CN112029665B - 橡胶树炭疽菌抗药性菌株HcgHNQZ1736及其在抗药性研究中的应用 - Google Patents

橡胶树炭疽菌抗药性菌株HcgHNQZ1736及其在抗药性研究中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种喀斯特炭疽菌及其在橡胶炭疽病研究领域的应用。本申请于海南省橡胶树上首次发现喀斯特炭疽的发生，分离得到的菌株为C.karstii。生物学特性测定发现，该菌株最适生长温度为28℃，致死温度为35℃；最适生长pH为6；光暗交替利于菌落生长；果胶、蛋白胨分别为最适碳源和氮源。致病力评价发现其对PR107、RRIM600、热研7‑33‑97和大丰95四个主推品种均有较强致病力；抗药性评价结果表明，菌株HcgHNQZ1736对甾醇脱甲基抑制剂类(DMIs)杀菌剂咪鲜胺锰盐不具抗药性，对苯并咪唑类杀菌剂多菌灵表现出高抗药性。

Description

橡胶树炭疽菌抗药性菌株HcgHNQZ1736及其在抗药性研究中 的应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种喀斯特炭疽菌及其在橡胶炭疽病研究领域的应用。
背景技术
天然橡胶、钢铁、煤炭、石油并称为世界四大工业原料，天然橡胶是其中唯一的可再生资源。橡胶树是重要的热带经济作物，是天然橡胶(顺式聚异戊二烯)的主要生产载体，在国民经济和国防建设中发挥重要作用，具有重要的经济价值。
植物炭疽病是由炭疽菌属(Colletotrichum Corda)的真菌侵染造成的，可成为这一类真菌寄主的植物分布较为广泛，在热带、亚热带、温带等地区适宜真菌繁殖的植物均有发现，其中与人类息息相关的粮食、果蔬、花卉甚至高大乔木等600多种植物均遭受其危害，给经济发展带来了一定的阻力。在橡胶树上，炭疽病的危害近年来又有上升趋势。全球首例被发现并报道的橡胶树炭疽病是1906年在斯里兰卡，我国首例被发现并报道的橡胶树炭疽病是1962年在海南国营大丰农场(冯淑芬等，1998)。到目前为止，橡胶树炭疽病已经几乎遍布全球所有植胶地，其中，非洲中部、南美洲、亚洲南部和东南部等植胶国家最为严重(Sripathi RB et al.，1975；Jayasinghe CK et al.2009)。
炭疽病是一种弱寄生菌，只有橡胶树树势衰弱或存在伤口的情况下，才容易从幼嫩组织的自然孔口、伤口或皮孔进入，寄生和侵染，引起发病(范会雄等，1996)。橡胶树炭疽病主要侵染部位有叶、叶柄、嫩梢和果实，其主要侵染方式有角质层下内部定殖(角质层下内部侵染)和胞内定殖(细胞内半活体营养型侵染)。橡胶树炭疽菌无性态为真菌界、半知菌类、腔胞纲、黑盘孢目、黑盘孢科、刺盘孢属(Colletotrichum)的尖孢炭疽菌复合种(Colletotrichum acutatum species complex)和刺盘孢属胶孢炭疽菌复合种(Colletotrichum gloeosporioides species complex)；有性态为真菌界、子囊菌门、核菌纲、球壳菌目、疔座霉科、小丛壳属的围小丛壳菌(Glomerella cingulata)。但是，传统的形态学、培养特征和ITS限制了对橡胶炭疽菌复合种的认识，一直以来，众多学者都一致认为橡胶树炭疽病主要由胶孢炭疽菌导致，少数有尖孢炭疽菌，将其划分为C.gloeosporioides和C.acutatum两个种群，但随着分类学的发展和分析方法的进步，基于多位点的系统发育分析帮助科学家发现和明确了更多的橡胶树炭疽病菌复合种，以实现天然橡胶树的良好培育。
此外，在化学防治仍是目前橡胶树炭疽病的主要应对方法的大环境下，长期施药除了污染环境以外，还极易使病原菌产生抗药性，这一现状为炭疽病防治加大了难度，要有效防治炭疽病，加深掌握对不同致病病原菌的特性，实时掌握植胶区病原菌变化动态尤为重要。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种喀斯特炭疽菌；
本发明所要解决的第二个技术问题在于提供所述喀斯特炭疽菌在橡胶炭疽病研究领域的应用。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种喀斯特炭疽菌，其分类命名为Colletotrichum karstii，HcgHNQZ1736，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.19640，保藏日期2020年5月7日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明还公开了一种培养所述喀斯特炭疽菌的方法，即包括将所述喀斯特炭疽菌接种于适宜培养基中，并于15-32℃进行培养的步骤。
