CN101368168A - 羰基还原酶和嘧啶核苷酸转氢酶偶联制备(s)-苯基乙二醇的方法 - Google Patents
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Abstract
羰基还原酶和嘧啶核苷酸转氢酶偶联制备(S)－苯基乙二醇的方法，属于生物催化不对称转化技术领域。本发明将(R)－羰基还原酶和(S)－羰基还原酶和嘧啶核苷酸转氢酶A、B分别构建到两个共表达载体上，将构建的重组质粒pETDuet－rcr－scr和pACYCDuet－pnta－pntb共转化入大肠杆菌，获得重组菌株E.coli BL21(pETDuet－rcr－scr/pACYCDuet－pnta－pntb)，保藏编号CCTCC NO：M208126。该重组菌株不仅实现了从底物(R)－苯基乙二醇到产物(S)－苯基乙二醇的一步法转化，另一方面解除了转化反应中辅酶再生循环的限制；为高底物浓度下酶的催化反应与原位辅酶再生来生产手性醇提供了有效途径。
Description
技术领域
利用(R)、(S)-羰基还原酶和嘧啶核苷酸转氢酶A、B四个酶共表达的偶联体系制备(S)-苯基乙二醇的方法，本发明涉及利用基因工程技术将(R)、(S)-羰基还原酶基因和A、B嘧啶核苷酸转氢酶基因分别构建在两种兼容的共表达载体上，通过共转化技术将四个基因同时转入到大肠杆菌细胞中，利用构建的重组菌株高效制备(S)-苯基乙二醇的方法及其应用，属于生物催化不对称转化技术领域。
背景技术
光学纯(S)-苯基乙二醇是液晶材料中不可缺少的重要手性添加剂，也是制备具有光学活性的医药、农药和功能材料的重要中间体。氧化还原酶催化的不对称还原反应常用于手性化合物的制备，这类反应需要辅酶作为氢或电子的传递体，常用辅酶有尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+，NADH)和尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+，NADPH)。辅酶一般不太稳定，价格昂贵。氧化还原酶催化的不对称还原反应中，辅酶不能循环使用是限制其工业化应用的“瓶颈”因素。
博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶常用于酶的不对称催化还原反应原位辅酶再生，Degussa公司利用该辅酶再生的原理催化三甲基丙酮酸不对称还原合成L-叔亮氨酸，大大提高了产物的转化率。将嘧啶核苷酸转氢酶、醇脱氢酶和甲酸脱氢酶共表达来生产(R)-苯乙醇或利用甲酸脱氢酶的偶合入(S)-型乙醇脱氢酶和双水相技术不仅提高了生物反应中底物酮的浓度，而且大大提高了生物转化的效率。ω-转氨酶、醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶组成的耦联体系用于转化生产(R)-苯乙醇。这些生物技术手段都较好地促进了生物转化。
本实验室已经利用重组菌株催化不对称转化制备(S)-苯基乙二醇，在此基础上，采用基因工程技术实现多种酶系的偶联，即将来源于大肠杆菌的嘧啶核苷酸转氢酶A(PNTA)和B亚基(PNTB)耦合入近平滑假丝酵母的(R)-羰基还原酶(RCR)和(S)-羰基还原酶(SCR)中，构建一个共表达酶偶联体系，体系的催化原理如图1所示。
以高浓度的(R)-苯基乙二醇为底物，利用该多酶偶联的重组菌进行生物转化反应，实现了一步法高效制备(S)-苯基乙二醇的转化过程。
发明内容
(1)要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种基因工程方法构建多酶偶联体系，实现了多种酶功能的成功整合。利用酶偶联后的重组菌株(菌种保藏号：CCTCC M 208126)不对称转化制备(S)-苯基乙二醇的方法。本发明根据多种酶的特殊功能，利用基因工程技术实现多酶偶联，以酶偶联重组菌为催化剂，一步法实现了从(R)-苯基乙二醇到(S)-苯基乙二醇的手性转化。当底物(R)-苯基乙二醇为6mmol/L时，产物(S)-苯基乙二醇光学纯度为93.3％，产率达82.6％。该发明为成功整合多种氧化还原酶的生物功能，简化手性醇制备的途径提供了一条崭新的思路。
(2)技术方案：
1、一株四个酶偶联的不对称转化制备(S)-苯基乙二醇的重组菌，其分类命名为大肠杆菌BL21/(pETDuet-rcr-scr/pACYCDuet-pnta-pntb)Escherichia coliBL21(pETDuet-rcr-scr/pACYCDuet-pnta-pntb)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 208126。
2、所述重组菌CCTCC NO：M 208126的构建方法，将基因rcr和scr有序插入载体pETDuetTM-1，构建重组质粒pETDuet-rcr-scr；将基因pnta和pntb有序插入载体pACYCDuetTM-1，构建重组质粒pACYCDuet-pnta-pntb；将质粒pETDuet-rcr-scr和pACYCDuet-pnta-pntb共转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，通过含有100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB平板筛选，获得目的重组菌株E.coli BL21(pETDuet-rcr-scr/pACYCDuet-pnta-pntb)；
(1)近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)CCTCC M203011基因组和大肠杆菌(E.coli DH5 α)基因组的获取
