CN116287027A - 短小芽孢杆菌在将木质素转化香草醛中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及短小芽孢杆菌在将木质素转化香草醛中的应用，本发明利用短小芽孢杆菌转化木质素产生香草醛，相对物理化学高值化的方法，既不要求严苛的反应条件，也不会对环境也不会造成污染，是一种环保且较为有效的高值化方法，可以对多种G单元的木质素单体化合物混合物进行转化，特别是对香草醇进行转化时，转化效率接近100％，本发明通过微生物法转化底物生成的香草醛属于天然香草醛，符合欧盟和美国等对食品安全标准，适用范围广。
Description
技术领域
本发明涉及木质素的利用方法领域，具体涉及短小芽孢杆菌在将木质素转化香草醛中的应用。
背景技术
木质素作为自然界中广泛纯在的酚类聚合物，是自然界中储量第二丰富的天然可在生生物质资源。在过去的生产中，木质素因其异质性以及稳定的化学结构限制了它的利用，通常在造纸、农业生产中木质素总是作为废弃物被丢弃或者是作为燃烧的材料直接燃烧产生热能用来支持其他的生产过程，然而在化石燃料以及其他资源日渐枯竭的今天这样的使用方式是不可取的，一方面造成资源的浪费，另一方面也对环境造成了污染。
微生物转化木质素及木质素单体是一种较为理想的木质素高值化方法，相对物理化学高值化的方法，既不要求严苛的反应条件，也不会对环境也不会造成污染。在木质素的高值化产物中，香草醛是一种具有吸引力的产物，它作为现今合成量最多的一种香料，在食品、医药等行业广泛利用，但是目前绝大多数的香兰素都来自于化学合成方法(99％)，化学合成香兰素效率比较高，技术也较为成熟，但是在风味方面远不如天然香兰素。提取自香草荚的香兰素成本很高并且产量低，造成天然香兰素的价格及其昂贵(1200$/kg to 4000$/kg)，无法满足逐渐增长的市场。根据欧洲以及美国的食品立法机构规定以天然前体为底物微生物转化所获得的香草醛被认为是天然香兰素，因此微生物转化生产香兰素成为香兰素研究的热点而广受关注。
微生物转化木质素产生香草醛在之前被证实是可行的，但其相关转化机制以及应用研究却还不多。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对以上不足，提供短小芽孢杆菌在将木质素转化香草醛中的应用。
短小芽孢杆菌在将木质素转化香草醛中的应用。
进一步的，具体应用方法包括以下步骤：
步骤1、利用短小芽孢杆菌处理植物木质化组织，得到了多种G单元的木质素单体化合物混合物；
步骤2、在碱性条件下，利用短小芽孢杆菌对上一步得到的多种G单元的木质素单体化合物混合物进行转化，得到香草醛。
进一步的，具体应用方法包括以下步骤：
步骤1、将植物木质化组织通过快速热裂解方法制备生物油；
步骤2、利用短小芽孢杆菌对上一步得到的生物油进行转化，得到香草醛。
进一步的，具体应用方法为：
利用短小芽孢杆菌对香草醇进行转化，得到香草醛。
为解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案：
本发明利用短小芽孢杆菌转化木质素产生香草醛，相对物理化学高值化的方法，既不要求严苛的反应条件，也不会对环境也不会造成污染，是一种环保且较为有效的高值化方法，可以对植物木质化组织或多种G单元的木质素单体化合物混合物进行转化，特别是对单独香草醇进行转化时，转化效率接近100％，本发明通过微生物法转化底物生成的香草醛属于天然香草醛，符合欧盟和美国等对食品安全标准，适用范围广。
下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明。
附图说明
图1为培养基中总酚和还原糖浓度，其中A图为总酚浓度；B图为还原糖浓度；
图2扫描电镜观察马尾松的表面微观结构变化，其中A图为对照组300倍；B图为样品组300倍；C图为对照组600倍；D图为样品组600倍；
图3为混合底物转化中各底物及香草醛含量变化图；
图4为不同生物油添加量下B.pumilus ZB1的生长量示意图；
图5为不同生物油添加量下B.pumilus ZB1的生长量示意图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
一、短小芽孢杆菌降解木质素能力评估及产物鉴定
1.1实验材料
植物木质化组织采用马尾松粉末，马尾松粉末购买自河南省。蛋白胨、酵母提取物、4-硝基苯丁酸脂(P-NPB)购自Aladdin-阿拉丁试剂公司；2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)购买自Sigma公司；CH3COOH、CH3COONa、NaCl、KH2PO4、MgSO4·7H2O、KNO3等其他无机试剂均购买自国药集团化学试剂有限公司。细菌基因组提取试剂盒购买自天根生化科技(北京)有限公司。
1.2菌株与培养基
短小芽孢杆菌B.pumilus ZB1(CCTCC AB2013116)购自中国典型培养物保藏中心。
LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠10g/L，121℃灭菌30min后备用。
LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠10g/L,琼脂粉15g/L，121℃灭菌30min后制板备用。
Base培养基：5g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L硝酸钾，1g/磷酸二氢钾和0.1g/L七水硫酸镁，121℃灭菌30min备用。
Base-Mp培养基：5g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L硝酸钾，1g/LKH2PO4和0.1g/L七水硫酸镁，20g/L的马尾松(20-80目)，121℃灭菌30 min备用。
1.3 利用菌体处理马尾松
将在Base-Mp培养基培养的B.pumilus ZB1每24h取样一次,每组3个平行，样品用于培养基中还原糖含量测定。
取1ml培养基于2mlEP管，12000rpm离心2min用以去除菌体及马尾松，取离心后上清，使用纯水稀释样品浓度至合适浓度，取500μL样品DNS溶液混合，100℃反应10min,待冷却至室温后取200μL于96孔板，使用酶标仪于540nm测定吸光度，根据得到吸光度，代入葡萄糖标准曲线公式换算出还原糖浓度。
1.4总酚及还原糖测定结果
木质素和纤维素在B.pumilus ZB1的分解下会生成相应的小分子物质，例如酚类、烷烃类以及还原糖类物质，因此检测B.pumilus ZB1在Base-Mp培养基中酚类物质和还原糖的含量可以有效的表征该菌对马尾松中木质素、纤维素和半纤维素的降解情况，测定结果如图1所示。
对照组设置为未加入B.pumilus ZB1的Base-Mp培养基，在总酚测定结果中，处理组的总酚含量在整个菌处理始终高于对照组3倍以上，在第二天样品组总酚含量达到了73.0μg/mL,而对照组的总酚含量则为22.3μg/mL，培养基中的总酚含量在第三天达到最高，达到了81.4μg/mL。总酚含量的变化表明B.pumilus ZB1在生长过程中对木质素的化学结构进行了破坏，并使得大分子的木质素结构解聚形成了溶解于培养基的小分子的酚类物质，这与在生长过程中检测到的始终存在的漆酶与脂酶酶活相对应，表明了B.pumilus ZB1在生长过程中表达了与木质素降解相关的酶用于降解木质素用于维持自身的生长代谢。在还原糖测定结果中，培养基中还原糖的含量自第二天开始样品组便低于对照组，在第一天样品组还原糖含量和对照组相当，分别达到了0.163μg/mL和0.163μg/mL，在生长的第二天，还原糖浓度分别达到了111.9μg/mL和152.9μg/mL，此后样品组的还原糖含量一直维持在这一含量，还原糖含量的下降是因为B.pumilus ZB1需要利用还原糖作为碳源维持自身的生长，而在经历最初的下降后还原糖含量维持在了一定水平说明B.pumilus ZB1在利用自身的酶系统对马尾松中纤维素或半纤维素进行了降解，产生的还原糖与消耗的还原糖维持了一定的平衡，从而使还原糖的含量维持在了一定的水平。
1.5扫描电子显微镜分析
为观察B.pumilus ZB1对马尾松表面的影响，探究菌处理对马尾松物理结构的变化，对菌处理5天后的样品进行显微观察，并设置对照组(0天原始样品)用于对照比较，样品经处理后使用扫描电子显微镜(SEM)对表面物理结构进行观察，扫描电镜观察结果如图2所示。A、B两图分别是300倍的样品组和对照组图片，在A图的观察结果中可以看到马尾松的结构是纤维束状结构有序排列堆叠而成，这种纤维束是由木质素和纤维素、半纤维素共同构成的，纤维素由葡萄糖分子通过-OH间相互连接形成，这些分子连接形成微纤维，微纤维排列整齐、规律，形成马尾松的主要结构。半纤维素在
马尾松中起着加固结构的作用，它本身则于木质素和纤维素交联且较容易降解。木质素在马尾松的整个结构中也起到加固结构作用且较难降解。由B图可以观察到马尾松的纤维状结构上形成了明显的孔状结构，这说明了B.pumilus ZB1在自身生生长过程中对纤维素的结构进行了破坏，使其表面结构变得不再平整，这和培养基中还原糖含量测定结果符合，菌体在生长代谢过程中需要碳源供应，在对培养基中原有的还原糖利用完后为维持自身生长代谢菌体会继续对纤维素聚合物进行分解，从而形成纤维束上的孔状结构。在C图和D图中可以看到马尾松紧密的结构变得松散，这可能和B.pumilus ZB1对木质素和半纤维素的降解有关系，对木质素的降解导致培养基中总酚含量的上升，在总酚测定结果中样品组也高于处理组，因此说明了B.pumilus ZB1对马尾松中的木质素进行了分解。对马尾松表面结构的观察结果证实了B.pumilus ZB1对木质素及纤维素的破坏作用，说明B.pumilusZB1对木质纤维素具有一定的分解代谢作用，并将大分子的纤维素和木质素降解形成了更容易利用的小分子类物质。