更具体的，所述培养基包括PDA培养基或察氏培养基。
优选的，所述培养基包含果胶为碳源、蛋白胨为氮源，pH6-9。
本发明还公开了所述喀斯特炭疽菌在橡胶树炭疽病研究领域的应用。
具体的，所述研究包括所述喀斯特炭疽菌的抗药性研究。
更具体的，所述抗药性研究包括多菌灵杀菌剂抗药性研究。
本发明还公开了一种防治由所述喀斯特炭疽菌引起的橡胶树炭疽病的方法，即包括喷洒非苯并咪唑类杀菌剂的步骤。
具体的，所述杀菌剂包括甾醇脱甲基抑制剂类(DMIs)。
更具体的，所述甾醇脱甲基抑制剂类杀菌剂包括咪鲜胺锰盐。
本申请于海南省橡胶树上首次发现喀斯特炭疽的发生，样品采自海南省琼中县阳江农场苗圃，分离、纯化及柯赫氏法则验证后获得1株炭疽病菌，编号为HcgHNQZ1736，这是首次在海南省橡胶树上发现该类病菌。本申请进一步以已知为喀斯特炭疽病菌的菌株MeCkYN1705作为对照开展实验。通过形态观察对分离纯化的菌株在PDA平板上的生长状况，子囊，分生孢子，子囊孢子，附着胞，孢子梗等结构进行初步鉴定，同时利用多基因分析对其ITS、tub和GAPDH三个基因进行同源性比较并构建系统发育树，同源性比较发现供试菌株的ITS序列与C.boninense的同源性为99％；供试菌株的tub序列与C.karstii的同源性为99％；供试菌株的GAPDH序列与C.karstii的同源性为99％，系统发育树表明供试菌株与C.karstii聚为同一分支，节点支持率为98％，由此可确定分离得到的菌株为C.karstii。生物学特性测定发现，该菌株最适生长温度为28℃，致死温度为35℃；最适生长pH为6；光暗交替利于菌落生长；果胶、蛋白胨分别为最适碳源和氮源。致病力评价发现其对PR107、RRIM600、热研7-33-97和大丰95四个主推品种均有较强致病力。
本发明通过对海南新发炭疽病菌喀斯特炭疽菌HcgHNQZ1736进行抗药性评价得出以下主要研究结果：以分离自云南保山的喀斯特炭疽病菌MeCkYN1705为对照，对菌株HcgHNQZ1736开展杀菌剂敏感性评价。结果表明菌株HcgHNQZ1736和MeCkYN1705对甾醇脱甲基抑制剂类(DMIs)杀菌剂咪鲜胺锰盐不具抗药性，EC50分别为0.0784μg/mL和0.0775μg/mL。HcgHNQZ1736对苯并咪唑类杀菌剂多菌灵表现出高抗药性，EC50达1107.2654μg/mL，而MeCkYN1705的EC50仅为0.0554μg/mL。本发明方案进一步克隆了菌株HcgHNQZ1736的tub2基因，序列分析发现其所编码的第198个氨基酸位点由谷氨酸(Glu-E)突变为丙氨酸(Ala-A)，推测该氨基酸位点突变是导致该菌株产生多菌灵抗性的原因。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1为实施例1中科赫氏法则验证结果；其中，A：田间发病症状，B：分离获得HcgHNQZ1736，C：接种HcgHNQZ1736(左下角接种点为CK)，D：再次分离获得HcgHNQZ1736；
图2为实施例2中菌株HcgHNQZ1736和MeCkYN1705形态观测结果；其中，A：HcgHNQZ1736菌落正背面形态，B：MeCkYN1705菌落正背面形态，C：HcgHNQZ1736子囊孢子，D：HcgHNQZ1736分生孢子，E：MeCkYN1705分生孢子，F：HcgHNQZ1736附着胞，G：HcgHNQZ1736分生孢子梗，H：HcgHNQZ1736完整子囊壳，I：MeCkYN1705破碎子囊壳；
图3为实施例3中ITS基因、tub基因、GAPDH基因PCR扩增结果；其中，图A：ITS基因，M：DNA Marker III；图B：tub基因，M：DNA Marker III；图C：GAPDH基因，M：50bp LadderMarker；泳道1：HcgHNQZ1736，泳道2：MeCkYN1705；
图4为实施例3中基于ITS、tub、GAPDH序列的系统发育树；
图5为实施例4中不同温度环境菌丝生长情况；其中，图A、B分别表示菌株HcgHNQZ1736和MeCkYN1705，编号1-8分别表示温度10℃、15℃、20℃、25℃、28℃、30℃、32℃、35℃；
图6为实施例4中不同温度环境菌丝生长情况的柱状图；其中，左侧柱状为HcgHNQZ1736，右侧柱状为MeCkYN1705；
图7为实施例4中不同光照环境菌丝生长情况；其中，编号1-3分别表示连续光照、连续黑暗和光暗交替条件；
图8为实施例4中不同光照环境菌丝生长情况的柱状图；其中，左侧柱状为HcgHNQZ1736，右侧柱状为MeCkYN1705；
