WO2016122065A1 - 다시마 배지를 이용한 다시마 병원세균 분리방법 - Google Patents

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WO2016122065A1
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kelp
medium
pseudoalteromonas
powder
bacteria
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PCT/KR2015/007487
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박명애
김석렬
지보영
전창영
오윤경
이순정
오명주
김위식
김종오
최성제
Original Assignee
대한민국(관리부서:국립수산과학원)
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
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    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/045—Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a tangle medium for isolating specific pathogens inhabiting kelp, and more particularly, Pseudoalteromonas sp.
  • the present invention relates to a kelp medium capable of specifically separating bays and a method for separating pathogens using the same.
  • One of the seaweeds, Laminaria has a distinctive part of the body, the attachment part, the stem, and the leaf part, and the whole part is composed of the opposing shape. It is about 2 ⁇ 3m long and 25 ⁇ 30m wide.
  • the central part of lobe forms a thick middle part, and both edges of the middle part have grooves vertically.
  • the outer part of the middle part becomes thinner gradually, and the edge has large wrinkles like waves.
  • On both edges of the middle part of young kelp there is a vertical convex dragon pattern, but it disappears as it grows, and in the water lies the grooved side up.
  • Kelp is distributed in the place where turbulent and Korean wave merge. In Korea, it was originally distributed only in the north of Wonsan, but after introducing kelp from Hokkaido, Japan, cultivating spores in indoor tanks and farming them on the east and south coasts. It can be assumed that it became native. Since ancient times, kelp has been used for food in Korea, Japan, and China, and in China, it has been regarded as medicinal as a source of iodine.
  • bacterial spot disease which occurs in cultured kelp, is a disease in which leaflets die off due to the enlargement of the affected area due to pore disease caused by the extinction of aquatic animals and other pore diseases.
  • the leaves of infected kelp have numerous holes and the most prominent sites are 40-200 cm from the base of the leaf.
  • the leaves In the early days of infection, the leaves have holes in the edges of the leaf, and in the middle stage, their ranges become wider.In later stages, the edges of the leaves are corroded and eliminated, and the remaining middle part is discolored, and the entire leaf is completely discolored and melted. .
  • the leaf When microscopic examination of the leaf which began to pierce, it consists of superficial cells (yellow-green cells 10-20 ⁇ m in diameter) and thread-shaped hearing cells from the outer to the inner side of the leaf, and on the outside of the surface layer is a transparent, polysaccharide-rich membrane.
  • the cuticle layer protects the internal tissues.
  • the surface cells die off and the discolored areas do not have a cuticle layer, and the surface cells are also removed. As these lesions extend into the surrounding tissue and reach the back of the leaf, a hole is drilled.
  • Pseudoalteromonas sp Bacterial bacteria of Alteromonas genus are classified into Alteromonas genus and Pseudoalteromonas genus according to the differences in the nucleotide sequence of 16S rRNA gene, and are named Pseudoalteromonas elyakovii .
  • the causative organism is Gram-negative, aerobic bacillus, and has the hairs.
  • the tip of the cell is round and the size is 0.8 ⁇ m ⁇ 1.8-4 ⁇ m when cultured in marine agar, and the developmental temperature is 10-37 °C (optimal 25- 30 °C) and cannot develop at 40 °C.
  • the present invention provides a method for separating kelp medium and kelp pathogens capable of specifically separating only Pseudoalteromonas sp., The causative agent of bacterial pore disease.
  • the present invention provides a kelp medium capable of pure culture of Pseudoalteromonas sp. And a method for detecting the causative agent of bacterial pore disease using the same.
  • the method for separating kelp pathogens using kelp medium is to remove the contaminants attached to the outside of the kelp leaf using tap water and 70% alcohol, and then treat it with sterile seawater to be 1: 9 (1 g / 9 ml). After grinding, the mixture was kept at room temperature for 10 minutes, and 100 ul of the supernatant was plated in the kelp medium prepared above, followed by incubation at 20-25 ° C. for 7 days to separate pathogens.