木质素在植物中起着支持植物稳固植物形态的作用，由于其异质性导致其化学性质极为稳定，因此在木质纤维素的降解过程中，木质素稳定的化学性质和物理屏障形成了降解的主要屏障。利用木质纤维素的细菌在生长过程中会分泌漆酶、过氧化物酶等多种酶用于分解木质素，造成木质素的物理和化学结构受到破坏，这种破坏效应使得细菌中的酶及菌体本身更容易接近纤维素，细菌本身酶系能够分解纤维素形成分子量较小的糖并利用这种糖作为碳源进行生长。B.pumilus ZB1处理样品组中马尾松表面结构出现明显变化，包括结构的疏松以及孔洞结构的形成，表明了B.pumilus ZB1对木质素的降解作用，使马尾松中的内部结构得以暴露。以上结果表明B.pumilus ZB1能够有效破坏木质素的固有物理结构，而降解的木质素和其他成分会形成小分子的酚类物质和糖类以供细菌代谢生长。
二、短小芽孢杆菌对木质素G单元单体的转化效率及产物分析2.1B.pumilus ZB1对G单元木质素的转化实验
为了探究B.pumilus ZB1对G单元木质素单体的转化效果，使用不同的G单元木质素单体作为底物进行生物转化，这些单体包括香草醛、香草醇、阿魏酸、阿魏酸乙酯、异丁香酚、丁香酚、香草酸，这些单体经过0.22μm有机滤头过滤除菌后备用。香草醛、香草醇、阿魏酸、阿魏酸乙酯使用乙醇作为溶剂，配制成100g/L的母液后过滤备用，异丁香酚、丁香酚则直接过滤备用。
将B.pumilus ZB1甘油菌接种于LB培养基中，37℃，150rpm过夜培养后取1mL菌液接种到含有50mL Base培养基的150mL锥形瓶中，培养24h后分别向其中加入除菌后的各种G单元单体底物，使其底物浓度为1g/L，共5组实验，每组设定3个平行。加入底物过后，继续放置37℃、150rpm摇床进行培养，每隔24h进行取样，用于液相色谱以及气相色谱质谱联用的检测。
2.2气相色谱质谱联用分析
为确定B.pumilus ZB1降解6种G单元木质素单体的降解产物，使用气相色谱质谱联用对转化后的培养基进行检测，样品处理方法和检测方法如上所述。
2.3液相色谱分析
为测定在培养过程中底物以及产物浓度的变化，使用液相色谱对其进行分析。将培养一段时间的培养基使用2M的盐酸酸化至pH等于2,向样品中加入3倍体积的乙腈用于稀释样品以及溶解样品中的异丁香酚、丁香酚,充分混匀后，使用1mL一次性注射器吸取1mL样品，再使用0.22μm有机滤头对样品进行过滤后放入棕色色谱瓶待测。
经过前期多次调研、调试，测定各种单体的回收率后最终确定流动相成分为甲醇,超纯水,乙酸,比例为40:57:3，在此比例下多种底物出峰时间可以有效分离。流动相预混后使用0.22μm有机滤膜进行抽滤，装瓶后再放入超声清洗仪超声30min,待冷却至室温后使用。液相色谱条件：进样量10μL,流动相流量为1mL/min，柱温箱温度为40℃,紫外检测器检测波长为280nm，检测时长为50min。
2.4B.pumilus ZB1对G单元木质素的转化影响因素
为进一步探究各种因素对香草醛浓度的影响。设置因素包括温度、pH、底物浓度、摇床转速，对这四种因素分别设置梯度进行生物转化实验，设置梯度如下：温度(28、37、45℃)；pH(5.0、7.0、9.0)：底物浓度(0.5、1、2g/L)；摇床转速(100、150、200rpm)。在上述条件下进行培养并定时取样通过液相色谱对转化产物进行分析。
2.5马尾松快速热裂解制备生物油与表征
快速热裂解作为一种近年来通过物理方法裂解木质素的研究热点，许多研究已经表明特定的热裂解方法可以影响热裂解所获得的产物从而获得某些特定的产物，但是热裂解方法虽然较为高效，但是其选择性较差，往往得到的是含有多种木质素单体的混合物，其提纯和利用都较为困难。生物转化木质素单体方法因其特定的代谢路线会使得多种木质素单体进入同一条代谢途径，因此可以用来将多种木质素单体转化富集形成同一种产物，进而发挥生物漏斗的作用。通过生物漏斗作用使多种底物存在的复杂混合物得到转化富集形成更简单的混合物，从而减少下游加工过程中提取产物所需的代价。由于B.pumilus ZB1对于大分子木质素的降解效果有限，因此使用快速热裂解结合生物转化的方法，并通过生物漏斗对获得的木质素单体复合物进行转化富集，借以提高木质素的转化利用效果。
使用目数为20和80目的筛网对马尾松进行过筛获得直径大小为80目以下(＜0.18mM)的马尾松木屑，木屑经过数天烘箱烘干后备用。为了表征生物油，使用配有质谱仪(5975)的Agilent 6890N GC进行快速热解GC/MS。将样品在10℃/ms下升温至最终温度400℃并保持25秒。使用GC进一步分析热解挥发物。GC程序的初始温度为40℃。在40℃下保持1分钟后，温度升高10℃/分钟至150℃，并在150℃下维持1分钟。随后，温度升高5℃/min至300℃，在300℃下持续3分钟。分流比为50:1。基于NIST11数据库鉴定生物油中的热解产物。