图9为实施例4中不同碳源环境菌丝生长情况的柱状图；其中，左侧柱状为HcgHNQZ1736，右侧柱状为MeCkYN1705；
图10为实施例4中不同氮源环境菌丝生长情况的柱状图；其中，左侧柱状为HcgHNQZ1736，右侧柱状为MeCkYN1705；
图11为实施例4中不同pH环境菌丝生长情况；图A、B分别表示菌株HcgHNQZ1736和MeCkYN1705，编号1-8分别表示pH值为4-11；
图12为实施例4中不同pH环境菌丝生长情况的柱状图；其中，左侧柱状为HcgHNQZ1736，右侧柱状为MeCkYN1705；
图13为菌株对海南省橡胶树主栽品种致病力结果；其中，A：菌株HcgHNQZ1736，B：菌株MeCkYN1705；
图14为菌株对海南省橡胶树主栽品种致病力结果柱状图；其中，左侧柱状为HcgHNQZ1736，右侧柱状为MeCkYN1705；
图15为菌株HcgHNQZ1736在不同多菌灵浓度下和不同咪鲜胺浓度下生长情况；其中，图A中编号1-6分别对应多菌灵浓度为0(CK)、600、800、1000、1200、1400μg/mL，图B中编号1-6分别对应咪鲜胺浓度为0(CK)、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16μg/mL；
图16为菌株MeCkYN1705在不同多菌灵浓度下和不同咪鲜胺浓度下生长情况；其中，图A中编号1-6分别对应多菌灵浓度为0(CK)、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06μg/mL，图B中编号1-6分别对应咪鲜胺浓度为0(CK)、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16μg/mL；
图17为继代培养菌株HcgHNQZ1736抗性遗传稳定性情况；其中，1：接种自第1代菌株；2：接种自第5代菌株；
图18为tub2基因PCR扩增结果，注：M：DL2000 Marker，泳道1：HcgHNQZ1736，泳道2：MeCkYN1705；
图19为基因序列预测结果；
图20为菌株HcgHNQZ1736第二条β-微管蛋白(tub2)氨基酸比对结果。
具体实施方式
本发明下述实施例中，涉及菌株包括：
喀斯特炭疽菌株(Colletotrichum karstii，MeCkYN1705，分离自云南保山)由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所分离、鉴定和保存；
喀斯特炭疽菌株(Colletotrichum karstii，HcgHNQZ1736，分离自海南琼中)为本研究中采集、分离和鉴定获得。
本发明下述实施例中，涉及橡胶苗包括：
供试橡胶苗：云研277-5，云研77-4，云研77-2，93-114，热研8-79，热研8-333，热研88-13，热研7-20-59，热研7-33-97，IAN873，湛试327-13，文昌11，文昌217，文昌193，文昌7-35-11，海垦1，海垦6，RRIM600，RRIC105，RRIC100，RRIC103，RRIC52，IAN873，保亭235，保亭911，大丰117，大丰99，大丰95，PB86，PB260，PR107，南华1，针选1号，GT1，大岭64-36-101，化59-2共计36个品种(系)由中国热带农业科学院橡胶研究所国家种质资源圃提供，保存于中国热带农业科学院环境与植物保护研究所演丰基地。
供试样地：PR107嫁接苗圃地，由海南省大岭农场提供。
本发明下述实施例中，涉及培养基包括：
PDA培养基(Potato dextrose agar，马铃薯葡萄糖固体培养基)：去皮洁净马铃薯200g切小块在纯水中煮沸30min后用纱布过滤获取滤液，加入20g葡萄糖，17g琼脂粉，溶解后加水定容至1L，121℃灭菌20min。
LB培养基(Luria-Bertani培养基)：NaCl 10g，酵母提取物5g，蛋白胨10g，琼脂粉17g，加纯水溶解后定容至1L，121℃灭菌20min。
AEA培养基：甘油40mL，酵母提取物20g，无水硫酸镁1g，硝酸钠12g，氯化钾1g，磷酸二氢钾3g，加纯水溶解后定容至1L，121℃灭菌20min。
SNA培养基(Synthetic low nutrient agar)：磷酸二氢钾1g，硝酸钾1g，七水合硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，葡萄糖0.2g，蔗糖0.2g，琼脂粉17g，加纯水溶解后定容至1L，121℃灭菌20min。