  • the method for separating kelp pathogens using the kelp medium of the present invention can be applied to the disease diagnosis and pore prediction system of kelp by specifically separating Pseudoalteromonas sp. Which is the causative agent of bacterial pore disease.
  • Figure 1 shows the kelp medium of the present invention (the same as Figure 1 of Korean Application No. 10-2015-0013337).
  • Figure 2 shows a separate picture of kelp hospital bacteria using kelp medium of the present invention (the same as Fig. 2 of Korean Patent Application No. 10-2015-0013337).
  • Figure 3 shows the pathogens isolated and cultured by the type of medium containing the kelp medium of the present invention (the same as Figure 3 of Korean Patent Application No. 10-2015-0013337).
  • the present invention is a kelp medium is a kelp powder as an active ingredient in a certain amount of NaCl dissolved in powder and distilled water to prepare a kelp medium production process, bacterial pathogens from kelp infected with bacterial pore disease
  • the treatment may be performed by culturing in a plurality of medium containing the kelp medium of the present invention to separate the kelp pathogen, the process of identifying and identifying bacteria using a specific primer as a cultured sample.
  • Example 1 A method for preparing kelp solid medium
  • Kelp powder in the production process of kelp solid medium of the present invention is a collection and sorting step of collecting and selecting the appropriate kelp raw material; Washing the selected kelp by using natural washing water or additives at an appropriate temperature to remove salts and impurities; Cutting process to increase the kelp surface area by cutting the kelp to an appropriate size of about 1 to 3cm after the washing step; A drying step of completely drying the cut kelp at about 50 to about 60 ° C. for about 3 to 5 hours; The completely dried kelp may be made into a grinding process to grind the grinder to 8 to 9 mesh in a grinder into a powder form.
  • kelp solid medium of the present invention Disease testing of kelp was performed using the kelp solid medium of the present invention.
  • the kelp samples used to isolate the pathogens of kelp are collected from kelp farms located in Whang, Busan, and Gyeongsangbuk-do, Korea, from April to September. It was quickly transported to the laboratory and used for disease testing.
  • the disease test was used as a sample of the kelp leaf and the dropped kelp leaf of the diseased site determined to be infected with bacteria. Samples were classified into 1 ⁇ 3 samples in which leaflets were dropped outwardly, and 4 ⁇ 5 samples showing leaflet symptoms, which are infections caused by bacteria (see Table 1).
  • Bacterial testing was carried out to remove the contaminants attached to the outside of the kelp leaf of the abnormal site using tap water and 70% alcohol, and then treated with 1: 9 (1g / 9ml) with sterile seawater.
  • Figure 2 shows a separation of kelp hospital bacteria using kelp medium of the present invention.
  • the kelp powder is preferably included at a rate of at least 3%.
  • Bacteria isolated from the medium were extracted by DNA using boiling method, and primers used for polymerase chain reaction based on prokaryotic 16S ribosomal RNA gene were as follows.
  • 519F 5'-CAGCMGCCGCGGTAATWC-3'1094R: CTTAACCCAACATCTCACGA
  • PCR Polymerase chain reaction
  • PCR amplification products were identified using 1.5% agarose gel, purified using gel DNA extration kit, and then sequenced using ABI PRISM dye terminator sequencing chemistry. The analyzed sequences were identified by blast search of national center for biotechnology infermation (NCBI).
  • Figure 3 shows the pathogenic bacteria isolated and cultured for each type of medium containing the kelp medium of the present invention.
  • Table 1 shows bacteria isolated according to conventional commercially available BHIA medium (Brain heart infusion agar), MA medium (marine agar) and the kelp medium (Dasima agar) of the present invention. The number of bacteria isolated was measured by colony forming units.
  • the kelp medium of the present invention can be isolated by purely cultivating Pseudoalteromonas sp., A causative agent of bacterial pore disease in kelp, and predicts the early stage infection of bacterial pore disease of kelp and the symptoms of leaf disease as a symptom of disease.
