CN104928224A - 一种阿魏酸生产工程菌株、构建方法及生物转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种阿魏酸生产工程菌株、构建方法及生物转化方法，提供的工程菌株整合了新的酶耦联系统，利用强启动子使香兰醇氧化酶基因、松柏醇脱氢酶基因和松柏醛脱氢酶基因在大肠杆菌中共表达，再经过酶促反应催化丁香酚生成阿魏酸。该系统同时耦联木糖还原酶，在生产过程中还原木糖，同时再生氧化型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，维持阿魏酸生物转化系统的辅酶平衡，从而提高产物阿魏酸的转化率和产量。与目前现有技术相比，本发明对医药中间产物阿魏酸的安全生物转化提供了有效、简单的实施方法，转化率达到95％以上，终产物阿魏酸浓度达到11g/L，具有较高的产业化价值。
Description
技术领域
本发明属于医药原料生产技术领域，具体涉及一种能催化丁香酚生成阿魏酸工程菌株、构建方法及生物转化方法。
背景技术
阿魏酸(Ferulic Acid)的化学名称为4-羟基-3-甲氧基肉桂酸，是桂皮酸的衍生物之一。由于阿魏酸可以作为微生物发酵生产香兰素的前体物质，以及其所具有的抗氧化、抗血栓形成、降血脂、调节人体免疫功能等特性，阿魏酸及其衍生物被广泛应用于降血脂、防治冠心病和癌症、抗菌消炎、抗突变、活血通络、消除黄褐斑，以及失眠、腰酸腿沉等的医学治疗，保健品生产和食品添加剂领域。
工业上可以利用香兰醛和丙二酸为原料,通过缩合反应化学合成阿魏酸。但该法反应时间长,且生产的为反式和顺式阿魏酸的混合物，不易分离，同时化学合成法在环境污染方面存在一定问题。
申请号为2008101636038的一种天然阿魏酸的制备方法，公开日为2009年5月20日，公开的阿魏酸的制备主要通过物理化学方法从米糠等天然产物中提取，其过程包括乙醇洗涤、100℃高温氢氧化钠强碱水解、硫酸酸化沉淀等步骤。该传统生产方法的提取工艺复杂，涉及多步高耗能、重污染的环节，产生大量的酸碱废弃物和废水；同时由于米糠中阿魏酸含量较低，最终提取获得的产品得率不足0.2％，以上种种因素极大地限制了阿魏酸应用产业的发展。
在微生物体内，阿魏酸可以通过一系列代谢途径合成。如催化丁香酚的氧化反应逐步代谢合成，经香兰醇氧化酶催化生成松柏醇，松柏醇经松柏醇脱氢酶催化生成松柏醛，松柏醛最终经松柏醛脱氢酶催化获得阿魏酸。(Highly Efficient Biotransformation of Eugenol toFerulic Acid and Further Conversion to Vanillin in Recombinant Strainsof Escherichia coli.Jorg Overhage,Alexander Steinbuchel,and HorstPriefert，Applied and Environmental Microbiology,2003,6569-6576)在上述反应中，松柏醇脱氢酶的酶促反应需要氧化型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)，松柏醛脱氢酶的酶促反应需要氧化型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，因此这两种辅酶在转化过程中不断消耗，同时生成的还原型辅酶反馈抑制酶的催化效率，导致中间产物松柏醇、松柏醛大量积累，产能较低，不具有工业化生产价值。在生产转化过程中添加相应的辅酶，即NADP和NAD可以有效地解决氧化型辅酶不足的问题，大幅度提高阿魏酸生物转化的效率和产量，但由于此类辅酶价格昂贵，稳定性低，投加大量辅酶不具有应用可行性。根据生物催化反应过程的经济性和工业可行性，必须提供高效、低成本的辅酶再生系统，把辅酶从还原态再生为氧化态，从而使辅酶保持在一定的催化剂量水平。