察氏培养基(Czapek–Dox Medium)：硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，琼脂粉17g，加纯水溶解后定容至1L，121℃灭菌20min。
实施例1橡胶树炭疽病样品采集、分离、纯化与保存
于2017至2018年从海南省主要橡胶种植区采集病样，采集获得的病样在室内进行病原菌的分离纯化，方法如下：将采集到的病叶用清水洗净后用滤纸吸干表面水分，再使用75％乙醇进行一次叶表面消毒；用灭菌后的剪刀剪取病健交界处约3×3mm的叶片组织，在工作台内使用70％乙醇处理30s，0.1％升汞处理2min，无菌水处理3次；用灭菌的滤纸吸干水分后接种在PDA平板上，于28℃培养箱内培养5d后用灭菌的接种针挑取单根菌丝重新接种到一个新的PDA平板上以纯化菌株。对分离纯化后的菌株进行柯赫氏法则验证致病性，用无菌超纯水进行菌株的保存。
本实施例从海南省主要橡胶种植区采集病样264份，获得炭疽病分离物140份，其中采自海南省琼中县阳江农场苗圃炭疽病样品中分离出1株炭疽病菌，纯化后进行致病性测定(柯赫氏法则验证)如图1所示，证明这个菌株能引起橡胶树炭疽病，用无菌超纯水进行菌株的保存，编号为HcgHNQZ1736，选择喀斯特炭疽病菌MeCkYN1705为对照开展以下实验。
实施例2形态观察
供试菌株在PDA平板上培养7天后，观察菌落形态，通过AEA培养基和SNA培养基促进菌株产孢，显微镜下观察分生孢子、分生孢子梗和附着胞等微观形态，并记录大小；参考邵力平等的《真菌分类学》、许志刚等的《普通植物病理学》、魏景超等的《真菌鉴定手册》、张中义等的《植物病原真菌学》等著作对菌株进行初步形态上的分类鉴定。
对菌株HcgHNQZ1736和MeCkYN1705经培养和观测结果表明(图2)：在PDA培养基上气生菌丝为毛毡状，菌丝平伏、边缘整齐，呈圆形，28℃培养箱内菌落生长速率约为10.5±1.5mm/d，生长初期两个菌株背面均为乳白色至奶黄色，生长后期菌株HcgHNQZ1736背面逐渐转变为橙红色。此外，通过显微镜的观察两个菌株的显微结构基本一致，子囊壳近球形，表面呈蜂窝状斑纹，直径约为80.4-90.6μm；子囊孢子单行或双行排列，边缘整齐，一端钝圆一端呈锥形或弯曲，大小约为(4.2±0.9)μm×(14.2±1.1)μm；分生孢子圆柱状，边缘整齐，两端钝圆，大小约为(4.8±0.7)μm×(15.2±0.9)μm，有1-2个油滴；附着胞为深棕色至黑褐色，呈椭圆形或近圆形，边缘整齐，大小约为(5.4±0.4)μm×(8.2±0.6)μm；孢子梗透明至淡褐色，光滑，有隔膜和分支，多为簇状分布，长度约为50μm。根据上述菌落形态和显微结构等特征初步推测菌株HcgHNQZ1736为博宁炭疽菌复合种。
实施例3系统发育分析
(1)供试菌株基因组DNA提取
将已鉴定纯化培养的菌株接种于PDA平板，置于28℃培养箱内培养7d，用CTAB法提取菌株DNA；具体操作如下：
①挑取适量菌丝，放入灭菌的研钵内，加入液氮快速研磨成粉末迅速转入灭菌的2mL离心管，加入700μL 65℃预热的CTAB缓冲液；
②混匀粉末和CTAB缓冲液；
③65℃水浴锅中放置30min，每10min震荡混匀一次；
④加入700μL氯仿混合液(酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1)，混匀(通风橱内操作)，4℃，12000rpm离心10min；
⑤吸取上清液，加氯仿混合液(氯仿：异戊醇＝24：1)再抽提一次，混匀4℃12000rmp离心10min；
⑥吸取上清液(避免吸入中层蛋白质或有机溶剂)转入1.5mL PE管中，加入400μL冰的异丙醇(0.6)倍体积，于-20℃放置3h以上；
⑦4℃，12000rmp离心10min，弃去上清，加入预冷的70％酒精700μL，混匀，4℃，12000rmp离心10min，弃去上清，重复2次，无水酒精清洗一次，放到超净工作台上通风干燥，加入适量TE(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0)溶液溶解后，于-21℃保存。
(2)多基因测序
选择核糖体转录间隔区(internal transcribed spacers，ITS)、β-微管蛋白基因(β-tubulin，tub)和3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)部分序列进行多基因系统发育分析。所用引物如下表1所示(Dammet al，2012)，PCR扩增体系(总体积25μL)如下表2所示，PCR反应程序如下表3所示。
表1基因选择及相应引物