  • Pseudoalteromonas sp. A causative agent of bacterial pore disease in kelp, and predicts the early stage infection of bacterial pore disease of kelp and the symptoms of leaf disease as a symptom of disease.

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Abstract

본 발명은 다시마를 이용하여 다시마 내에 서식하는 병원세균을 분리하는 방법으로 다시마의 세균성 구멍병(bacterial spot disease)를 일으키는 원인균인 Pseudoalteromonas sp.만을 다시마 배지(DA)를 이용하여 특이적으로 분리하여 세균성 구멍병의 질병진단 및 예보시스템으로 적용하여 피해확산을 조기에 차단할 수 있다.

Description

다시마 배지를 이용한 다시마 병원세균 분리방법
본 발명은 다시마 내에 서식하는 특정한 병원세균을 분리하기 위한 다시마배지에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 다시마의 세균성 구멍병(bacterial spot disease)을 일으키는 원인균인 Pseudoalteromonas sp.만을 특이적으로 분리할 수 있는 다시마 배지 및 이를 이용한 병원세균 분리방법에 관한 것이다.
해조류(海藻類)는 고등식물에서 볼 수 있는 것처럼 뿌리, 줄기, 잎의 구별이 뚜렷하지 않고, 유관속이 발달하지 않아서 영양분의 섭취는 식물체 전체에서 일어난다. 우리나라 사람들은 예로부터 해조류를 매우 즐겨 식용으로 이용하여 왔으며 따라서 해조류의 생산에 많은 관심을 기울여 왔다. 현재 우리나라의 해조류 생산량은 전체 수산물 생산량 중 대략 25%를 차지하는 대규모 수산자원으로 세계적인 해조 생산국으로 알려져 있다.
해조류 중 하나인 다시마류(Laminaria)는 몸은 부착기, 줄기, 엽상부로 그 부분이 뚜렷하고, 전체는 댓입모양으로 이루어진다. 크기는 길이가 약 2~3m, 폭이 25~30m이고, 엽상부의 중앙 부분은 두꺼운 중대부를 이루고 있으며 중대부의 양쪽 가장자리에는 세로로 홈이 있다. 중대부의 바깥쪽은 점차 엷어지고, 가장자리에는 물결과 같은 큰 주름이 있다. 어린 다시마의 중대부 양쪽 가장자리에는 세로로 오목볼록한 용무늬가 있으나 자라면서 없어지고, 물속에서는 홈이 있는 쪽을 위로 하여 누워있다.
다시마는 난류와 한류가 합쳐지는 곳에 분포하며, 우리나라에서는 원래 원산 이북에만 분포하고 있었으나, 일본 북해도산 다시마를 도입하여 실내 수조에서 배우체를 배양하여 동해안과 남해안에서 양식을 하게 됨에 따라서 그 후 동해 연안에도 자생하게 된 것이라 추측할 수 있다. 예부터 다시마는 우리나라를 비롯한 일본, 중국에서 식용으로 사용해 왔으며, 특히 중국에서는 요오드 공급원으로서 약용으로 더 소중하게 여겨왔다.
한편, 양식 다시마에서 발생하는 세균성 구멍병(bacterial spot disease)은 표생 동물의 식해에 의한 구멍병과 다른 구멍병으로 환부인 구멍이 확대됨에 따라 엽체가 고사하여 탈락하는 질병이다.
감염된 다시마의 엽체에는 무수한 구멍이 있고 가장 많이 나와 있는 부위는 엽체의 기부에서 40~200cm의 부위이다. 감염 초기의 엽체는 엽체의 가장자리에 구멍이 생기고 중기에는 그 범위가 넓어지며, 후기가 되면 엽체의 가장자리는 부식되어 탈락되고 남아있는 중대부도 황색으로 변색되고, 말기에는 엽체 전체가 완전히 변색되어 녹아버린다.