为了制备生物油以评估B.pumilus ZB1在生物转化中的潜力，使用CarboliteGero TF1管式炉对马尾松颗粒(＜0.18mm)进行快速热解。马尾松被磨碎并通过80目筛，每次制备使用微量天平称取2g马尾松木屑，装入玻璃器皿后将表面整理平整。将装入马尾松的玻璃器皿挂入玻璃管后放入管式炉，利用氮气对炉内的空气进行置换，使炉内的空气置换成氮气，充氮气数分钟后，开始操作管式炉执行程序，快速热解参数设置如先前报告，略有修改。简而言之，将样品在10℃/ms下加热至400℃并保持30min。收集液体产物用于生物转化分析。
2.6B.pumilus ZB1对混合G单元木质素单体的转化实验
木质素结构的异质性决定了木质素的降解产物往往不会是单独的一种产物，因此在实际生产中会存在多种底物混合的情况，为此设计了多种G单元木质素单体底物混合转化的实验用以模拟实际可能存在的情况。对混合G单元木质素每种单体浓度设定为0.2g/L，混合底物组成为丁香酚、异丁香酚、香草醇、阿魏酸、阿魏酸乙酯。首先将B.pumilus ZB1挑菌接种到含有50mL LB的150mL锥形瓶中，37℃过夜培养后取1mL菌液接种到Base培养基中，37℃过夜培养24h后加入经过滤除菌的混合底物，定期取样使用液相色谱进行分析。
2.7B.pumilus ZB1对生物油的转化转化实验
因为生物直接降解木质素的能力比较有限，因此在模拟试验后，使用马尾松作为原料，采用快速热裂解方法用以解聚木质素形成小分子的G单元单体，并希望通过物理裂解与生物转化相结合以获得更好的转化效果。
对混合的G单元木质素单体进行转化实验后确定，在多种木质素单体存在的情况下，B.pumilus ZB1然能将底物转化成香草醛，为进一步探究B.pumilus ZB1对混合木质素单体的转化效果，选择使用生物油为底物。将B.pumilus ZB1挑菌接种到含有50mL LB的150mL锥形瓶中，37℃过夜培养后取1ml菌液接种到Base培养基中，37℃过夜培养24h后分别向培养物中加入1、5和10g/L的生物油,每组设定3组平行。在37℃下并以150rpm/min的速度进行培养，并定期取出样品。通过紫外分光光度计每24小时测量一次B.pumilus ZB1在含有生物油的Base培养基中的生长情况。使用如上所述的HPLC系统进行异丁香酚、丁香酚和香草醛的定量分析。
三、结果分析
3.1B.pumilus ZB1对G单元木质素单体降解产物分析
在以香草醇为底物的实验组中，香草醛、香草酸在香草醇加入的48h内开始产生并在96h内都一直存在，在144h时，香草醇、香草醛、香草酸都无法检测到，说明在菌体代谢过程中，香草醇通过氧化反应转化成了香草醛并进一步氧化形成了香草酸，表明氧化作用在香草醇的代谢过程中发挥了作用。其他代谢产物中乳酸、苯醇酸、丁酸、对甲醇苯酚、愈创木酚、异丁香酚在48h时被检测到，苯乙酸、间苯三酚在96h和144h时检测到，表明这两种G单元产物是作为后续产物所产生的，对苯二酚、邻苯二酚则仅在96h能够检测到，表明这两种物质可能作为香草醇的中间代谢产物而产生，在48h后的生长代谢过程中继续被转化成其他物质。间苯二甲酸、3-羟基苯甲醇在144h时被检测到，表明其可能作为香草醇代谢过些过程中的下游产物。
香草酸用作底物时，所产生的代谢产物以各类有机酸为主，在测定的过程中香草酸始终存在，表明该菌对香草酸的降解转化无法迅速进行，因此香草酸始终存在于整个过程；其它代谢产生的有机酸类包括乙二酸、乳酸、苯乙酸、丁香酸、苯丙氨酸、3-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸、间苯二甲酸，有机酸的积累可能适合香草酸上羧基基团造成培养基pH变化所导致的.此外，2,6-二叔丁基苯酚、3-羟基苯甲醇也在代谢过程中被检测到，在这些代谢产物中，丁香酸仅在144h时被检测到，表明它可能是香草酸的下游代谢产物。
丁香酚在选取的六种G单元木质素单体中较难降解和转化，其代谢产物相对其它5种单体数量较少，仅有8种，包括乳酸、2,6-二叔丁基苯酚、3-羟基苯乙酸、异丁香酚、间苯二甲酸、间苯三酚、乙二酸、苯乙酸，最后3种产物在仅在96h小时检测到，表明其可能作为代谢的中游产物产生。
异丁香酚作为常用于生物转化生产香草醛的前体物质，在用作底物时，同样产生了香草醛。在整个检测的144h中，香草醛始终存在于培养基中，异丁香酚在48h时被检测到，但是在后续检测中无法检测到，这说明异丁香酚在96h内便被完全转化成其他物质，香草醛作为产物之一在此过程中得到了积累，并且香草醛并没有立即转化成其它的副代谢产物，这证明了B.pumilus ZB1具有转化异丁香酚形成香草醛并积累香草醛的能力，表明该菌株是一种可用于香草醛工业生产的潜力菌株。在转化的整个过程中，香草酸都没有被检测到，说明香草醛并没有进一步被氧化成香草酸，进一步表明了在短时间内香草醛并不会被进一步转化成香草酸。其它的代谢产物中丙醇酸、丁二酸、丁酸、3-羟基苯乙酸、3，4-二羟基苯丙酸、丁二醇在48h的检测中出现，在之后的检测中并未检测到，表明这些物质在后续的代谢过程中被该菌利用用于生长代谢，在96h的检测结果中，出现的产物是间苯三酚、2，3，4-三羟基苯甲酸,表明其可能作为中间产物产生。苯乙酸、乳酸、3-甲氧基-4-羟基苯乙二醇、3-甲氧基-4-羟基苯乙二酸这四种物质在异丁香酚的整个代谢过程中都能够检测得到，说明B.pumilus ZB1对其降解转化能力有限，无法将它们完全转化或降解，表明了这几种物质是作为异丁香酚代谢产物中下游位置或者最终的产物。