Figure BDA0002615960240000091
表2 PCR扩增体系
Figure BDA0002615960240000092
Figure BDA0002615960240000101
表3 PCR反应程序
Figure BDA0002615960240000102
扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，用北京天根生物科技有限公司回收试剂盒回收目的片段。将回收纯化的PCR产物送华大基因有限公司进行测序，将测序结果置于NCBI上BLAST比对分析。
(3)构建系统发育树
在NCBI的GenBank数据库中下载博宁炭疽复合种所用模式种的序列，利用MEGAv.6.0软件对所获得的序列分别进行比对，删除不确定的序列，利用SequenceMatrix 1.7.8软件对ITS、TUB和GAPDH进行序列拼接，获得完整序列数据。利用MEGA v.6.0中Model进行模块预测，再利用该软件Phylogeny中的Maximum Likelihood方法构建系统发育树，以C.truncatum作为外群，1000重复。
利用引物对ITS1/ITS4，T1/Bt-2b，GDF/GDR分别对菌株HcgHNQZ1736和菌株MeCkYN1705的基因组DNA进行PCR扩增，分别获得575bp，751bp和239bp的片段(见图3)，验证测序后将获得的基因序列，在GenBank中进行BLAST比对，供试菌株的ITS序列与Colletotrichum boninense的同源性为99％；供试菌株的tub序列与Colletotrichumkarstii的同源性为99％；供试菌株的GAPDH序列与Colletotrichum karstii的同源性为99％。
下载博宁炭疽复合种中各种模式菌株的多基因序列，利用MEGA v.6.0进行比对后手动校正，将各基因序列以首尾相接的方式进行连接，比对后包括外群C.truncatum在内总共有1245个序列特征，基因边界为ITS：1-507，TUB2：508-1003，GAPDH：1004-1245，用最大似然法中的Hasegawa-Kishino-Yano model模块构建系统发育树，并对系统发育树进行检验，1000次重复，结果如下图4所示，供试菌株与C.karstii聚为同一分支，节点支持率为98％，表明供试菌株属于C.karstii。
综上，本发明所述喀斯特炭疽菌，其分类命名为Colletotrichum karstii，HcgHNQZ1736，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.19640，保藏日期2020年5月7日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
就目前而言，胶孢炭疽复合种和尖孢炭疽复合种仍是侵染海南省橡胶树的优势种(曹学仁等，2017)，国内外对于喀斯特炭疽的报道多在兰花、油茶、大叶桉、辣椒等作物上发现(杨友联等，2010；TOZZE
Figure BDA0002615960240000111
et al.2009；Velho A C et al.2014)，国内在橡胶树上此前只在云南省绿春县首次发现(蒋桂芝等，2016)，本申请方案填补了上述空白。
实施例4基础生物学特性测定
(1)生长适宜温度测定
将供试菌株接种于PDA平板上，分别置于10℃、15℃、20℃、25℃、28℃、30℃、32℃和35℃环境下黑暗培养5d，实验设置3次重复，用十字交叉法测量并记录菌落生长直径，明确病原菌的生长适宜温度范围。
如下表4、图5和图6所示，供试菌株HcgHNQZ1736和MeCkYN1705生长温度范围在15-32℃；28℃为菌落最适生长温度范围，菌落生长速度最快，约为11.7mm/d；在温度达到10℃以下和35℃以上时，菌落完全停止生长。
表4不同温度环境菌丝生长情况
Figure BDA0002615960240000121
注：表中数值后的字母为α＝0.05差异显著性分析结果。
(2)不同光照下菌株生长速度测定
将供试菌株接种于PDA平板上，分别置28℃于连续光照、连续黑暗和每12h明暗交替的环境下培养5d，实验设置3次重复，用十字交叉法测量并记录菌落生长直径，明确光照对菌株生长速度的影响。
如下表5、图7和图8所示，供试菌株HcgHNQZ1736和MeCkYN1705在三种光照条件下均能正常生长，连续光照条件下两菌株生长速率分别为11.1mm/d和10.6mm/d；连续黑暗条件下两菌株生长速率分别为11.1mm/d和10.9mm/d；光暗交替条件下两菌株生长最快，生长速率分别为11.7mm/d和11.9mm/d。