구멍이 뚫리기 시작한 엽체를 현미경으로 검경하면 엽체의 바깥에서 안쪽으로 표층세포(직경 10-20㎛의 황녹색 세포)와 실모양의 수청세포로 구성되어 있고, 표층의 바깥에는 다당질의 단단한 막인 투명한 큐티클 층이 내부의 조직을 보호하고 있다. 그러나 구멍이 뚫린 엽체는 표층세포가 사멸하여 등색으로 변색된 부위는 큐티클층이 없고 표층세포도 탈락되어 있다. 이러한 병변이 주변 조직으로 확대되면서 엽체의 뒷면에 도달하게 되면 구멍이 뚫리게 된다.
이러한 구멍병이 발생하는 시기는 7-8월로, 주로 봄과 여름의 강수 또는 하천수의 유입으로 염분 농도가 저하되거나 오물 등에 의해 어장이 노화된 경우, 6-8월의 해수 온도가 평년에 비해 고온이거나 변동이 심할 때 또는 봄, 여름의 일기불순과 같은 해수의 염분 또는 수온변화의 이상 현상이 원인이 되어 다시마의 성장이 불량한 경우에 발병될 수 있다.
Pseudoalteromonas sp.는 세균성 구멍병의 원인균으로 Alteromonas속의 세균은 16S rRNA 유전자의 염기서열의 차이에 따라 Alteromonas 속과 Pseudoalteromonas 속으로 구분되며 현재는 Pseudoalteromonas elyakovii라 명명되었다.
원인균은 그람 음성, 호기성 간균으로 극모를 가지고 있으며, 균체의 끝은 둥근형태를 띄고 크기는 marine agar에 배양하였을 때는 0.8㎛×1.8-4㎛이고, 발육 가능온도는 10-37℃(최적 25-30℃)이며 40℃에서는 발육하지 못한다.
최근에는 배우체에서도 Pseudoalteromonas sp.의 감염에 의해서 filamentous의 탈색, 세포팽창, 원형질체의 파괴 및 엽체가 소실되면서 폐사가 보고되고 있다. 따라서 원인균의 검사와 조사를 보완하기 위해서는 원인균을 분리하고 그 분류학적 및 생리적 특성을 분석을 위해서 다시마로부터 원인균을 분리할 수 있는 방법이 필요하다.
본 발명은 세균성 구멍병의 원인체인 Pseudoalteromonas sp.만을 특이적으로 분리할 수 있는 다시마 배지 및 다시마 병원세균 분리방법을 제공한다.
본 발명은 Pseudoalteromonas sp.의 순수 배양이 가능한 다시마 배지 및 이를 이용한 세균성 구멍병의 원인체를 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 Pseudoalteromonas sp.의 순수 배양이 가능한 다시마 배지 제조 방법은 다시마를 분쇄한 파우더와 NaCl을 넣고, 증류수 1L에 용해시킨 후 agar powder을 첨가하여 용해시키는 단계, 상기 용해된 용액을 autoclave에서 121℃로 15분간 가압 멸균시키는 단계, 상기 멸균과정을 배지를 60℃까지 식힌 후 petridish에 약 25ml 분량으로 담아 응고시키는 단계로 이루어진다.
다시마 배지를 이용한 다시마 병원세균 분리방법은 다시마 엽체의 이상부위를 수돗물과 70% 알코올을 사용하여 외부에 부착된 오염원을 제거한 후, 멸균 해수로 1:9 (1 g/9 ml)가 되게 처리하여 마쇄한 다음, 10분간 실온에 유지시킨 후, 상청액 100 ul를 상기에서 제조된 다시마 배지에 도말한 후 20-25℃에서 7일간 배양하여 병원세균을 분리한다.
본 발명의 다시마 배지를 이용한 다시마 병원세균 분리방법은 세균성 구멍병의 원인균인 Pseudoalteromonas sp.을 특이적으로 분리함으로서 다시마의 질병진단 및 구멍병 예보시스템으로 적용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 다시마 배지를 나타낸다 (한국출원 제10-2015-0013337호의 도 1과 동일한 것임).