来源于树干毕赤酵母(Scheffersomyces stipitis)的木糖还原酶，可以高效地催化木糖生成木糖醇(Engineering Escherichia coli forXylitol Production From Glucose-Xylose Mixtures.Patrick C.Cirino,Jonathan W.Chin,Lonnie O.Ingram,Biotechnology andBioengineering)。该酶促反应可以同时利用还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)和还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，将二者再生为氧化态辅酶，底物木糖价格低廉、安全无毒，应用于辅酶再生系统中，可以有效地实现辅酶的平衡，大幅度提高氧化还原酶催化反应的效率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效生产阿魏酸的工程菌株，同时表达香兰醇氧化酶、松柏醇脱氢酶、松柏醛脱氢酶和木糖还原酶。
本发明的另一个目的在于提供一种阿魏酸生产工程菌株的构建方法，系统运用酶耦联法同时催化两个平行的酶促氧化还原反应体系，一个酶体系催化底物转化，另一个酶体系催化辅酶循环再生。体系一中的香兰醇氧化酶、松柏醇脱氢酶和松柏醛脱氢酶通过三步氧化反应最终催化合成阿魏酸，同时消耗大量氧化型辅酶NAD和NADP，产生相应还原型辅酶。体系二能够超量表达高活性木糖还原酶，催化木糖生成木糖醇，并将体系一中不断积累的还原型辅酶NADH和NADPH循环再生，以维持整个生物转化系统的辅酶平衡，促进氧化还原酶促反应的可持续进行，大幅度提高产物阿魏酸的转化率和产量。
本发明还有一个目的在于提供一种阿魏酸生产工程菌株的生物转化方法。
本发明提供的一种阿魏酸生产工程菌株，同时表达香兰醇氧化酶、松柏醇脱氢酶、松柏醛脱氢酶和木糖还原酶，其中，香兰醇氧化酶基因、松柏醇脱氢酶基因、松柏醛脱氢酶基因和木糖还原酶基因上游分别整合T7启动子，在工程菌株中通过T7RNA聚合酶启动转录。
本发明提供的一种阿魏酸生产工程菌株的构建方法，包括以下步骤：
(1)、用Nde I和Bam HI分别双酶切合成的香兰醇氧化酶基因(vaoA,1683bp)、松柏醇脱氢酶基因(calA,768bp)、松柏醛脱氢酶基因(calB,1446bp)和木糖还原酶基因(xyl,957bp)，克隆至用Nde I和Bam HI酶切过的pET24a载体上，得重组载体pET24a-vaoA，pET24a-calA、pET24a-calB和pET24a-xyl；
(2)、将重组载体pET24a-vaoA用Bam HI和Eco RI酶切，回收作为载体，pET24a-calA用Bgl II和Eco RI酶切，回收大小为900bp片段，与上述载体连接、转化，得重组载体pET24a-vaoA-calA；
(3)、将重组载体pET24a-vaoA-calA用Bam HI和Eco RI酶切，回收作为载体，pET24a-calB用Bgl II和Eco RI酶切，回收大小为1.6kb片段，与上述载体连接、转化，得重组载体pET24a-vaoA-calA-calB；
(4)、将重组载体pET24a-xyl用Bam HI和HindIII酶切，回收作为载体，pET24a-vaoA-calA-calB用Bgl II和HindIII酶切，回收大小为4.1kb片段，与上述载体连接、转化，得重组载体pET24a-xyl-vaoA-calA-calB(pET24a-XVAB)；
(5)、将重组载体pET24a-XVAB转入BL21(DE3)，得预期工程菌。
摇瓶培养发酵，采用大肠杆菌在下述条件下培养和发酵
1)种子培养基(质量百分比)和培养条件：蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％，余量为纯净水。37℃培养16小时，摇床转数为200rpm。
2)发酵培养基：蛋白胨1.2％，酵母提取物2.4％，甘油0.4％，磷酸二氢钾0.23％，磷酸氢二钾1.25％，余量为纯净水。
3)发酵培养条件：按发酵体积1％量接种，37℃培养，摇床转数为200rpm；接种2小时后，降温至25～28℃加入终浓度0.6mM IPTG，继续培养8小时。
阿魏酸的生物转化
1)发酵培养结束后，4℃下4000rpm离心收集菌体。
2)100mL磷酸缓冲液悬浮菌体，转入250mL转化瓶中，同时添加0.06mL的丁香酚底物和1mL 0.1g/mL木糖。
3)生物转化条件：25℃反应，摇床转数为200rpm，每小时添加0.06mL的丁香酚和1mL 0.1g/mL木糖。。
4)转化结束，通过高效液相色谱(HPLC)检测阿魏酸产量和纯度。
高效液相色谱法检测阿魏酸含量
1)取转化液25μL，加入475μL甲醇充分混匀，溶解产物。
2)样品在4℃低温下10000rpm离心5min，取上清液。