表5不同光照环境菌丝生长情况
Figure BDA0002615960240000122
注：表中数值后的字母为α＝0.05差异显著性分析结果
(3)不同碳源对菌落生长影响测定
以相同质量的木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、乳糖、碱性木素、果胶、纤维素、淀粉和多聚半乳糖醛酸替换察氏固体培养基中的蔗糖，配制成含有不同碳源的培养基。将供试菌株接种至不同碳源的察氏培养基中，以普通察氏培养基作为对照，置于28℃恒温箱中培养7d，实验设置3次重复，用十字交叉法测量菌落直径以明确菌株对不同碳源的利用率。
如下表6和图9所示，供试菌株HcgHNQZ1736和MeCkYN1705在13种不同碳源中均能生长，其中HcgHNQZ1736对果胶的利用率最好，平均生长速率达9.4mm/d，对多聚半乳糖醛酸的利用率最差，平均生长速率仅为3.1mm/d；MeCkYN1705对果胶的利用率最好，平均生长速率达8.7mm/d，对乳糖的利用率最差，平均生长速率仅为3.5mm/d。
表6不同碳源环境菌丝生长情况
Figure BDA0002615960240000131
注：表中数值后的字母为α＝0.05差异显著性分析结果。
(4)不同氮源对菌落生长影响测定
以相同质量的硝酸铵、硝酸钾、磷酸二氢铵、硫酸铵、氯化铵、蛋白胨和天冬酰胺替换察氏固体培养基中的硝酸钠，配制成含有不同氮源的培养基。将供试菌株接种至不同氮源的察氏培养基中，以普通察氏培养基作为对照，置于28℃恒温箱中培养7d，实验设置3次重复，用十字交叉法测量菌落直径以明确菌株对不同氮源的利用率。
如下表7和图10所示，供试菌株HcgHNQZ1736和MeCkYN1705在8种不同氮源中均能生长，其中HcgHNQZ1736对蛋白胨的利用率最好，平均生长速率可达到9.0mm/d，对硫酸铵的利用率最差，平均生长速率仅为3.19mm/d；MeCkYN1705同样对蛋白胨的利用率最好，平均生长速率可达到8.5mm/d，对硫酸铵的利用率最差，平均生长速率仅为2.7mm/d。
表7不同氮源环境菌丝生长情况
Figure BDA0002615960240000141
注：表中数值后的字母为α＝0.05差异显著性分析结果。
(5)pH对菌落生长影响测定
用1mol/L的HCl和NaOH溶液调节培养基的pH，将供试菌株分别接种于pH为4至11的PDA培养基中，置于28℃恒温箱中培养5d，实验设置3次重复，用十字交叉法测量并记录菌落生长直径，明确pH对菌株生长速度的影响。
如下表8、图11和图12所示，供试菌株HcgHNQZ1736和MeCkYN1705在pH4-12范围内均能生长，但菌落生长直径有明显差异，pH6-9最适宜菌株生长，pH在6时菌株生长最快，生长速率分别约为11.1mm/d和11.5mm/d，在pH达到11时停止生长。
表8不同pH环境菌丝生长情况
Figure BDA0002615960240000142
Figure BDA0002615960240000151
注：表中数值后的字母为α＝0.05差异显著性分析结果
实施例5致病力测定
对供试菌株HcgHNQZ1736进行致病力测定，采用孢子悬浮液接种法(用血球计数板调配孢子浓度为1×106个/mL)，将孢子悬浮液接种至海南省橡胶树主栽品种(大丰95，PR107，热研7-33-97，RRIM600)古铜期叶片上，以接种菌株MeCkYN1705的孢子悬浮液为阳性对照，以接种无菌水为阴性对照，25℃恒温保湿培养3d后检查发病情况确定致病菌，实验设置3次重复，用十字交叉法测量病斑直径以明确致病力。
如下表9、图13和图14所示，对菌株HcgHNQZ1736进行致病力测定发现，菌株HcgHNQZ1736相较MeCkYN1705对大丰95、RRIM600、PR107和热研7-33-97四个海南省主栽品种橡胶树古铜期叶片的致病力稍弱，但总体仍然表现出较强的致病力，发生侵染3d后的平均病斑直径分别达到10.33、10.90、10.57和9.17mm，其中对RRIM600的致病力最强，对热研7-33-97的致病力最弱。
表9致病力测定结果
Figure BDA0002615960240000152
注：表中数值后的字母为α＝0.05差异显著性分析结果
实施例6炭疽菌药剂敏感性测定
(1)多菌灵和咪鲜胺药剂母液配置
称取0.5g 98％的多菌灵原药粉剂溶解于适量1mol/L的稀盐酸中，待粉末完全溶解后用无菌水定容至50mL，过滤灭菌，获得10000μg/mL的母液4℃保存；
称取0.05g 96％咪鲜胺锰盐原药粉剂溶解于甲醇中并定容至50mL，过滤灭菌，获得1000μg/mL的母液4℃保存；
