CN1286849C

CN1286849C - 一种大豆转录因子及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN1286849C
Application number: CN 03153943
Authority: CN
Inventors: 陈受宜; 巩自忠; 李雪平; 张劲松
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2003-08-21
Filing date: 2003-08-21
Publication date: 2006-11-29
Anticipated expiration: 2023-08-21
Also published as: CN1583789A

Abstract

本发明公开了一种大豆转录调控因子及其编码蛋白与应用，本发明所提供的大豆转录调控因子GmDREBa，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。本发明还提供了大豆转录调控因子GmDREBa的编码基因。大豆转录调控因子GmDREBa的编码基因对培育耐逆植物品种特别是耐逆大豆品种，提高农作物特别是大豆产量具有重要意义。

Description

一种大豆转录因子及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域中的与耐逆性相关的EREBP/AP2类转录因子及其编码基因与应用，特别涉及来源于大豆的与耐逆性相关的EREBP/AP2类转录因子及其编码基因与应用。

背景技术

环境中物理化学因素的变化，例如干旱、盐碱、低温等胁迫因素对植物的生长发育有重要影响，严重时会造成农作物大规模减产，培育耐逆性作物是种植业的主要目标之一。目前，应用基因工程育种已经成为增强作物耐逆性的重要方法之一。高等植物细胞有多种途径应答环境中的各种逆境胁迫。其中转录因子起着调控耐逆相关效应基因表达的作用。

大豆是重要的油料作物，是植物蛋白质的主要来源，弄清其耐逆机理，进而改善其耐逆性，具有重要的理论及现实意义。

发明创造内容

本发明的目的是提供与耐逆性相关的一种大豆转录调控因子及其编码基因。

本发明所提供的大豆转录调控因子名称为GmDREBa，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。

序列表中序列2氨基酸残基序列是由158个氨基酸残基组成的蛋白质，是大豆中的EREBP/AP2类转录因子。序列2中自氮端到碳端第13-76位氨基酸残基含有保守的AP2序列，是GmDREBa编码基因的EREBP/AP2功能保守域。

GmDREBa的编码基因，是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中序列1的DNA序列；

2)编码序列表中序列2蛋白质序列的DNA序列；

3)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

序列表中序列1的DNA序列由846个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第140位到第616位碱基，包含477个碱基对，在3’端有230个碱基对非翻译区，其表达受ABA、低温、高盐和干旱的诱导。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的GmDREBa的编码基因导入植物细胞，可获得对逆境胁迫耐受力得到增强的转基因细胞系及转基因植株。使用本发明的基因构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。携带有本发明GmDREBa的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。本发明的基因对培育耐逆植物品种特别是耐逆大豆品种，提高农作物特别是大豆产量具有重要意义。

下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为GmDREBa蛋白与其它植物同类蛋白的相似性比较

图2为Northern杂交结果

具体实施方式

实施例1、大豆GmDREBa编码基因的筛选及其cDNA的克隆

在大豆EST数据库中进行BLAST检索，筛选到3个DREB类基因，这些基因均不含内含子。以常规方法从大豆科丰1中提取总DNA，根据3个DREB基因的序列设计3对引物，分别经PCR方法扩增得到3个DNA片段，经序列分析表明它们均编码含有EREBP/AP2保守结构的DREB类蛋白。GmDREBa是以5’-CCACAATAAGGGGGATGGAT和5’-CGGAACGTACTATCTACTGA为引物扩增得到的。GmDREBa由846个碱基对组成，读码框为5’端第140至616位碱基，编码一个由158个氨基酸残基组成的蛋白质，其中自氮端第13-76个氨基酸残基保守结构域是该基因的EREBP/AP2功能保守域。

实施例2、GmDREBa与植物中同类蛋白的比较

表1GmDREBa与同类基因的相似性和多样性百分数

	GmDREBa	AtDREB2A	AtDREB2B	GmDREB1	OsDREB2
	GmDREBa	AtDREB2A	AtDREB2B	GmDREB1	OsDREB2	GmDREBa	***	45.3	39.6	28.3	42.1
AtDREB2A	76.5	***	45.2	30.5	33.9	GmDREBa	***	45.3	39.6	28.3	42.1
AtDREB2A	76.5	***	45.2	30.5	33.9	AtDREB2B	83.5	51.7	***	26.4	31
GmDREB1	83.1	124	0	***	29.3	AtDREB2B	83.5	51.7	***	26.4	31
GmDREB1	83.1	124	0	***	29.3	OsDREB2	77.9	106.2	114.7	112.6	***

将GmDREBa氨基酸序列与其它植物如水稻、拟南芥及大豆的同类蛋白OsDREB2、AtDREB2A、AtDREB2B和GmDREB1进行了比较，结果如图1和表1所示，表明其相似性分别为42.1、45.3、39.6、和28.3％。

