CN116751824A - 一种通过多酶级联反应催化hmf转化生成fdca的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种通过多酶级联反应催化HMF转化生成FDCA的方法,包括以下步骤:步骤1、利用短小芽孢杆菌漆酶将羟甲基糠醛完全转化为羟甲基糠酸;步骤2、向步骤1的反应体系中添加醇氧化酶,醇氧化酶将羟甲基糠酸氧化得到5‑甲酰基‑2‑呋喃甲酸,最终通过两种酶级联生成2,5‑呋喃二甲酸。本发明仅通过两种氧化酶级联就实现了HMF向FDCA的高效生物转化。采用的短小芽孢杆菌漆酶为细菌漆酶,不需要添加昂贵的氧化还原介体即可完成级联催化反应,并且细菌漆酶可以解除中间产物FFCA对醇氧化酶活性的抑制,增效了醇氧化酶对中间产物HMFCA的进一步转化。具有选择性高、成本低、无副产物以及转化效率高的特点。
Description
技术领域
本发明涉及羟甲基糠醛转化方法领域,具体涉及通过多酶级联反应催化HMF转化生成FDCA的方法。
背景技术
生物质是一种可再生原料,生物质中的纤维素经过水解、异构、脱水生成5-羟甲基糠醛(HMF),HMF的羟甲基和醛基通过3步氧化反应完全氧化得到2,5-呋喃二羧酸(FDCA),FDCA具有良好的应用前景,可以与乙二醇聚合,合成具有可循环再生性、热稳定性、可持续性的2,5-呋喃二甲酸乙二醇酯(PEF),是传统化石能源生产的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的有效替代品。目前报道的生产FDCA的方法有化学转化法、电化学转化法和生物催化法。化学转化法通常需要高温、高压、催化剂等,因此存在成本高,污染大等问题。生物催化反应条件温和、能耗低、不产生污染,适合用于进行FDCA的生物合成,包括微生物转化法和酶转化法。一般来说,由于底物HMF转化得到FDCA的过程涉及3个氧化反应,鲜有微生物或酶能够独立完成整个催化过程,所以通常需要偶联多个催化过程进行转化。然而,野生菌株存在转化效率低的问题,同时对出发野生菌株进行遗传修饰增加了技术难度,并且微生物转化还需要额外的纯化过程,较低的得率和生产率限制了全细胞催化的实际应用。相较于微生物法,基于酶法设计的多酶级联催化操作简单、易于产物的纯化,是HMF生物转化产FDCA的一种有前途的策略。
漆酶广泛的底物氧化特性表明其可以催化HMF侧链基团的修饰。同样地,醇氧化酶也具有广泛的底物特异性,对于二醇、伯醇、芳醇等底物均能表现出较高的比活性。HMF转化生产FDCA包含多个侧链氧化的步骤,鲜有报道称单一酶能够实现HMF完全转化得到FDCA。因此,基于多种酶偶联开发HMF的完全转化策略具有可行性。值得注意的是,真菌漆酶具有氧化HMF及其部分衍生物的能力,但真菌漆酶的反应体系中往往需要添加人工合成的氧化还原介体来改善HMF的生物转化效率,如(2,2,6,6-四甲基哌啶-1-基)氧基(TEMPO)等。这意味着,人工合成氧化还原介体的添加不仅引起成本的增加,而且带来环境污染的风险,不利于实际FDCA生产的应用。细菌漆酶的环境适应性较真菌漆酶更好。但是,目前细菌漆酶在多酶级联催化HMF得到FDCA的应用过程尚不明确。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对以上不足,提供一种通过多酶级联反应催化HMF转化生成FDCA的方法。
为解决以上技术问题,本发明采用以下技术方案:
一种通过多酶级联反应催化HMF转化生成FDCA的方法,包括以下步骤:
步骤1、利用短小芽孢杆菌漆酶将羟甲基糠醛完全转化为羟甲基糠酸;
步骤2、向步骤1的反应体系中添加醇氧化酶,醇氧化酶将羟甲基糠酸氧化得到5-甲酰基-2-呋喃甲酸,最终通过两种酶级联生成2,5-呋喃二甲酸。
进一步的,所述步骤1的反应体系中包括45-55mmol/L的磷酸钠缓冲液、4-6mmol/L的羟甲基糠醛、90-110μg/mL氨苄西林和0.8-1.1U/mL的短小芽孢杆菌漆酶,反应条件为在25-30℃,200-300rpm转速下震荡24h以上。