(2)含药培养基配置
向融化后降温至60℃左右的PDA培养基中添加不同体积的多菌灵和咪鲜胺母液，分别制成不同浓度的多菌灵药剂PDA培养基，以及咪鲜胺药剂PDA培养基，不同药剂处理浓度梯度如表10所示。
表10供试药剂浓度设定
Figure BDA0002615960240000161
(3)敏感性评价方法(参考曹学仁等，2015)
将供试菌株接种于PDA平板上，28℃恒温培养箱内培养5d后，用灭菌的接种针挑取少量菌丝，移接于上述含药平板进行筛选，置于28℃恒温箱中培养5d，实验设置3次重复，观察菌落生长情况，用十字交叉法测量并记录菌落生长直径，计算菌丝生长抑制率，进行回归分析，计算回归方程和EC50(抑制菌丝生长50％的有效浓度)。
Figure BDA0002615960240000162
计算浓度对数(X)与抑制菌落生长百分率的几率值(Y)，利用最小二乘法分别求得各杀菌剂对该菌的毒力回归方程Y＝a+bX和EC50。
菌株HcgHNQZ1736和MeCkYN1705对不同浓度的98％多菌灵原药和96％咪鲜胺锰盐原药敏感性测定结果如下图15和图16所示，计算菌株HcgHNQZ1736和MeCkYN1705在多菌灵和咪鲜胺锰盐筛选压力下的毒力回归方程、相关系数以及EC50值，记录如下表11所示。结果表明，在多菌灵的筛选压力下，HcgHNQZ1736明显产生较强的抗药性，EC50达到1107.2654μg/mL，而MeCkYN1705的EC50仅为0.0554μg/mL；在咪鲜胺锰盐的筛选压力下，药剂对HcgHNQZ1736和MeCkYN1705的作用效果相近，两个菌株均未表现出抗药性，EC50分别为0.0784、0.0775μg/mL。
表11菌株对多菌灵和咪鲜胺敏感性
Figure BDA0002615960240000171
实施例7抗药性菌株抗性遗传稳定性测定
将供试菌株接种于无药PDA平板上培养后，通过单孢分离进行继代培养5代后，将第1代和第5代菌株同时接种至多菌灵浓度为600μg/mL的PDA培养基上，置于28℃恒温箱中培养5d，实验设置3次重复，观察菌落生长情况，用十字交叉法测量并记录菌落生长直径，若各代菌株生长情况和菌落直径差异不显著，则表明抗药性遗传稳定。
如图17所示，接种自第1代的菌株在600μg/mL多菌灵PDA平板上的平均菌落直径为48.17mm，接种自第5代的菌株在600μg/mL多菌灵PDA平板上的平均菌落直径为47.33mm，两者菌落生长情况无显著差异，可判断其对多菌灵的抗药性具有遗传稳定性。
实施例8喀斯特炭疽菌tub2基因突变与抗药性关系分析
依据多篇文献报道，多种真菌对苯并咪唑类杀菌剂产生抗药性主要是β-微管蛋白与药剂结合位点氨基酸发生突变，导致真菌对药剂不敏感(Koenraadt，1992；Abdul Gafur，1998；Davidson，2006；Young，2010；Pornprapa，2011)。为探究本论文所发现的橡胶树喀斯特炭疽菌是否也同样由于tub2基因的突变而引起多菌灵的抗药性，将上文2.2.3.2中已获得的抗药性菌株的β-微管蛋白tub2基因进行序列分析，在NCBI数据库中使用BLAST进行序列相似性比对分析，在http://linux1.softberry.com/berry.phtml？topic＝fgenesh&group＝programs&subgroup＝gfind中进行基因预测，获得氨基酸序列，比较抗性菌株和敏感性菌株的氨基酸序列，明确β-微管蛋白tub2基因的氨基酸是否突变。
通过引物对CKtub2F/CKtub2R对喀斯特炭疽菌HcgHNQZ1736和MeCkYN1705菌株的tub2基因进行PCR扩增(图18)，将扩增片段回收、克隆、测序获得β-微管蛋白基因片段长度为1789bp，通过基因预测分析基因序列编码428个氨基酸(图19)，通过与几种已报道的植物病原真菌β-微管蛋白氨基酸进行比较。发现氨基酸的同源性很高，由此可以确认克隆获得的基因为HcgHNQZ1736和MeCkYN1705菌株的β-微管蛋白基因。
实施例9喀斯特炭疽菌tub2基因克隆
利用Primer5.0软件在β-微管蛋白tub2基因起始编码区和终止编码区设计引物，扩增基因的完整编码区序列。设计引物对：
CKtub2F：5'-TCATCCAAAATGCGTGAGATT-3'；
CKtub2R：5'-TACTCCTCCTCCTCCTCGTCA-3'。
PCR扩增体为：
PCR反应程序如下表12所示：
表12 PCR反应程序
Figure BDA0002615960240000181
扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，片段用OMEGA回收试剂盒进行回收。
将扩增回收产物连接至PMD18-T载体，连接体系如下表13所示：
表13连接体系
试剂 体积
pMD18-T Vector(50μg/μL) 1μL
Solution I 5μL
目标片段 0.1-0.3pmol
ddH2O 补至10μL
注：16℃水浴中连接过夜。
采用热击转化将连接产物转化至Trans 5α大肠杆菌感受态细胞，操作参考试剂盒说明书。进行蓝白斑筛选，挑选疑似阳性克隆子于LB液体培养基(含Amp浓度为50μg/mL)中，37℃180rpm摇菌培养12h获得菌液。利用通用引物M13R和M13F进行菌液PCR检测。经过检测确认为阳性克隆子后，送华大基因有限公司测序。
通过对多菌灵抗药性研究的模式菌株A.nidulans、N.crassa，已报道具有多菌灵抗药性的菌株C.siamense_Yd-8、C.fructicola_Gwha-1，供试具有多菌灵抗药性的菌株HcgHNQZ1736，供试不具有多菌灵抗药性的菌株MeCkYN1705以上5个菌株的β-微管蛋白氨基酸序列进行比对，结果表明(图20)供试具有多菌灵抗药性的菌株HcgHNQZ1736与已报道具有多菌灵抗药性的菌株C.siamense_Yd-8、C.fructicola_Gwha-1存在氨基酸突变的一致性，其198位点的谷氨酸(Glu-E)均突变成为丙氨酸(Ala-A)，这一现象与多篇文献报道的真菌产生多菌灵抗药性的机理有相同。因此可以初步推断其第198位氨基酸的突变导致喀斯特炭疽菌HcgHNQZ1736对多菌灵产生抗药性。
综上，对真菌抗药性研究多用A.nidulans和N.crassa作为模式菌株，多项研究表明与其tub2基因编码的氨基酸比对后发现，第6、50、134、165、167、198、200、237、241、250和257位点的氨基酸突变均能不同程度的引起菌株产生抗药性(Orbach et al.1986)。其中198位点的谷氨酸(Glu-E)有多种突变方式，如突变为丙氨酸(Ala-A)、赖氨酸(Lys-K)、缬氨酸(Val-V)、甘氨酸(Gly-G)或谷氨酰胺(Gln-Q)均能引起菌株产生抗药性，但是抗性程度不同，E198A或E198K所产生的抗药性较于其它突变情况将更强，E198A是迄今为止最常见的突变方式(Ma Z et al.2005)。
胶孢炭疽病菌和尖孢炭疽病菌作为当前橡胶树炭疽病的主要病原菌，其对苯并咪唑类杀菌剂的抗性机理前人已做过一定的解释和研究，发现尖孢炭疽的抗药性存在tub1基因上调的独特性，而胶孢炭疽的抗药性机理与其他种类的菌株基本一致，都是由tub2基因突变引起，但并未有相关文献报道橡胶树喀斯特炭疽菌对苯并咪唑类杀菌剂产生抗药性和进行抗性机理的分析总结，在本论文研究中发现的喀斯特炭疽菌株HcgHNQZ1736 tub2基因氨基酸符合E198A的突变方式，且表现为高抗性，EC50达到1107.2654μg/mL。菌株HcgHNQZ1736产生抗药性的机理符合前人对其它种类菌株的相关研究结果，为橡胶树喀斯特炭疽的相关研究提供了理论基础。
经过实验发现菌株HcgHNQZ1736的抗性遗传具有很好的稳定性，这使得在田间长期施药过程中，可能致使药剂敏感性菌株发生突变成为抗性菌株后能够稳定的扩展，最终使得施药效果逐年下降，产生严重的浪费，此时有针对性的施药和轮换其他类型的药剂进行施用就显得尤为重要。由于此前在海南省橡胶树炭疽病的研究中并未发现和报道喀斯特炭疽菌，其它病原菌种群也未发现和报道对苯并咪唑类杀菌剂有高抗药性的菌株，并且历年用于防治橡胶树炭疽病时多菌灵的施用也并不算过于频繁，故而推测本研究发现的侵染橡胶树的喀斯特炭疽菌或为其它作物上传染和蔓延至橡胶树。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (4)

1.一种喀斯特炭疽菌，其分类命名为Colletotrichum karstii，HcgHNQZ1736，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO. 19640。
2.一种培养权利要求1所述喀斯特炭疽菌的方法，其特征在于，包括将所述喀斯特炭疽菌接种于培养基中，并于15-32℃进行培养的步骤。
3.根据权利要求2所述培养所述喀斯特炭疽菌的方法，其特征在于，所述培养基包括PDA培养基或察氏培养基。
4.根据权利要求2或3所述培养所述喀斯特炭疽菌的方法，其特征在于，所述培养基包含果胶为碳源、蛋白胨为氮源，pH6-9。
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