3)上清液通过0.45μm滤头过滤，取滤液待测。
4)高效液相色谱色谱条件：色谱柱为Diamonsil-C18(250mm×4.6mm,5μm)；流动相为68：32的甲醇：0.1％醋酸溶液；流速为0.6mL/min，柱温25℃；检测波长为320nm；进样量5μL。
5)根据阿魏酸标准品的峰面积制作标准曲线，最终计算转化液中阿魏酸的产量。
本发明提供的生物转化过程中，松柏醇脱氢酶的酶促反应需要氧化型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，而松柏醛脱氢酶的酶促反应需要氧化型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，随着生物转化的进行会导致上述两种氧化型辅酶的相对缺乏，以及还原型辅酶的积累，从而降低底物的转化效率。本发明通过在工程菌株中整合酵母的木糖还原酶基因，并通过T7RNA聚合酶启动转录表达，赋予工程菌株催化木糖合成木糖醇的能力，同时可以将发酵液中相应的还原型辅酶转化为氧化型辅酶。在后续工程菌株的发酵和生产转化过程中，首先诱导发酵同时获得大量香兰醇氧化酶、松柏醇脱氢酶、松柏醛脱氢酶和木糖还原酶，再通过收集菌体、重悬浮作为酶液并添加底物丁香酚和木糖进行催化反应，最终转化生成产物阿魏酸。
与目前现有技术相比，本发明对医药中间产物阿魏酸的安全生物转化提供了有效、简单的实施方法，具有较高的产业化价值。利用T7启动子使香兰醇氧化酶、松柏醇脱氢酶、松柏醛脱氢酶和木糖还原酶同时在的大肠杆菌中串联高效表达，催化丁香酚生成阿魏酸。该改良的工程菌株同时高效表达木糖还原酶，在添加木糖底物的条件下，可以调节菌株体内氧化型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的平衡，从而促进生物转化的效率。
本发明构建的菌株，异源表达香兰醇氧化酶、松柏醇脱氢酶、松柏醛脱氢酶和木糖还原酶。转化过程是把丁香酚和木糖底物流加进细胞悬液中，生产条件利用的是生物催化剂，生产过程无高温高压反应，无有毒化学品，常温常压操作。通过转化过程不断流加丁香酚和木糖，阿魏酸积累浓度增加。反应结束后，底物转化率高，副产物少，纯化简单易行，生产效率高。
本发明采用生物酶法转化丁香酚生产阿魏酸，转化率达到95％以上，终产物阿魏酸浓度达到11g/L，有工业化潜力。
附图说明
图1为重组质粒pET24a-XVAB的图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。实施例中的实验方法，按常规条件进行，参考如萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南(第三版，2008年，科学出版社)中所述实验方法。
实施例1
一种阿魏酸生产工程菌株的构建方法，包括以下步骤：
1.含重组质粒pET24a-vaoA的菌株构建
1)质粒构建
质粒pET24a(+)：Novagen公司产品，大小为5.31kb，含有卡那霉素抗性基因，乳糖抑制子lac I基因，启动子是T7，并具有多个限制性内切酶位点。
用Nde I和Bam HI双酶切合成的香兰醇氧化酶基因(vaoA,1683bp)DNA片段。用Nde I和Bam HI双酶切载体pET24a(+)。酶切体系：DNA 43μL，buffer R 5μL，Bam HI 1μL，Nde I 1μL，37℃保温3小时。
酶切的DNA片段胶回收，用T4连接酶连接vaoA和载体DNA片段，连接体系如下：vaoA 7.5μL，pET24a载体1.5μL，buffer 1μL，T4连接酶1μL，保温16℃过夜，连接产物采用热激法转化至大肠杆菌宿主菌DH5α中。涂布到含有1％蛋白胨，0.5％酵母膏，1％氯化钠,1.5％琼脂粉及卡那霉素的LB固体培养基上。
2)重组菌株鉴定
LB平板在37℃培养至生长出转化子，挑取单菌落，用LB液体培养基37℃培养过夜，12000rpm离心1分钟，提取质粒，提取方法按照试剂盒说明书操作。
用Nde I和Bam HI双酶切重组载体，酶切体系：DNA 43μL，bufferR 5μL，Bam HI 1μL，Nde I 1μL，37℃保温3小时。电泳确定含有目的vaoA基因的DNA片段。
2.参照方法1分别构建pET24a-calA、pET24a-calB和pET24a-xyl重组载体
3.构建pET24a-xyl-vaoA-calA-calB(pET24a-XVAB)重组载体