进一步的,所述步骤2中,醇氧化酶的添加量为0.8-1.1U/mL,反应条件为在25-30℃,200-300rpm转速下震荡24h以上。
进一步的,所述短小芽孢杆菌漆酶和醇氧化酶均为具有活性的高纯度重组酶蛋白,制备方法为,通过克隆得到来源于短小芽孢杆菌的漆酶Lac以及盘长孢状刺盘孢的醇氧化酶AlcOx,通过毕赤酵母异源表达系统与镍柱亲和层析后得到。
本发明的有益效果为:
本发明仅通过两种氧化酶级联就实现了HMF向FDCA的高效生物转化。采用的短小芽孢杆菌漆酶为细菌漆酶,不需要添加昂贵的氧化还原介体即可完成级联催化反应,并且细菌漆酶可以解除中间产物FFCA对醇氧化酶活性的抑制,增效了醇氧化酶对中间产物HMFCA的进一步转化。具有选择性高、成本低、无副产物以及转化效率高的特点。
下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明。
附图说明
图1为Lac与AlcOx转化HMF及其衍生物转化路径示意图;(其中A图为Lac转化HMF及其衍生物转化路径示意图,B图为AlcOx转化HMF及其衍生物转化路径示意图);
图2为Lac和AlcOx从HMF合成FDCA的酶级联反应的路径图;
图3为Lac和AlcOx级联催化HMF合成FDCA示意图;
图4为以HMF为底物合成FDCA的酶级联反应的1H-NMR谱示意图;(其中A图为反应混合物中初始羟甲基糠醛的谱图;B图为Lac催化HMF完全生成HMFCA的谱图;C图为酶级联中最终产物FDCA的鉴定谱图);
图5为使用混合底物测定AlcOx氧化能力示意图;(其中A图为使用含有2.5mM FFCA和2.5mM HMFCA的混合底物测量AlcOx的氧化能力;B图为使用含有2.5mM FDCA和2.5mMHMFCA的混合底物测量AlcOx的氧化能力);
图6为混合漆酶与醇氧化酶验证产物抑制作用;(其中A图为验证Lac在含有2.5mMFFCA和2.5mM HMFCA的级联反应中缓解FFCA对AlcOx的抑制作用;B图为分析Lac和AlcOx的混合酶对含有2.5mM HMFCA和2.5mM FDCA的混合底物的氧化能力)。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述,所举实例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。
(一)培养基的配置
LB培养基:酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L。
YPD培养基:酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L。
BMGY培养基:酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、甘油10g/L、无氨基酵母氮源(YNB)13.4g/L。
BMMY培养基:酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、无氨基酵母氮源(YNB)13.4g/L。
(二)基因的克隆表达与纯化
将漆酶基因和醇氧化酶基因扩增并分别克隆到线性化的pPICZαA中,重组质粒通过SacⅠ线性化后,通过电化学转化法转进毕赤酵母X33中,涂布至YPD(含博来霉素)平板,分别选择阳性重组体X33/pPICZαA-lac和X33/pPICZαA-AlcOx接种于50mL YPD培养基中,28℃,220rpm震荡过夜。将活化的菌液分别按2%接种量(v/v)接种到添加0.5mM CuSO4和0.2%生物素的BMGY培养基中,28℃,220rpm震荡过夜,在培养约16-18h后,OD600达到2-6,将菌液低温离心后,菌体转移到添加0.5mM CuSO4和0.2%生物素的BMMY培养基中,18℃,200rpm震荡。每日添加0.5%甲醇和1%甲醇分别诱导表达Lac和AlcOx,当Lac和AlcOx酶活性最高时收集上清液。
