CN103695520B

CN103695520B - 醋酸可的松转化中固定化细胞和环糊精循环利用的方法

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Publication number: CN103695520B
Application number: CN201310665015.5A
Authority: CN
Inventors: 申雁冰; 王敏; 王芳; 梁静婷; 骆健美; 郑宇�
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2013-12-09
Filing date: 2013-12-09
Publication date: 2017-06-27
Anticipated expiration: 2033-12-09
Also published as: CN103695520A

Abstract

本发明涉及一种醋酸可的松转化中固定化细胞和环糊精循环利用的方法，属于生物转化技术领域。其步骤包括将含有环糊精的转化液粗过滤回收固定化细胞，并将粗过滤是滤液经离心过滤、有机溶剂萃取后，所得的含有环糊精的萃余相除去残留有机溶剂，分析水相中环糊精的剩余量，计算环糊精的补加量，按补加量加入环糊精后的水相和回收的固定化细胞重新用于醋酸可的松的生物催化，从而实现环糊精和固定化节杆菌的双重循环利用，生物催化的清洁生产。本发明的技术稳定，节约生产成本，具有良好的应用前景。

Description

醋酸可的松转化中固定化细胞和环糊精循环利用的方法

技术领域：

本发明属于生物催化技术领域。具体涉及一种醋酸可的松转化中固定化细胞和环糊精循环利用的方法。

背景技术：

环糊精是直链淀粉在由芽孢杆菌产生的环糊精葡萄糖基转移酶作用下生成的一系列环状低聚糖的总称，通常含有6～12个D-吡喃葡萄糖单元。研究较多且具有重要实际意义的是含有6、7、8个葡萄糖单元的分子，分别称为α-CD、β-CD和γ-CD。环糊精具有独特的“内疏水”“外亲水”的笼形结构，可以包结许多无机、有机和手性客体分子形成主-客体包结物，是目前最重要的具有包结作用的环状化合物。近年来随着许多新型环糊精衍生物的问世，如酯化、醚化，烷基化、羟基化等修饰而得到环糊精衍生物，可以改善环糊精的某些理化性质和包结能力，极大地扩展环糊精的应用领域。

在甾体药物中间体的生物催化过程中，甾体底物的水难溶性一直是甾体工业的关键和难点技术。利用环糊精的特殊性质，将环糊精与甾体分子包结起来，可以有效提高甾体在水溶液中的溶解度，从而提高微生物对甾体化合物的生物转化效率。β-环糊精（β-cyclodextrin，简称β-CD）及其衍生物能与甾体底物作用，使其在水相容易分散，增强甾体底物与细胞的作用；也能作用于甾体催化的产物，减少甾体产物的反馈抑制。随着环糊精及其衍生物在生物转化领域的应用，环糊精在生物转化方面的作用已相当明显，应用也逐渐成熟，逐步走向工业生产阶段。

但是，环糊精的价格相对较高是目前限制其在生物催化技术中应用的主要原因。在环糊精介质生物催化反应体系中，利用环糊精的循环利用技术降低环糊精介质的利用成本，是环糊精催化介质在工业生物催化应用中亟待解决的重要技术问题。目前国内外关于疏水化合物生物催化反应中环糊精的循环利用技术还未见报道。

同时在利用游离细胞进行的生物催化反应中环糊精介质进行循环存在几个问题：

（1）细胞利用率低，游离细胞只能使用一次，成本高，污染大。

（2）产物杂质多。利用游离细胞催化醋酸可的松生产醋酸泼尼松的反应体系中存留有大量的菌体、蛋白等杂质，增加了后续产物分离纯化工艺的负担，不利于环糊精的循环利用等。

发明内容：

为了解决上述问题，本发明提供了一种醋酸可的松转化中固定化细胞和环糊精循环利用的方法。

本发明的技术方案为：在以醋酸可的松为底物，环糊精为促溶剂，固定化细胞为催化剂的生物催化反应体系中，反应结束后

（1）将含有环糊精的转化液粗过滤回收固定化细胞；

（2）将粗过滤后的滤液离心、有机溶剂萃取；

（3）将所得的含有环糊精的萃余相除去残留有机溶剂；

（4）测定水相中环糊精的剩余量，并补加环糊精；

（5）将补加环糊精后的水相和回收的固定化细胞重新用于醋酸可的松的生物催化中。

所述的环糊精为α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、羟乙基-β环糊精、羟丙基-β-环糊精、羟丁基-β-环糊精、磺丁基-β-环糊精、葡萄糖基胺基-β-环糊精、甲基-β-环糊精或羟丙基-γ-环糊精中的一种。