1)构建pET24a-vaoA-calA重组载体
将重组载体pET24a-vaoA用Bam HI和Eco RI酶切，酶切体系：DNA 43μL，buffer R 5μL，Bam HI 1μL，Eco RI 1μL，37℃保温3小时，DNA片段回收作为载体。
pET24a-calA用Bgl II和Eco RI酶切，酶切体系：DNA 43μL，buffer R 5μL，Bgl II 1μL，Eco RI 1μL，37℃保温3小时，回收大小为900bp左右片段。参照方法1与上述载体连接、转化，得重组载体pET24a-vaoA-calA。
2)构建pET24a-vaoA-calA-calB重组载体
将重组载体pET24a-vaoA-calA用Bam HI和Eco RI酶切，酶切体系：DNA 43μL，buffer R 5μL，Bam HI 1μL，Eco RI 1μL，37℃保温3小时，回收作为载体。
pET24a-calB用Bgl II和Eco RI酶切，酶切体系：DNA 43μL，bufferR 5μL，Bgl II 1μL，Eco RI 1μL，37℃保温3小时，回收大小为1.6kb左右片段，参照方法1与上述载体连接、转化，得重组载体pET24a-vaoA-calA-calB。
3)构建pET24a-xyl-vaoA-calA-calB重组载体
将重组载体pET24a-xyl用Bam HI和HindIII酶切，酶切体系：DNA43μL，buffer R 5μL，Bam HI 1μL，HindIII 1μL，37℃保温3小时，回收作为载体。
pET24a-vaoA-calA-calB用Bgl II和HindIII酶切，酶切体系：DNA43μL，buffer R 5μL，Bgl II 1μL，HindIII 1μL，37℃保温3小时，回收大小为4.1kb左右片段，参照方法1与上述载体连接、转化，得重组载体pET24a-xyl-vaoA-calA-calB(见附图1)。
4.构建含pET24a-xyl-vaoA-calA-calB重组载体的生产菌株
采用热激法将重组载体转化至大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)中。涂布到含有1％蛋白胨，0.5％酵母膏，1％氯化钠及1.5％琼脂粉的LB固体培养基上。LB平板在37℃培养至生长出转化子，挑取单菌落，获得预期工程菌。
重组菌株的发酵：
配种子液100mL，种子液含有蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％，余量为纯净水。装在250mL三角瓶中灭菌后，接种平板培养基上的单菌落，摇床转数为200rpm。37℃培养16小时后，接种入含有200mL发酵液的500mL三角瓶中，发酵液含有蛋白胨1.2％，酵母提取物2.4％，甘油0.4％，磷酸二氢钾0.23％，磷酸氢二钾1.25％，余量为纯净水。发酵培养条件：按发酵体积1％量接种，37℃培养，摇床转数为200rpm，接种后1.5小时后，降温至25～28℃，加入终浓度0.6mM IPTG，培养8小时。
催化丁香酚生成阿魏酸：
发酵培养结束后，4000rpm 4℃低温离心收集菌体，用100mL磷酸缓冲液悬浮菌体，转入250mL转化瓶中，加入0.06mL丁香酚和1mL 0.1g/mL木糖，转化条件为25℃反应，摇床转数为200rpm，每小时分批添加0.06mL的丁香酚底物和1mL 0.1g/mL木糖。8-10小时后，通过高效液相色谱(HPLC)检测阿魏酸产量以及丁香酚是否转化完全。
高效液相色谱法检测阿魏酸含量：
样品处理：取转化液25μL，加入475μL甲醇充分混匀，10000rpm离心5min，0.45μm滤头过滤，取滤液转入进样瓶待测。
色谱条件：色谱柱为Diamonsil-C18(250mm×4.6mm,5μm)；流动相：B甲醇：A0.1％醋酸溶液为68：32；流速为0.6mL/min，柱温25℃；检测波长为320nm；进样量5μL。
SEQUENCE LISTING
<110> 安徽师范大学
<120> 一种阿魏酸生产工程菌株、构建方法及生物转化方法
<130> 1
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<213> calB
<400> 3
atgtctatcc tgggtctgaa cggtgctcca gttggcgctg aacagctggg ttctgctctg 60