도 2는 본 발명의 다시마 배지를 이용한 다시마 병원세균 분리사진을 나타낸다 (한국출원 제10-2015-0013337호의 도 2와 동일한 것임).
도 3은 본 발명의 다시마 배지를 포함한 배지종류별 배양되어 분리된 병원세균을 나타낸다 (한국출원 제10-2015-0013337호의 도 3과 동일한 것임).
본 발명은 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다시마 배지를 다시마파우더를 유효구성 성분으로 일정량의 NaCl을 파우더와 증류수에 녹여 구성하는 다시마 배지 제조과정, 세균성 구멍병에 감염된 다시마로부터 병원세균을 처리하여 본 발명의 다시마 배지를 포함하는 다수개 배지에서 배양하여 다시마 병원세균을 분리하는 과정, 배양된 시료로 특정 프라이머를 이용하여 세균을 동정하여 확인하는 과정으로 이루어질 수 있다.
이하, 실시예를 중심으로 다시마 배지를 이용한 다시마 병원세균 분리방법에 대해 설명하고자 하나 본 발명이 이에 한정되지는 않는다.
실시예 1. 다시마 고체배지 제조방법
도 1은 본 발명의 다시마 배지를 나타낸다. 본 발명의 다시마 고체배지 제조과정에서 다시마 파우더는 적절한 다시마 원료를 채취하고 선별하는 채취 및 선별공정; 상기 선별된 다시마를 적정온도의 자연세척수 또는 첨가물을 이용하여 염분과 불순물을 제거하는 세척공정; 상기 세척공정 후 다시마를 약 1 내지 3cm의 적정크기로 절삭하여 다시마 표면적을 높이는 절삭공정; 상기 절삭된 다시마를 섭씨 50~60℃에서 약 3~5시간동안 완전건조시키는 건조공정; 상기 완전건조된 다시마를 그러인더(grinder)에서 8~9mesh로 그라인딩하여 파우더(powder)형태로 만드는 그라인딩공정으로 이루어질 수 있다.
삼각플라스크에 다시마 파우더(powder) 10 내지 30g과 NaCl 10g을 넣고 증류수 1L에 용해시킨 후, agar powder 15g을 첨가하여 용해시킨다. 상기 조성물이 용해된 용액을 autoclave에서 121℃ 조건으로 15분간 가압 멸균시키는 과정을 거친 후, 상기 멸균과정을 거친 배지를 60℃까지 식힌 후 petridish에 약 25ml 분량으로 담아 응고시키는 과정으로 이루어질 수 있다.
실시예 2. 다시마 병원세균 분리과정
본 발명의 다시마 고체배지를 이용한 다시마의 질병검사를 실시하였다. 다시마의 병원 세균을 분리하기 위하여 사용된 다시마 시료는 2014년 4월부터 9월까지 전라남도 완도, 부산, 경상북도 포항에 위치한 다시마 양식장을 대상으로 주기적으로 병에 걸린 것으로 추정되는 다시마를 채집하여 냉장상태로 신속히 실험실로 운반한 후 질병검사에 이용하였다.
상기 질병검사는 세균에 감염된 것으로 판정된 병든 부위의 다시마 엽체와 탈락된 다시마 엽체 등을 시료로 사용하였다. 시료의 구분은 단순히 외관상 엽체가 탈락한 시료는 1~3으로, 세균에 의한 감염증상인 엽체구멍증상을 보이는 시료는 4~5로 구분하였다(표 1 참조).