所述的转化液粗过滤采用纱布或20-50目的筛网进行过滤。

所述的萃取剂为乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸异丁酯、二氯甲烷或三氯甲烷中的一种或几种。

所述的萃取剂与滤液的体积比为1-10：1，萃取次数为1-7次。

所述的除去残留有机溶剂的方法为减压蒸馏、蒸馏、精馏中的一种或多种。

所述的固定化细胞为简单节杆菌固定化细胞或球形节杆菌固定化细胞。

所述环糊精的测定方法为：采用Phenomenex Luna NH₂100A(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱，流动相为乙腈-水=60:40（v/v)，流速1.0mL/min，RID示差折光检测器,进样量20μL,柱温30℃。

有益效果：

（1）本发明可以实现环糊精和催化细胞的循环利用，实现疏水化合物生物催化清洁生产、环境友好，节约生产成本的要求。

（2）本发明提供的方法工艺简单、降低环糊精介质和制备细胞的成本，节约资源，带来很大的经济效益。

（3）以循环5次使用的环糊精作为促溶剂的催化体系中，醋酸可的松的的转化率仍然维持在93%以上，在高度节约成本的基础上仍能维持较高的生产效率。

附图说明：

图1为羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）和固定化细胞循环利用1-6次后醋酸可的松转化率变化情况

具体实施方式：

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

实施例1：

化合物醋酸可的松的C_1,2位脱氢反应

微生物菌种采用节杆菌(Arthrobacter simplex)TCCC11037，它能实现甾体化合物的C_1，2位脱氢转化，将醋酸可的松转化为醋酸泼尼松。

斜面培养基(g/L)：葡萄糖10，酵母膏10，琼脂20，pH7.0

种子培养基(g/L)：葡萄糖10，玉米浆10，蛋白胨5，磷酸氢二钾2.5，pH7.0

发酵培养基(g/L)：葡萄糖10，玉米浆15，蛋白胨5，磷酸氢二钾2.5，pH7.0

简单节杆菌固定化细胞制备：

微生物在32℃，160r/min，30/250mL装量条件下活化培养24h，取活化种子以5%接种量在装量为30/250mL条件下发酵培养24h。将发酵培养获得的细胞5000r/min离心后用pH7.2的Tris-HCl缓冲液洗涤三遍，重悬于pH7.2的Tris-HCl缓冲液中获得静息细胞。

将配制好的3%的海藻酸钠溶液与静息细胞等体积混合，搅拌均匀，制成海藻酸钠一简单节杆菌菌悬液。取此菌悬液100mL，在磁力搅拌下，用12号针头的注射器滴加到300mL浓度为的3%的CaCl₂溶液中，将胶珠在CaCl2溶液中继续浸泡2h，过滤，用Tris-HCl缓冲液洗涤二次，即得平均直径为3mm的珠状固定化简单节杆菌细胞。

生物转化：

取0.3g的醋酸可的松加入到30mL含有30mmol/L HP-β-CD的Tris-HCL缓冲液（pH7.2-8.3）中，加入固定化简单节杆菌细胞珠40粒。34℃、180r/min转化8h，HPLC分析测定底物转化率。

环糊精和固定化细胞的循环利用工艺：

取上述生物转化的转化液，采用20目的网筛进行粗过滤回收固定化细胞，所获得的固定化细胞可重新用于醋酸可的松的生物转化。收集粗过滤液5000r/min离心10min，得到滤液和滤饼，加入两倍滤液量的乙酸乙酯，萃取三次，萃余相45℃真空旋蒸除去残留乙酸乙酯。采用Phenomenex Luna NH2100A(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱，流动相为乙腈-水=60:40（v/v)，流速1.0mL/min，RID示差折光检测器,进样量20μL,柱温30℃分析水相中HP-β-CD的剩余量为29.23mmol/L，补加0.77mmol/L HP-β-CD后的含有环糊精的萃余相重新用于醋酸可的松的生物转化。结果表明，环糊精和固定化简单节杆菌细胞循环利用5次后，CA的最终转化率仍在93%以上。