上清液通过膜包浓缩,分别用pH 8.0和pH 7.5的50mM磷酸钠缓冲液平衡Ni-NTA柱,当柱中溶液快接近凝胶柱界面时,将浓缩后的上清液加到Ni-NTA中,在含有0.5M NaCl的50mM磷酸钠缓冲液中,用20-300mM的咪唑线性梯度洗脱,使用10kDa的超滤管,4℃、3000g对洗脱液进行脱盐,脱盐后目的蛋白通过SDS-PAGE验证。
(三)酶活测定
漆酶活性测定:在室温下,以ABTS为底物,在醋酸钠缓冲液中测定,反应体系中含有50μL的20mM ABTS、940μL的0.2M醋酸钠缓冲液(pH5.0)和10μL纯化的Lac,在420nm(ε=36,000M-1cm-1)处监测ABTS的氧化,酶活定义为每分钟氧化1μmol ABTS的量为一个酶活单位。
醇氧化酶活性测定:在室温下,以ABTS为底物,在420nm(ε=36,000M-1cm-1)处测定,反应体系由50mm磷酸钠缓冲液(pH 7.0)、0.46mM ABTS、30U/mL HRP、25mM藜芦醇和纯化的AlcOx组成。醇氧化酶氧化底物上的醇基消耗1当量的O2,产生1当量的H2O2,ABTS随后被HRP氧化,消耗2当量的H2O2。因此,AlcOx的活性定义为每分钟氧化2μmol ABTS所需的AlcOx的量。
(四)生物转化HMF及其衍生物
用漆酶和醇氧化酶分别对HMF及其衍生物(DFF、HMFCA和FFCA)进行生物转化。反应混合物的总体积为5ml,其中含有50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0),5mM单个底物(HMF,DFF,HMFCA和FFCA)和1U/mL纯化酶(Lac或AlcOx)。在反应体系中补充氨苄西林,终浓度为100μg/mL。反应温度28℃,220rpm振荡120h。每24h取一次样品,通过加入6M HCl调节pH至2.0停止反应,使用0.2μm滤膜过滤转化产物。以含底物而不加酶的反应混合物为对照。用高效液相色谱法对转化产物进行分析。所有实验均为三次重复。
(五)HPLC分析转化产物
使用Agilent 1260系列高效液相色谱系统,配备Bio-Rad Aminex HPX-87H色谱柱和紫外检测器(波长=264nm)分析转化产物。流动相为7.5mM H2SO4。在60℃,流速0.6mL/min的条件下进行分离鉴定。进样量为20μL。HMF、HMFCA、DFF、FFCA和FDCA的保留时间分别为29.74、20.47、36.2、22.42和16.15min。根据绘制的标准曲线计算转化产物的浓度(mM)。氧化产物产率(%)由下式(1)计算:
(六)酶级联反应的1H-NMR分析
本研究采用1H-NMR对酶级联氧化HMF生成FDCA进行了分析。将标准化学品HMF、DFF、HMFCA、FFCA、FDCA溶解于D2O中。使用核磁共振光谱仪表征每种化学物质的化学位移。每种化学物质的1H-NMR特征峰的化学位移如表1所示。在三个不同的时间点收集酶联反应的样品。首先,在反应开始时获得样品(图1A)。其次,当HMF被Lac完全转化为HMFCA时,将样品从反应混合物中取出(图4B)。然后用最终转化产物来确认混合物中FDCA是否是主要产物(图4C)。通过超滤(标称分子量截止为10kDa)将目标化学物质从酶中分离出来。然后将样品溶解在10% D2O(v/v)中,进行1H-NMR分析。
表1HMF及其衍生物特征峰的化学位移
(七)酶级联反应