gatcgcatga aaaaagctca cctggaacag ggtccggcta acctggaact gcgtctgtct 120
cgtctggacc gtgctatcgc tatgctgctg gaaaaccgtg aagctatcgc tgacgctgtt 180
tctgctgact tcggtaaccg ttctcgcgag cagaccctgc tgtgcgacat cgctggttct 240
gttgcttctc tgaaagactc tcgtgaacac gttgctaaat ggatggaacc ggaacaccac 300
aaagctatgt tcccgggtgc tgaagctcgt gttgaatttc agccgctggg tgttgttggt 360
gttatctctc cgtggaactt cccgatcgtt ctggctttcg gtccgctggc tggtatcttc 420
gctgctggta accgtgctat gctgaaaccg tctgaactga ccccgcgtac ctctgctctg 480
ctggctgaac tgatcgctcg ttacttcgac gaaaccgaac tgaccaccgt tctgggtgac 540
gctgaagttg gtgctctgtt ctctgctcag ccgttcgacc acctgatctt caccggtggt 600
accgctgttg ctaaacacat catgcgtgct gctgctgaca acctggttcc ggttaccctg 660
gaactgggtg gtaaatctcc ggttatcgtt tctcgttccg cagacatggc tgacgttgct 720
cagcgtgttc tgaccgttaa aaccttcaac gctggtcaga tttgcctggc tccggactac 780
gttctgctgc cggaagaatc tctggactct ttcgtagctg aagctacccg tttcgttgct 840
gctatgtacc cgtctctgct ggacaacccg gactacacct ctatcatcaa cgctcgtaac 900
ttcgaccgtc tgcaccgtta cctgaccgac gctcaggcta aaggtggtcg tgttatcgaa 960
atcaacccgg ctgctgaaga actgggtgac tctggtatcc gtaaaatcgc tccgaccctg 1020
atcgttaacg tttctgacga aatgctggtt ctgaacgaag aaatcttcgg tccgctgctg 1080
ccgatcaaaa cctaccgtga cttcgactct gctatcgact acgttaactc taaacagcgt 1140
ccgctggctt cttacttctt cggtgaagac gctgttgaac gtgaacaggt tctgaaacgt 1200
accgtttctg gtgctgttgt tgttaacgac gttatgtctc acgttatgat ggacaccctg 1260
ccgttcggtg gtgttggtca ctctggtatg ggtgcttacc acggtatcta cggtttccgt 1320
accttctctc acgctaaacc ggttctggtt cagtctccgg ttggtgaatc taacctggct 1380
atgcgtgctc cgtacggtga agctatccac ggcctgctgt ccgttctgct gtctaccgaa 1440
tgctaa 1446
<210> 4
<211> 957
<212> DNA
<213> xyl
<400> 4
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aaagtcgacg tcgacacctg ttctgaacag atctaccgtg ctatcaagac cggttacaga 120
ttgttcgacg gtgccgaaga ttacgccaac gaaaagttag ttggtgccgg tgtcaagaag 180