实施例3、GmDREBa在逆境胁迫下的表达特征

将大豆晋豆23种子种在盆中，生长2个星期后取幼苗分别进行下述各种胁迫处理：

盐处理：将大豆幼苗移入250mM NaCl溶液中。

ABA处理：将大豆幼苗移入100uM ABA溶液中。

渗透胁迫处理：将大豆幼苗移入20％PEG溶液中。

低温处理：将大豆幼苗移入4℃水溶液中。

光照培养，并分别在各种处理后0、0.5、1、3、6、12和24小时取样。收集新鲜叶片1g在液氮中研碎，悬于4mol/L硫氢酸胍中，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，上清中加入无水乙醇沉淀总RNA，之后，溶于水，得到总RNA。分别以GmDREBa DNA为探针按常规方法进行Northern分析。结果如图2所示，表明GmDREB1明显受100uM ABA、250mM NaCl、低温(4℃)以及渗透胁迫诱导。图2中A为250mM NaCl处理；B为渗透胁迫处理；C为低温处理；D为100uMABA处理。

序列表

<160>2

<210>1

<211>846

<212>DNA

<213>大豆属大豆(Glycine max(L.)Merrill)

<400>1

ccacaataag ggggatggat ctaagtccct ggccgataca ctggcgaaat ggaaagaata 60

taatgcctgg ctggagtcta acaatgaagc tgagaagccg gttaggaagg tccctgccaa 120

gggatcaaag aagggatgta tgaaaggcaa aggaggacct gagaacttgc gctgtaatta 180

cagaggagtt aggcaaagga catggggaaa atgggttgct gaaatccgag agccaaacag 240

aggaagtagg ctctggttgg gtacttttcc tactgccatt agcgctgctc ttgcttatga 300

tgaagcagcg atggcaatgt atggtttctg tgcacgcctc aactttccca atgttcaagt 360

ttcaactttt tccgaggaac cgtctagaaa ttctccagct gctgcttacc agtcaagaaa 420

ttctccatct gctaaagaat ccggttctgc gttggtgata ttagagaggt ctgagtgcat 480

gatgttgtgg aacaattctg gtggagatgc agcagaggat gatggcatgg aagacctttc 540

cttatcctta agtgtgaaac atgaggaagg ggaggatgaa tcagggacca gttcttccta 600

tctttcattg tcttgatgta tggtttgcat actctgattt ggccgtggct ggaaatcata 660

gccttcatag aggtggatga ttagcttagg atgaacgaat cttgatatta gtacctggag 720

attagctgtt gtaaaattga cttggttgag aagtgttcca ttcttcagga attgacctaa 780

tgcaatctgg atatccagtc aagttgtaag atgtgaaatg tattttgcct tgcatgatag 840

atgact 846

<210>2

<211>158

<212>PRT

<213>大豆属大豆(Glycine max(L.)Merrill)

<400>2

Met Lys Gly Lys Gly Gly Pro Glu Asn Leu Arg Cys Asn Tyr Arg Gly

1 5 10 15

Val Arg Gln Arg Thr Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg Glu Pro

20 25 30

Asn Arg Gly Ser Arg Leu Trp Leu Gly Thr Phe Pro Thr Ala Ile Ser

35 40 45

Ala Ala Leu Ala Tyr Asp Glu Ala Ala Met Ala Met Tyr Gly Phe Cys

50 55 60

Ala Arg Leu Asn Phe Pro Asn Val Gln Val Ser Thr Phe Ser Glu Glu

65 70 75 80

Pro Ser Arg Asn Ser Pro Ala Ala Ala Tyr Gln Ser Arg Asn Ser Pro

85 90 95

Ser Ala Lys Glu Ser Gly Ser Ala Leu Val Ile Leu Glu Arg Ser Glu

100 105 110

Cys Met Met Leu Trp Asn Asn Ser Gly Gly Asp Ala Ala Glu Asp Asp

115 120 125

Gly Met Glu Asp Leu Ser Leu Ser Leu Ser Val Lys His Glu Glu Gly

130 135 140

Glu Asp Glu Ser Gly Thr Ser Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Ser

145 150 155

Claims

1、大豆转录调控因子GmDREBa，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。

2、根据权利要求1所述的大豆转录调控因子GmDREBa，其特征在于：它是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质。

3、GmDREBa的编码基因，是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中序列1的DNA序列；

2)编码序列表中序列2蛋白质序列的DNA序列；

4、根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述GmDREBa的编码基因是序列表中序列1的DNA序列。

5、含有权利要求3所述基因的表达载体。

6、含有权利要求3所述基因的细胞系。

7、权利要求3所述基因在培育耐逆大豆品种中的应用。