在HMF氧化得到FDCA的过程中,根据HMF被氧化官能团的不同,通过两个中间体2,5-二甲酰呋喃(DFF)和5-羟甲基呋喃羧酸(HMFCA)连续三步氧化得到终产物2,5-呋喃二羧酸(FDCA)。上述中间产物DFF和HMFCA进一步氧化可生成5-甲酰基呋喃羧酸(FFCA),最终转化为FDCA。按发明具体实施步骤转化HMF及其衍生物,结果表明细菌漆酶对HMF和2-甲酰基-5-呋喃甲酸(FFCA)的氧化表现出良好的催化性能,可以将HMF氧化为5-羟甲基呋喃甲酸(HMFCA),将FFCA氧化为FDCA(图1A)。AlcOx氧化HMF与Lac有很大的不同。当5mM的HMF作为底物时,AlcOx催化HMF形成2,5-二甲酰呋喃(DFF),未检测到HMFCA,AlcOx几乎不能氧化DFF,能够氧化HMFCA生成FFCA和FDCA(图1B),因此漆酶与醇氧化酶级联生产FDCA采用两步法完成,第一步细菌漆酶将HMF完全转化为HMFCA,第二步反应体系中添加醇氧化酶,醇氧化酶氧化得到FFCA,两种酶级联生成FDCA(图2)。
反应体系及反应条件:级联反应总体积为5ml,含50mm磷酸钠缓冲液(pH 7.0),5mMHMF,1U/mL纯化Lac,1U/mL纯化AlcOx,100μg/mL氨苄西林。反应通过两步完成,第一步,将Lac与底物HMF一起加入到反应混合物中,反应在28℃,220rpm震荡24h。第二步,在混合物中加入AlcOx,在28℃,220rpm震荡继续反应,每24h取一次样检测转化产物及转化效果。
按照发明具体实施步骤进行级联反应,结果表明Lac在24h内将HMF快速转化为HMFCA。此后,在48h内,HMFCA的含量随着FFCA的积累而下降,说明AlcOx可以在级联反应中有效地将HMFCA转化为FFCA。反应进行到48h后,FDCA的产率随着FFCA含量的降低而不断增加,连续反应168h后,FDCA相对于HMF的效价和产率分别达到4.88mM和97.5%(图3)。此外,对于每种化学物质的特征信号,当Lac将HMF完全转化为HMFCA时,观察到HMF的消失和HMFCA的形成(图4B)。当反应混合物中加入AlcOx时,中间产物HMFCA迅速转化为FDCA。1H-NMR分析证实,最终产物中只检测到FDCA的特征信号(图4C)。因此,1H-NMR谱证实,通过我们研究中建立的酶级联,HMF几乎可以完全转化为FDCA。
有报道称,漆酶通常需要介体的存在进行HMF的氧化,例如,枯草芽孢杆菌168漆酶与过氧化氢酶、TEMPO和H2O2偶联可有效利用HMF作为底物,产率为97.1%。我们研究发现,在没有介体存在的情况下,短小芽孢杆菌漆酶和盘长孢状刺盘孢醇氧化酶偶联即可实现HMF的完全转化,FDCA产率为97.5%。因此,降低介体的用量可能有利于FDCA生物合成的实际应用。在本工作中,级联反应的转化效率远高于单一酶参与的转化反应,且AlcOx在酶促级联反应中对HMFCA的氧化能力明显高于其参与的单一酶转化反应。我们推测中间产物FFCA和最终产物FDCA可能会抑制AlcOx对HMFCA的催化活性,细菌漆酶可能减轻FFCA和FDCA对AlcOx的抑制作用。
(七)分析FFCA和FDCA对AlcOx活性的抑制作用
通过两个实验验证FFCA和FDCA是否能抑制AlcOx的活性。i)将2.5mM FFCA和2.5mMFDCA各加入到含有2.5mM HMFCA和1U/mL AlcOx的反应混合物中。ii)将2.5mM FFCA和2.5mMFDCA分别加入到含有2.5mM HMFCA、1U/mL Lac和1U/mL AlcOx的反应混合物中。所有反应混合物均含有50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0),然后在28℃下以220rpm摇匀。用HPLC法测定FDCA的产率。所有的实验包含三次平行。