gccattgacg aaggtatcgt caagcgtgaa gacttgttcc ttacctccaa gttgtggaac 240
aactaccacc acccagacaa cgtcgaaaag gccttgaaca gaaccctttc tgacttgcaa 300
gttgactacg ttgacttgtt cttgatccac ttcccagtca ccttcaagtt cgttccatta 360
gaagaaaagt acccaccagg attctactgt ggtaagggtg acaacttcga ctacgaagat 420
gttccaattt tagagacctg gaaggctctt gaaaagttgg tcaaggccgg taagatcaga 480
tctatcggtg tttctaactt cccaggtgct ttgctcttgg acttgttgag aggtgctacc 540
atcaagccat ctgtcttgca agttgaacac cacccatact tgcaacaacc aagattgatc 600
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aaggacgtca acagcttcga cttggacgaa caagatttcg ctgacattgc caagttggac 900
atcaacttga gattcaacga cccatgggac tgggacaaga ttcctatctt cgtctaa 957
Claims (10)
1.一种阿魏酸生产工程菌株，其特征在于，所述阿魏酸生产工程菌株同时表达香兰醇氧化酶、松柏醇脱氢酶、松柏醛脱氢酶和木糖还原酶，其中，香兰醇氧化酶基因、松柏醇脱氢酶基因、松柏醛脱氢酶基因和木糖还原酶基因上游分别整合T7启动子，在工程菌株中通过T7RNA聚合酶启动转录。
2.一种权利要求1所述的阿魏酸生产工程菌株的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：
(1)、用Nde I和Bam HI分别双酶切合成的香兰醇氧化酶基因(vaoA,1683bp)、松柏醇脱氢酶基因(calA,768bp)、松柏醛脱氢酶基因(calB,1446bp)和木糖还原酶基因(xyl,957bp)，克隆至用Nde I和Bam HI酶切过的pET24a载体上，得重组载体pET24a-vaoA，pET24a-calA、pET24a-calB和pET24a-xyl；
(2)、将重组载体pET24a-vaoA用Bam HI和Eco RI酶切，回收作为载体，pET24a-calA用Bgl II和Eco RI酶切，回收大小为900bp片段，与上述载体连接、转化，得重组载体pET24a-vaoA-calA；
(3)、将重组载体pET24a-vaoA-calA用Bam HI和Eco RI酶切，回收作为载体，pET24a-calB用Bgl II和Eco RI酶切，回收大小为1.6kb片段，与上述载体连接、转化，得重组载体pET24a-vaoA-calA-calB；
(4)、将重组载体pET24a-xyl用Bam HI和HindIII酶切，回收作为载体，pET24a-vaoA-calA-calB用Bgl II和HindIII酶切，回收大小为4.1kb片段，与上述载体连接、转化，得重组载体pET24a-xyl-vaoA-calA-calB(pET24a-XVAB)；
(5)、将重组载体pET24a-XVAB转入BL21(DE3)，得预期工程菌。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)进一步包括以下步骤：用Nde I和Bam HI双酶切合成的香兰醇氧化酶基因(vaoA,1683bp)DNA片段；用Nde I和Bam HI双酶切载体pET24a(+)，酶切体系：DNA 43μL，buffer R 5μL，Bam HI 1μL，Nde I 1μL，37℃保温3小时；酶切的DNA片段胶回收，用T4连接酶连接vaoA和载体DNA片段，连接体系如下：vaoA 7.5μL，pET24a载体1.5μL，buffer 1μL，T4连接酶1μL，保温16℃过夜，连接产物采用热激法转化至大肠杆菌宿主菌DH5α中，涂布到含有1％蛋白胨，0.5％酵母膏，1％氯化钠及1.5％琼脂粉及卡那霉素的LB固体培养基上；