阿魏酸也是常见的G单元木质素单体，可用于香草醛的生物转化生产。在阿魏酸的代谢产物检测中，香草醛作为产物之一也在96h的时候被检测到，说明B.pumilus ZB1同样具有转化阿魏酸产生香草醛的能力。阿魏酸在检测的三个时间点中，48h和96h都能够检测到，在144h则无法检测到，相对于异丁香酚转化底物花费的时间更长。在其它代谢产物中香草醛仅在第96h时检测到，表明其是作为一种中间代谢产物存在于培养基中，在后续的代谢过程中继续转化成其它物质。邻羟基肉桂酸、3，5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸、间苯二酸在48h的检测结果中出现，表明其可能是作为代谢过程中上游产物。邻苯二酚、对苯二酚、3-甲氧基-4-羟基苯乙二醇、3-甲氧基-4-羟基苯乙二酸、3-羟基苯乙酸在48h以及96h的检测结果中都没有出现，仅出现在144h的检测结果中，出现培养的后期，可能是作为下游产物或者最终产物存在于培养基中。
阿魏酸乙酯为底物的代谢产物中检测到了香草酸、阿魏酸以及异丁香酚，说明阿魏酸乙酯通过酯键断裂形成阿魏酸，阿魏酸再进一步转化为其它物质，此外异丁香酚的产生表明阿魏酸乙酯可能通过某种方式转化成了异丁香酚，并进一步转化成其它产物。阿魏酸、苯乙酸、甘油始终存在于整个检测时间点，其中甘油仅在阿魏酸乙酯的代谢产物中检测到，这可能和阿魏酸乙酯中的乙酯基团有关，阿魏酸乙酯在脂酶的左右下断裂酯键，断裂的乙酯键通过其它反应转化成甘油。间苯二酸、2，6-二叔丁基苯酚、3-羟基苯乙酸、3-甲氧基-4-羟基苯乙二醇、3-甲氧基-4-羟基苯乙二酸仅在48h或96h的检测结果中出现，表明其是作为中间产物所产生并后续转化成其它物质。间苯三酚、3-羟基苯乙酸、对羟基苯乙酸则从96h或144h开始出现表明这三种物质是作为代谢的下游或终产物而产生。
表1B.pumilus ZB1转化六种G单元木质素单体产物汇总
如表1所示，在挑选的6种G单元木质素单体的代谢产物中，乳酸、苯乙酸、3-羟基苯乙酸、间苯三酚等代谢产物频繁出现于6种木质素单体的代谢产物中，表明这些产物在整个G单元的代谢过程中处于下游的位置。乳酸广泛用于食品行业，同时也是乳酸杆菌等微生物的常见代谢产物，在6种木质素的代谢产物中，5种单体的产物中都出现了乳酸，并且在整个代谢过程中其始终存在。阿魏酸乙酯的代谢产物中未检测到乳酸，但是甘油以及对羟基苯乙酸则只在其结果中检测到，甘油的产生可能与阿魏酸乙酯中酯键断裂的有关，在培养基中该反应可能和脂酶的作用由关，因为在MP-base培养基中其活性始终存在，酯键的断裂产生了阿魏酸以及可能的短链醇。阿魏酸中碳碳双键断裂后形成乙酸基团，同时还发生了甲氧基的断裂，这可能和漆酶的作用有关，漆酶能够催化苯酚中的甲氧基的取代反应，并且也能对苯酚类物质中的羟基进行氧化。苯乙酸和3-羟基苯乙酸的产生说明了G单元木质素单体在B.pumilus ZB1中都经历了氧化、去甲氧基的过程，最终G单元木质素单体中的甲氧基被去除，醇或者碳碳双键被氧化形成羧基。在多种微生物多酚化合物的降解研究中，发现间苯三酚在多酚化合物矿化过程中是作为中心代谢产物存在的，这解释了为何在六种G单元木质素单体中间苯三酚频繁出现。在没食子酸居泥杆菌(Pelobacter acidigallici)的间苯三酚降解研究中，间苯三酚经过还原形成二氢间苯二酚，再水解形成3-羟基-5-氧代己酸，最后脱氢形成三乙酸随后经过转化形成乙酰辅酶A进入能量代谢过程。
3.2B.pumilus ZB1对G单元木质素的转化效果
对木质素单体转化的降解产物进行定性分析后，为进一步探究B.pumilus ZB1对木质素单体转化的时空关系，设定了不同时间点取样检测目标产物的含量变化，分别在2、4、6天取样进行液相色谱检测，检测结果如表2所示。
在选定的3个时间点中，第二天均检测到了香草醛，其中阿魏酸和阿魏酸乙酯在第二天的浓度最高分别为64.4和62.8g/L，其后随着菌体生长代谢，香草醛浓度逐渐降低，表明在这两种底物存在的情况下，B.pumilus ZB1在第二天后对香草醛的利用便大过其产生的香草醛，从而使得在第四天和第六天的含量出现了下降。在香草醇和丁香酚的样品组中，香草醛含量的峰值出现在第六天，其浓度分别达到了991.6和6.6g/L，这两种底物所产生的香草醛分别是5种底物中浓度最高和最低的。