实施例2：

除以下内容外，其他同实施例1。

生物转化中使用的环糊精为40mmol/L羟乙基-β-环糊精。

环糊精和固定化细胞的循环利用工艺：

生物转化的转化液，采用30目的网筛进行粗过滤回收固定化细胞，所获得的固定化细胞可重新用于醋酸可的松的生物转化。收集粗过滤液5000r/min离心10min，得到滤液和滤饼，加入6倍滤液量的三氯甲烷，萃取三次，萃余相35℃真空旋蒸除去残留三氯甲烷，分析水相中HP-β-CD的剩余量为29.58mmol/L，补加0.42mmol/L HP-β-CD后的含有环糊精的萃余相重新用于醋酸可的松的生物转化。结果表明，环糊精和固定化简单节杆菌细胞循环利用5次后，CA的最终转化率仍在92%以上。

实施例3：

除以下内容外，其他同实施例1。

生物转化中使用的环糊精为50mmol/L羟丙基-β-环糊精，底物为10g/L醋酸可的松。

环糊精和固定化细胞的循环利用工艺：

生物转化的转化液，采用纱布进行粗过滤回收固定化细胞。收集粗过滤液5000r/min离心10min，得到滤液和滤饼，加入3倍滤液量的二氯甲烷，萃取三次，萃余相30℃真空旋蒸除去残留二氯甲烷，分析水相中HP-β-CD的剩余量为29.42mmol/L，补加0.58mmol/LHP-β-CD后的含有环糊精的萃余相和回收的固定化细胞可重新用于醋酸可的松的生物转化。结果表明，环糊精和固定化简单节杆菌细胞循环利用5次后，CA的最终转化率仍在94%以上。

Claims

1.一种醋酸可的松转化中固定化细胞和环糊精循环利用的方法，其特征在于：在以醋酸可的松为底物，环糊精为促溶剂，固定化细胞为催化剂的生物催化反应体系中，反应结束后，将含有环糊精的转化液粗过滤回收固定化细胞，并将粗过滤后的滤液经离心过滤、有机溶剂萃取后，所得的含有环糊精的萃余相除去残留有机溶剂，测定水相中环糊精的剩余量，计算环糊精的补加量，按补加量加入环糊精后的水相和回收的固定化细胞重新用于醋酸可的松的生物催化中；所述的有机溶剂选自乙酸乙酯、三氯甲烷或二氯甲烷；

当有机溶剂为乙酸乙酯时，与滤液的体积比为2：1；

当有机溶剂为三氯甲烷时，与滤液的体积比为6:1；

当有机溶剂为二氯甲烷时，与滤液的体积比为3:1。

2.根据权利要求1所述的醋酸可的松转化中固定化细胞和环糊精循环利用的方法，其特征在于：所述的环糊精为α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、羟乙基-β环糊精、羟丙基-β-环糊精、羟丁基-β-环糊精、磺丁基-β-环糊精、葡萄糖基胺基-β-环糊精、甲基-β-环糊精或羟丙基-γ-环糊精中的一种。

3.根据权利要求1所述的醋酸可的松转化中固定化细胞和环糊精循环利用的方法，其特征在于：所述的转化液粗过滤采用纱布或20-50目的筛网进行过滤。

4.根据权利要求1所述的醋酸可的松转化中固定化细胞和环糊精循环利用的方法，其特征在于：萃取次数为1-7次。

5.根据权利要求1所述的醋酸可的松转化中固定化细胞和环糊精循环利用的方法，其特征在于：所述的除去残留有机溶剂的方法为蒸馏、精馏中的一种或多种。

6.根据权利要求5所述的醋酸可的松转化中固定化细胞和环糊精循环利用的方法，其特征在于：所述的除去残留有机溶剂的方法为减压蒸馏。

7.根据权利要求1所述的醋酸可的松转化中固定化细胞和环糊精循环利用的方法，其特征在于：所述的固定化细胞为固定化简单节杆菌、固定化球形节杆菌。

8.根据权利要求1所述的醋酸可的松转化中固定化细胞和环糊精循环利用的方法，其特征在于：所述环糊精的测定方法为采用参数为4.6mm×250mm,5μm的Phenomenex LunaNH₂ 100 A色谱柱，流动相为乙腈-水＝60:40(v/v)，流速1.0mL/min，RID示差折光检测器,进样量20μL,柱温30℃。