LB平板在37℃培养至生长出转化子，挑取单菌落，用LB液体培养基37℃培养过夜，12000rpm离心1分钟，提取质粒，提取方法按照试剂盒说明书操作；
用Nde I和Bam HI双酶切重组载体，酶切体系：DNA 43μL，bufferR 5μL，Bam HI 1μL，Nde I 1μL，37℃保温3小时，电泳确定含有目的vaoA基因的DNA片段。
4.根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)进一步包括以下步骤：将重组载体pET24a-vaoA用Bam HI和Eco RI酶切，酶切体系：DNA 43μL，buffer R 5μL，Bam HI 1μL，Eco RI 1μL，37℃保温3小时，DNA片段回收作为载体；
pET24a-calA用Bgl II和Eco RI酶切，酶切体系：DNA 43μL，buffer R 5μL，Bgl II 1μL，Eco RI 1μL，37℃保温3小时，回收大小为900bp片段。
5.根据权利要求2-4任一项所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)进一步包括如下步骤：将重组载体pET24a-vaoA-calA用Bam HI和Eco RI酶切，酶切体系：DNA 43μL，buffer R 5μL，Bam HI 1μL，Eco RI 1μL，37℃保温3小时，回收作为载体；
pET24a-calB用Bgl II和Eco RI酶切，酶切体系：DNA 43μL，bufferR 5μL，Bgl II 1μL，Eco RI 1μL，37℃保温3小时，回收大小为1.6kb片段。
6.根据权利要求2-5任一项所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)进一步包括如下步骤：将重组载体pET24a-xyl用Bam HI和HindIII酶切，酶切体系：DNA 43μL，buffer R 5μL，Bam HI 1μL，HindIII 1μL，37℃保温3小时，回收作为载体；
pET24a-vaoA-calA-calB用Bgl II和HindIII酶切，酶切体系：DNA43μL，buffer R 5μL，Bgl II 1μL，HindIII 1μL，37℃保温3小时，回收大小为4.1kb片段。
7.根据权利要求2-6任一项所述的构建方法，其特征在于，步骤(5)进一步包括如下步骤：采用热激法将重组载体转化至大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)中，涂布到含有1％蛋白胨，0.5％酵母膏，1％氯化钠,1.5％琼脂粉及卡那霉素的LB固体培养基上，LB平板在37℃培养至生长出转化子，挑取单菌落，获得预期工程菌。
8.一种权利要求1所述的阿魏酸生产工程菌株的生物转化方法，其特征在于，所述生物转化方法包括以下步骤：
(1)、重组菌株的发酵；
(2)、催化丁香酚生成阿魏酸。
9.根据权利要求8所述的阿魏酸生产工程菌株的生物转化方法，其特征在于，步骤(1)进一步包括以下步骤：配种子液100mL，种子液含有蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％，余量为纯净水，装在250mL三角瓶中灭菌后，接种平板培养基上的单菌落，摇床转数为200rpm；37℃培养16小时后，接种入含有200mL发酵液的500mL三角瓶中，发酵液含有蛋白胨1.2％，酵母提取物2.4％，甘油0.4％，磷酸二氢钾0.23％，磷酸氢二钾1.25％，余量为纯净水；发酵培养条件：按发酵体积1％量接种，37℃培养，摇床转数为200rpm，接种后1.5小时后，降温至25～28℃，加入终浓度0.6mM IPTG，培养8小时。
10.根据权利要求8或9所述的阿魏酸生产工程菌株的生物转化方法，其特征在于,步骤(2)进一步包括以下步骤：发酵培养结束后，4000rpm 4℃低温离心收集菌体，用100mL磷酸缓冲液悬浮菌体，转入250mL转化瓶中，加入0.06mL丁香酚和1mL 0.1g/mL木糖，转化条件为25℃反应，摇床转数为200rpm，每小时分批添加0.06mL的丁香酚底物和1mL 0.1g/mL木糖；8-10小时后，通过高效液相色谱(HPLC)检测阿魏酸产量以及丁香酚是否转化完全。
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