香草醇的转化率达到了99.2％，表明绝大部分的香草醇都转化成了香草醛，香草醇到香草醛的转化是由于苯环上的羟基转化成了醛基，反应为一个氧化反应，B.pumilus ZB1的基因组数据中可以找到丰富的氧化酶基因，这其中的氧化酶催化了这个反应，值得注意的是在香草醛为底物的时候，B.pumilus ZB1仅仅催化了醇到醛的氧化反应，香草醛在6天内并未出现明显的转化现象，其浓度也并未出现下降，香草醛在6天内的积累表明了B.pumilus ZB1具有转化木质素单体形成香草醛并积累香草醛的能力。丁香酚为底物的样品组中，产生的香草醛浓度很低，这和丁香酚的毒性有关系，丁香酚对芽孢杆菌的毒性可以抑制芽孢杆菌的生长并使其死亡，在显微镜的观察结果也验证了丁香酚对B.pumilus ZB1的毒性，在添加了丁香酚后显微镜下观察到B.pumilus ZB1的数量急剧减少，菌体的死亡导致了其对丁香酚的转化率极低。使用异丁香酚为底物时，香草醛的最高峰值出现在第四天，其最高浓度为103.5mg/L,转化率为10.3％，在转化的第六天，香草醛的浓度出现下降，说明在异异丁香酚为底物时，B.pumilus ZB1对香草醛的利用与转化是一种非线性的关系，在转化的第四天，想对第二和第六天其积累的香草醛浓度最高。
综上所述，B.pumilus ZB1对5种木质素G单元单体化合物均具有一定的转化效果，但是其转化效果并不一致，转化效果最好的是香草醇，转化率接近百分之百，在以香草醇为底物时，B.pumilus ZB1并不会立即将香草醛转化成香草酸，而是会积累香草醛，这赋予了B.pumilus ZB1应用于香草醛的生产的潜力。转化效果最差为丁香酚，丁香酚的细胞毒性会让B.pumilus ZB1死亡因此其难以转化。阿魏酸、阿魏酸乙酯和异丁香酚其转化率均在10％左右，阿魏酸和阿魏酸乙酯转化情况类似，这可能和阿魏酸乙酯酯键断裂生成阿魏酸有关，二者遵循相同的代谢线路，因此其转化的情况也类似，二者的区别点在于阿魏酸乙酯的转化率始终略低于阿魏酸，这也符合阿魏酸乙酯先转化为阿魏酸的推断，多余的一步转化过程致使转化率略低。异丁香酚则和其余几种单体均不同，其转化率呈弧线，第四天最高，往后则下降。
表2B.pumilus ZB1不同时间转化木质素单体得到的香草醛浓度
3.3B.pumilus ZB1对G单元木质素转化的影响因素
在对B.pumilus ZB1转化木质素单体的转化效果进行探究后，为进一步探究影响B.pumilus ZB1转化的因素，在原有实验基础上设计了不同条件的实验，结合转化效果实验挑选第四天作为一个测定的实验点，在转化的第四天取样使用液相色谱进行定量分析。如表2，通过对转化的基础条件进行调整获得了各种因素的影响结果。异丁香酚的影响因素中28℃在选定的温度中转化浓度(160.9mg/L)明显高于45℃时(83.2mg/L)，摇床转速中100rpm/min条件下转化浓度最高，Ph和底物浓度规律则是ph越接近9.0，底物浓度越接近2g/L转化浓度越高。丁香酚的影响因素中底物浓度和pH和转速对其转化浓度的影响和异丁香酚类似，但是即使改变了各种因素，对于丁香酚的转化也无明显的影响，这可能和即使改变了条件也无法接触丁香酚的毒性有关。香草醇的四个因素改变后影响趋势和异丁香酚类似，其中温度对其影响效果较大，在45℃时，其转化效下降到正常条件下的12％，提高温度则提高到原本条件下的168％。在转速为100rpm/min和pH 9.0的条件下，香草醇的转化率接近100％。阿魏酸和阿魏酸乙酯的影响效果类似，摇床转速对其转化率的影响与异丁香酚相反，在200rpm/min时转化效果最好。pH对二者影响则和异丁香酚相同，pH越接近9.0，香草醛的浓度越高，在pH 5.0时，以阿魏酸乙酯为底物的实验组中未检测到香草醛。
如表3所示，对5种底物进行转化因素的探究后发现，在温度较低时有利于异丁香酚和香草醇以及的转化；摇床转速的影响则是转数低有利于异丁香酚、丁香酚、香草醇的转化，转数高则有利于阿魏酸和阿魏酸乙酯的转化。pH对5种底物的转化影响则保持一致，ph越接近9.0转化率越高。在5个实验组中，底物浓度越接近2g/L则香草醛浓度越高。初步的探究表明pH和底物浓度与转化的效果均是呈正相关的关系。温度、转速对于5组实验组则无统一的规律，对于不同的实验组影响作用不同。值得注意的时，香草醇在摇床转速100rpm/min或者pH 9.0的情况下，转化率接近100％。
表3B.pumilus ZB1不同时间转化木质素单体得到的香草醛浓度(ND代表未检测到)
3.4B.pumilus ZB1对混合G单元木质素单体的转化效果