세균 검사는 이상 부위의 다시마 엽체를 수돗물과 70% 알코올을 사용하여 외부에 부착된 오염원을 제거한 후, 멸균 해수로 1:9(1g/9ml)가 되도록 처리하여 마쇄하였다. 상기 마쇄액을 사용하여 0.5% 알긴산이 포함된 brain heart infusion agar(BHIA), marine agar(MA), 3% 다시마 배지(DA)에 100㎕씩 도말한 후, 20-25℃에서 7일간 배양하여 세균을 분리하였다. 세균을 배양한 배지에서 동일한 콜로니가 50개 이상 분리되었을 때 양성으로 판단하였다. 도 2는 본 발명의 다시마 배지를 이용한 다시마 병원세균 분리사진을 나타낸다.
또한, 다시마 파우더(powder)의 함량을 10 내지 30g의 양으로 변화하여 배지를 제조하여 실험한 결과에 따르면 다시마 파우더 10g에 1L의 증류수를 넣은 경우(1%)와 다시마 파우더 20g에 1L의 증류수를 넣은 경우(2%)보다 다시마 파우더 30g에 1L의 증류수를 넣은 경우(3%)의 농도에서 세균이 잘 자라는 것을 확인하였다. 따라서 다시마 파우더는 적어도 3%의 비율로 포함되는 것이 바람직하다.
실시예 3. 다시마 병원세균 동정과정
배지로부터 분리된 세균은 boiling법을 이용하여 DNA를 추출한 후, 원핵생물의 16S ribosomal RNA 유전자를 기초로 제작된 중합효소연쇄반응에 사용한 시발체(primer)는 다음과 같다.
519F: 5'-CAGCMGCCGCGGTAATWC-3'1094R: CTTAACCCAACATCTCACGA
상기 primer 를 이용하여 polymerase chain reaction (PCR)을 실시하였다. 반응 조건은 94℃에서 5분간 pre-denature 시킨 후, 94℃에서 30초간 denature, 57℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 1분간 extension 반응을 30 cycles를 진행시키고, 72℃에서 5분간 post-extension 하였다.
PCR 증폭 산물은 1.5% agarose gel을 이용하여 확인하였고, gel DNA extration kit를 이용하여 정제 후 ABI PRISM dye terminator sequencing chemistry를 사용하여 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열은 national center for biotechnology infermation (NCBI)의 blast search를 실시하여 동정하였다.
실시예 4. 다시마 병원세균 분리실험 결과
도 3은 본 발명의 다시마 배지를 포함한 배지종류별 배양되어 분리된 병원세균을 나타낸다. 하기 표 1은 기존의 시판되는 BHIA 배지 (Brain heart infusion agar), MA 배지 (marine agar) 및 본원발명의 다시마 배지 (Dasima agar) 각각에 따라 분리된 세균을 나타낸다. 분리된 세균의 수는 집락형성단위(colony forming unit)로 측정하였다.
표 1 배지별 분리된 세균수
시료 외부증상 배지별 분리된 세균(세균수)
BHIA MA DA
1 엽체탈락 Negative Marine bacterium (130)Alteromonas sp. (123) Negative
2 엽체탈락 미동정 세균 (52) Pseudoalteromonas sp. (70) Pseudoalterromonas sp. (83)
3 엽체탈락 Vibrio sp. (820) Vibrio sp. (960)Vibrio sp. (720)Vibrio sp. (80) Pseudoalterromonas sp. (350)Pseudoalterromonas sp. (248)
4 엽체구멍 Vibrio sp. (320) Marine bacterium (1200)Pseudoalterromonas sp. (640) Pseudoalterromonas sp. (53)
5 엽체구멍 Not tested Reinekea sp. (2080)Pseudoalterromonas sp. (700) Negative
표 1의 결과를 살펴보면 1번 시료 (병변: 엽체 탈락)에서는 MA에서만 Marine bacterium (130개)과 Alteromonas sp. (123개)가 분리되었다. 2번 시료 (엽체 탈락)에서는 BHIA에서 미동정 세균 (52개)이 분리되었고, MA와 DA에서 Pseudoalteromonas sp.가 각각 70개와 83개 분리되었다. 3번 시료 (엽체 탈락)에서는 BHIA에서 Vibrio sp. (820개)가 분리되었고, MA에서는 세균집락이 다른 3종의 Vibrio sp.가 분리되었다. 그러나 DA에서는 세균집락이 다른 Pseudoalteromonas sp.가 각각 350개와 248개가 분리되었다.
