病致病菌中的应用，所述的海带白化病致病菌为海水假交替单胞菌X-8株。
3.一种治疗海带白化病的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1所述的溶藻弧菌来进行治疗，所述的海带白化病致病菌为海水假交替单胞菌X-8株。
4.一种用于治疗海带白化病致病菌的制品，其特征在于，所述的制品中包含有权利要求1所述的溶藻弧菌的活菌，所述的海带白化病致病菌为海水假交替单胞菌X-8株。
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