在混合底物中各底物之间的转化情况如图3所示。选定的5种底物中阿魏酸乙酯在第一天的转化中便完全消失，与之对应的是阿魏酸含量的上升，在第一天阿魏酸的含量由206.08mg/L上升到了368.52mg/L，这表明阿魏酸乙酯经B.pumilus ZB1的作用大部分转化成了阿魏酸。香草醇、丁香酚在测定的六天中始终存在并且逐渐降低，最终的浓度分别为60.55mg/L、18.53mg/L。阿魏酸含量经过上升后开始逐渐下降，第五下降量最大，达到了208.26mg/L，在第六天检测结果中未检测到阿魏酸。异丁香酚在转化的第三天便完全消失，在选择的五种底物中转化最快。香草醛自第一天开始产生，第五天含量达到最大值115.34mg/L，第六天含量下降。各底物之间的转化关系表明阿魏酸乙酯转化成了阿魏酸，在底物混合的情况下，香草醛的产生量不如单独底物时，仅有理论计算值的46％左右。香草醇作为单独底物中转化率最高的底物，在底物混合情况下第六天时还未完全转化，说明在底物混合的情况下，B.pumilus ZB1对香草醇的转化受到了抑制。丁香酚对B.pumilus ZB1生长有抑制作用，其可能是造成转化率下降的原因。异丁香酚的完全转化时间并未受到太大影响，说明在混合底物中异丁香酚亦能得到有效转化。阿魏酸在第4天含量的极速下降并未引起香草醛含量明显的上升，说明阿魏酸转化成香草醛的过程中有副产物的存在并在此过程中占据了主要部分。
3.5生物油的表征
生物油制备完成后，放于4℃冰箱保存备用。
对生物油进行快速热裂解后，直接进行气相色谱质谱联用分析得到了生物油的成分组成信息。经整理后得到表4。由表可知，快速热裂解产生了丁香酚、异丁香酚以及反式的异丁香酚，它们在产物中的峰面积比例分别为0.36％、0.81％、0.94％。在产物中，除去带有苯环的产物外，其它的产物还有烃类物质，例如角鲨烯。在木质素热裂解的产物中，烃类物质是常见的一类产物。不同种类木质素热裂解产物有所不同，木质素组成基单元种类和比例的不同会造成产物的差别。例如在银杏木质素热裂解实验中，丰富的G单元类单体更有利于产生更多缩合和氧化产物(PAHs和芳香酮、醛和酸)，此外不同的裂解温度也会影响产物的产量和种类，在400℃的条件下，软木木质素生物油的产量可以达到最高的水平，因此选择400℃作为裂解温度以期望获得较多的生物油。
表4生物油成分测定
通过对产生的生物油各种组分的比例进行分析，计算可得在生物油原始样本中异丁香酚、丁香酚和香草醛的含量，如表5。在添加10g/L的生物油的Base培养基中异丁香酚、丁香酚、香草醛的含量分别为68.3mg/L、23.5mg/L、15.9mg/L.其它生物油裂解得到的产物包括角鲨烯、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯等。
表5添加10g/L的生物油的Base培养基中的异丁香酚、丁香酚、香草醛的含量
3.6添加生物油的对B.pumilus ZB1生长影响和转化效果
生物油中含有的丁香酚等物质对B.pumilus ZB1的生长具有抑制作用，因此对添加不同浓度生物油的Base培养基中的菌体浓度进行了测定，测定结果如图4所示。设置的对照组(未添加任何生物油)其生长趋势为在第一天达到峰值，达到了3.60。在第二天开始OD值开始逐渐下降，直至第六天达到最低值，对照组中菌体的生长情况表明B.pumilus ZB1在24h内便充分利用培养基中的营养物质进行了生长，其后培养基中的营养物质无法在供给菌体的继续生长，仅能供给菌体基本代谢，从而导致菌体量无法继续增加，反而出现下降。在添加1g/L和5g/L生物油的实验组中，OD值峰值分别出现在第三天和第四天，表明在添加了生物油后，菌体的生长得到了改善，使得OD值的峰值逐渐出现往后的推移，说明生物油中部分产物供给了菌体的生长，生物油作为底物不仅用于产物转化同时生物油中其它的物质则作为营养物质供给了菌体的生长。在添加10g/L生物油的实验组中，OD值的峰值进一步向后推迟到了第五天，进一步的验证了猜想并可初步得出结论：在一定范围内，随着生物油添加量的增加，生长量的峰值逐渐推迟，生物油添加过后作为营养物质有效的改善了B.pumilus ZB1的生长。在GC-MS测定结果中除去各类酚类物质外还存在有长链的烃类物质，例如角鲨烯，而烃类物质可以作为营养物质供给细菌的生长。
木质素热裂解得到的生物油中成分较为复杂，其中既有抑制细菌生长的酚类物质如丁香酚，也有有利于细菌生长的链烃类物质如角鲨烯。生物油成分的复杂性决定了其利用的困难性，但生物转化所具有的优势可以一定程度的避免这些问题。在B.pumilus ZB1生物转化过程中，菌体利用烃类等物质为生长营养物质供给自身生长，并将这些物质进行吸收，通过自身酶系统将这些产物转化最终成易分离的小分子物质或者CO2。
在利用生物油为底物的转化实验中，香草醛浓度随培养时间的增加而增加。值得注意的是，当生物油浓度增加时，香草醛的产量也随之增加。正如预期的那样，在Base培养基中添加1、5和10g/L的生物油后，香草醛的浓度在第6天分别增加到7.54、14.31和56.85mg/L。以10g/L生物油为底物，第5天香草醛的最大产量为71.99mg/L。如图5，10g/L生物油中异丁香酚和丁香酚的初始含量分别为68.3和23.5mg/L。10g/L生物油中香草醛的初始含量为15.9mg/L。总的来说，在扣除初始底物中的香草醛后，生物油中61.1％的的异丁香酚和丁香酚通过B.pumilus ZB1转化成香草醛。
通过生物转化的作用，生物油的复杂性得到了降低，同时将底物转化成了目的产物。油复杂性的降低可以降低后续下游加工提取的成本，有利于生产。生物转化作为一种绿色环保的生产方式，所生产得到的产品在安全性上更加的安全，同时产品在市场中也更受欢迎，因此生物转化结合热裂解的方法相较传统化学生产方法更加环保安全，同时产品也更加欢迎。