4번 시료 (엽체 구멍)에서는 BHIA에서 Vibrio sp. (320개)가 분리되었고, MA에서는 Marine bacterium (1200개)과 Pseudoalteromonas sp. (640개)가 분리되었다. 그러나 DA에서는 Pseudoalteromonas sp. (53) 만이 분리되었고, 5번 시료 (엽체 구멍)에서는 MA에서만 Reinekea sp. (2080개)와 Pseudoalterromonas sp. (700개)가 분리되었다.
상기 배지별 검출된 균종의 결과를 토대로 BHIA에서는 Vibrio sp.가 분리되었고, MA에서는 Marine bacterium, Alteromonas sp., Pseudoalteromonas sp., Vibrio sp., Reinekea sp.가 분리되었으며, DA에서는 Pseudoalteromonas sp. 만이 특이적으로 분리되어 DA배지가 Pseudoalteromonas sp. 질병 진단에서 사용될 수 있는 것으로 판단된다.
본원발명의 다시마 배지는 다시마에서 발생하는 세균성 구멍병의 원인균인 Pseudoalteromonas sp.를 특이적으로 순수 배양하여 분리할 수 있기 때문에 다시마의 세균성 구멍병 조기감염 여부 및 병의 증상으로 나타나는 엽체의 구멍병 예보시스템으로써 활용하여 세균성 구멍병의 질병진단 및 예보시스템으로 적용하여 피해확산을 조기에 차단할 수 있는 산업상 이용가능성이 있다.

Claims (7)

  1. 다시마를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 다시마 배지
  2. 제1항에 있어서, 다시마는 1 내지 3 중량%의 양으로 포함되는 것을 특징으로 하는 다시마 배지
  3. 제1항의 다시마 배지는 다시마 구멍병 원인균인 Pseudoalteromonas sp.만을 특이적으로 분리 배양 가능한 것을 특징으로 하는 다시마 배지
  4. 증류수 1L를 기준으로 다시마 파우더 10 내지 30g이 , NaCl 10g의 비로 첨가하여 용해시킨 후, 용해액에 agar powder 15g의 비로 첨가하여 용해시켜 이루어지는 것을 특징으로 하는 다시마 구멍병 원인균인 Pseudoalteromonas sp.만을 특이적으로 분리 배양 가능한 다시마 배지 조성물
  5. 증류수 1L를 기준으로 다시마 파우더 10 내지 30g, NaCl 10g의 비로 첨가하여 용해시킨 후, 용해액에 agar powder 15g의 비로 첨가하여 용해시켜 이루어지는 것을 특징으로 하는 다시마 구멍병 원인균인 Pseudoalteromonas sp.만을 특이적으로 분리 배양 가능한 다시마 배지 조성물
  6. 다시마 파우더와 NaCl을 증류수 1L에 용해시킨 후, agar powder을 첨가하여 용해시키는 단계,
    상기 용해된 용액을 autoclave에서 121℃로 15분간 가압 멸균시키는 단계,
    상기 멸균과정을 배지를 60℃까지 식힌 후, petridish에 약 25ml 분량으로 담아 응고시키는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 다시마 구멍병의 원인균인 Pseudoalteromonas sp.만을 특이적으로 분리 배양 가능한 다시마 배지 제조방법
  7. 이상 부위의 다시마 엽체를 수돗물과 70% 알코올을 사용하여 외부에 부착된 오염원을 제거한 후, 멸균 해수로 1:9(1g/9ml)가 되도록 처리하여 마쇄하고, 상기 마쇄액을 청구항 1의 다시마 배지에 100㎕ 도말한 후, 20-25℃에서 7일간 배양하여 세균을 분리하는 것을 특징으로 하는 다시마 배지를 이용한 다시마 병원세균 진단방법
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