按照发明具体实施步骤进行反应,首先将2.5mM FFCA或FDCA与HMFCA混合,与AlcOx一起反应。当FFCA与HMFCA共存时,24h内FFCA的含量增加到3.79mM,仅检测到微量的FDCA(图5A)。当FDCA与HMFCA共存时,AlcOx作用24h后,FDCA的含量增加到2.96mM,而FFCA几乎未检出(图5B)。这些结果表明,在酶级联反应中存在产物抑制,即FFCA可以抑制AlcOx对HMFCA氧化的活性,而FDCA则没有。为了进一步验证Lac是否可以缓解FFCA对AlcOx活性的抑制作用,我们在含有等量HMFCA及其氧化衍生物(FFCA或FDCA)的反应混合物中加入1U/mLLac。如图6A所示,HMFCA在12h内几乎完全转化为FFCA,用AlcOx和Lac处理24h后,FFCA的量减少到3.23mM,FDCA增加到2.55mM,当FDCA与HMFCA共存时,HMFCA在12h内完全转化为FFCA,24h时FFCA持续减少0.64mM,FDCA增加5.03mM(图6B)。一般来说,醇氧化酶产生的H2O2是级联反应中酶活性的限制因素。据我们所知,漆酶不仅可以耐受H2O2,而且可以减轻FFCA对AlcOx的抑制作用,提高酶联反应合成FDCA的效率。因此,Lac适合与AlcOx偶联,以HMF为原料高效生产FDCA。
(八)结论
本发明选择来源于短小芽孢杆菌的漆酶与来源于盘长孢状刺盘孢的醇氧化酶为研究对象,基于异源表达得到具有活性的重组酶蛋白,分别分析了漆酶和醇氧化酶对HMF及其衍生物的氧化特性,确定了两者可以组成多酶级联催化体系。基于漆酶协同醇氧化酶,建立了有效的HMF转化产生FDCA的反应体系。两种氧化酶在级联催化反应中发挥互补作用。在不添加氧化还原介体的情况下,漆酶对HMF的氧化表现出良好的选择性。生成的HMFCA可以通过醇氧化酶转化为FFCA。随后两种氧化酶协同催化FFCA生成FDCA。值得注意的是,漆酶的存在可以有效缓解中间产物FFCA对醇氧化酶氧化HMFCA的抑制作用,最终提高生物转化效率。综上所述,漆酶与醇氧化酶组成的多酶级联体系是一种有效的FDCA酶法合成策略。
以上所述为本发明最佳实施方式的举例,其中未详细述及的部分均为本领域普通技术人员的公知常识。本发明的保护范围以权利要求的内容为准,任何基于本发明的技术启示而进行的等效变换,也在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种通过多酶级联反应催化HMF转化生成FDCA的方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1、利用短小芽孢杆菌漆酶将羟甲基糠醛完全转化为羟甲基糠酸;
步骤2、向步骤1的反应体系中添加醇氧化酶,醇氧化酶将羟甲基糠酸氧化得到5-甲酰基-2-呋喃甲酸,最终通过两种酶级联生成2,5-呋喃二甲酸。
2.根据权利要求1所述的通过多酶级联反应催化HMF转化生成FDCA的方法,其特征在于,所述步骤1的反应体系中包括45-55mmol/L的磷酸钠缓冲液、4-6mmol/L的羟甲基糠醛、90-110μg/mL氨苄西林和0.8-1.1U/mL的短小芽孢杆菌漆酶,反应条件为在25-30℃,200-300rpm转速下震荡24h以上。
3.根据权利要求1所述的通过多酶级联反应催化HMF转化生成FDCA的方法,其特征在于,所述步骤2中,醇氧化酶的添加量为0.8-1.1U/mL,反应条件为在25-30℃,200-300rpm转速下震荡24h以上。
4.根据权利要求1所述的通过多酶级联反应催化HMF转化生成FDCA的方法,其特征在于,所述短小芽孢杆菌漆酶和醇氧化酶均为具有活性的高纯度重组酶蛋白,制备方法为,通过克隆得到来源于短小芽孢杆菌的漆酶Lac以及盘长孢状刺盘孢的醇氧化酶AlcOx,通过毕赤酵母异源表达系统与镍柱亲和层析后得到。
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CN116287027A (zh) * | 2023-04-10 | 2023-06-23 | 湖北大学 | 短小芽孢杆菌在将木质素转化香草醛中的应用 |
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