3.7本章小结
在碱性环境以及高底物浓度时，所得到的香草醛浓度均较高，证明碱性环境和高底物浓度有利于香草醛的积累。在混合底物实验中，底物的转化受到了一定程度上的抑制使得香草醛浓度下降，表明在混合底物中B.pumilus ZB1任然能够转化底物但会受到部分底物的抑制。以生物油为底物时，菌体的生长情况得到了一定程度上的改善，并且香草醛浓度也随着生物油浓度的上升而上升，证明了生物油作为底物用于香草醛生产的可能性。
四、结论
木质素的生物方法高值化一直是木质素高值化的研究难点，而面对自然界丰富的木质素，提出一种环保且较为有效的高值化方法是至关重要的。本发明研究了生物方法与快速热裂解结合提高木质素高值化效果的策略，并进一步探究了生物转化异丁香酚产生香草醛的机制。
本发明以B.pumilus ZB1为生物转化平台，对大分子和小分子木质素均进行了降解转化分析，并进一步确认了其异丁香酚的转化机制。在总酚测定结果中，处理组的总酚含量在整个菌处理始终高于对照组3倍以上。在还原糖测定结果中，培养基中还原糖的含量自第二天开始样品组便低于对照组，在第一天样品组还原糖含量和对照组相当，在生长的第二天，还原糖浓度分别达到了111.9μg/mL和152.9μg/mL，总酚和还原糖的变化表明了B.pumilus ZB1在生长过程中表达了与木质素降解相关的酶用于降解木质素和纤维素用于维持自身的生长代谢。
B.pumilus ZB1处理样品组中马尾松表面结构出现明显变化，包括结构的疏松以及孔洞结构的形成，表明了B.pumilus ZB1对木质素的降解作用，使马尾松中的内部结构得以暴露。这表明B.pumilus ZB1能够有效破坏木质素的固有物理结构，
傅里叶红外观测结果中，木质素官能团吸收峰区的红外光谱(1600-3400cm-1)和纤维素官能团吸收峰区的红外光谱(1300-1700cm-1)表明.经过5天的处理后，木质素官能团的特征峰为3414cm-1处氢键O-H伸缩振动吸收峰、2935cm-1处C-H伸缩振动吸收峰和2842cm-1处C＝O伸缩振动吸收峰消失，C图中，纤维素特征峰包括1640cm-1处共轭C＝O键伸缩振动吸收峰、1430cm-1处不对称C-H伸缩振动吸收峰、1372cm-1处对称C-H伸缩振动吸收峰和1336cm-1处O-H平面内伸缩振动吸收峰以及CH2在1318cm-1处的摆动减小。木质素官能团特征峰的消失和纤维素特征峰的摆动减少都表明马尾松经过B.pumilus ZB1处理过后，结构受到了有效的破坏，从而造成木质素和纤维素特征峰的消失。
在B.pumilus ZB1对马尾松木质素降解产物分析中，香草酸和丁香酚被释放到培养基中，说明B.pumilus ZB1对马尾松木质素将大分子的木质素分解成了小分子的木质素单体。
利用B.pumilus ZB1对6种G单元木质素单体化合物进行了转化实验以及转化影响因素的探究实验。香草醇、异丁香酚、阿魏酸在质谱结果中均发现了香草醛，而其它几种底物的产物中阿魏酸乙酯产生了阿魏酸，香草酸无明显转化。转化结果证明了B.pumilus ZB1具有将多种G单元木质素单体转化成香草醛的能力，其中香草醇的转化率接近100％。转化影响因素的探究实验证明高底物浓度和高pH有利于转化的进行，便于积累香草醛。
使用混合G单元木质素单体和生物油为底物记进一步验证该菌对复杂底物的转化能力。在混合G单元木质素单体的转化结果中表明，多种单体存在的情况下会影响其转化效果，使其低于单独转化时的效果。生物油作为底物时，生长情况得到一定改善并且香草醛的含量得到进一步的提高，表明B.pumilus ZB1具有用于木质素转化生产香草醛的潜力。
以上所述为本发明最佳实施方式的举例，其中未详细述及的部分均为本领域普通技术人员的公知常识。本发明的保护范围以权利要求的内容为准，任何基于本发明的技术启示而进行的等效变换，也在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.短小芽孢杆菌在将木质素转化香草醛中的应用。
2.根据权利要求1所述的短小芽孢杆菌在将木质素转化香草醛中的应用，具体应用方法包括以下步骤：
步骤1、利用短小芽孢杆菌处理植物木质化组织，得到了多种G单元的木质素单体化合物混合物；
步骤2、在碱性条件下，利用短小芽孢杆菌对上一步得到的多种G单元的木质素单体化合物混合物进行转化，得到香草醛。
3.根据权利要求1所述的短小芽孢杆菌在将木质素转化香草醛中的应用，具体应用方法包括以下步骤：
步骤1、将植物木质化组织通过快速热裂解方法制备生物油；
步骤2、利用短小芽孢杆菌对上一步得到的生物油进行转化，得到香草醛。
4.根据权利要求1所述的短小芽孢杆菌在将木质素转化香草醛中的应用，具体应用方法为：
利用短小芽孢杆菌对香草醇进行转化，得到香草醛。
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