近平滑假丝酵母的培养基组成以g/L计：葡萄糖40，酵母膏5，(NH4)2HPO413，KH2PO4 7，ZnSO4·7H2O 0.3，NaCl 0.1，pH 7.0；将近平滑假丝酵母菌种接种于培养基装液量为20％的250mL摇瓶中于30℃、150rpm振荡培养48h；
大肠杆菌的培养基组成以g/L计：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH 7.0；将大肠杆菌菌种接种于培养基装液量为20％的250mL摇瓶中于37℃、200rpm振荡培养12h；
上述两种菌体培养结束后，分别将菌体于6,000rpm离心20min，用生理盐水洗涤两次后收集细胞，利用VIOGENE公司的基因组DNA提取试剂盒GenomicDNA Extraction Miniprep System提取基因组，分别获得目标基因组；
(2)基因rcr的获得：以近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)CCTCC M203011基因组作为PCR反应模板，利用含有NdeI限制性酶切位点的引物RCR_F，含有XhoI限制性酶切位点的引物RCR_R，通过PCR扩增反应，获得rcr基因，其全长为1008bp；
RCR_F：5’-ATCGATCGCATATGTCAATTCCATCAAGCCAGTAC-3’，
RCR_R：5’-TGACTCTCGAGTGGATTAAAAACAACTCTACCTTC-3’，
PCR反应体系：ddH2O 37μL，10×Reaction Buffer 5μL，25mmol/L的dNTP0.5μL，50pmol/μL的引物RCR_F和RCR_R各1μL，近平滑假丝酵母基因组5μL，5U/μL的Taq DNA polymerase 0.5μL；PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃ 1min，57℃ 1min，72℃ 1min，进行30个循环；72℃延伸10min；获得rcr基因；利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit(上海申能博彩生物科技有限公司)纯化DNA。
(3)基因scr的获得：以近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)CCTCC M203011基因组作为PCR反应模板，利用含有EcoRI限制性酶切位点的引物SCR_F，含有NotI限制性酶切位点的引物SCR_R，通过PCR扩增反应，获得scr基因，其全长为837bp；
SCR_F：5’-ATCGAATTCGATGGGCGAAATCGAATCTTATTG-3’，
SCR_R：5’-TGACTGCGGCCGCCTATGGACACGTGTATCCACCGTC-3’，
PCR反应体系：ddH2O 37μL，10×Reaction Buffer 5μL，25mmol/L的dNTP0.5μL，50pmol/μL的引物SCR_F和SCR_R各1μL，近平滑假丝酵母基因组5μL，5U/μL的Taq DNA polymerase 0.5μL；PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，进行30个循环；72℃延伸10min；获得scr基因；利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit(上海申能博彩生物科技有限公司)纯化DNA。
(4)基因pntb的获得：以大肠杆菌(E.coli DH5 α)基因组作为PCR反应模板，利用含有EcoRV限制性酶切位点的引物PNTB_F，含有XhoI限制性酶切位点的引物PNTB_R，通过PCR扩增反应，获得pntb基因，其全长为1530bp；
PNTB_F：5’-CGCGATATCATGTCT GGAGGATTAGTTAC-3’，
PNTB_R：5’-CCCCTCGAGTTACAGAGCT TTCAGGATTG-3’，
PCR反应体系：ddH2O 37μL，10×Reaction Buffer 5μL，25mmol/L的dNTP0.5μL，50pmol/μL的引物PNTB_F和PNTB_R各1μL，大肠杆菌基因组5μL，5U/μL的Taq DNA polymerase 0.5μL；PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃1min，58℃ 1min，72℃ 1min，进行30个循环；72℃延伸10min；获得pntb基因；利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit(上海申能博彩生物科技有限公司)纯化DNA。
(5)基因pnta的获得：以大肠杆菌(E.coli DH5 α)基因组作为PCR反应模板，利用含有BamHI限制性酶切位点的引物PNTA_F，含有Hind III限制性酶切位点的引物PNTA_R，通过PCR扩增反应，获得pntb基因，其全长为1386bp；
PNTA_F：5’—CGCGGATCCATGCGAATTGGCATACCAAG—3’，
PNTA_R：5’—CCCAAGCTTTTAATTTTTGCGGAACATTTTC—3’；
PCR反应体系：ddH2O 37μL，10×Reaction Buffer 5μL，25mmol/L的dNTP0.5μL，50pmol/μL的引物PNTA_F和PNTA_R各1μL，大肠杆菌基因组5μL，5U/μL的Taq DNA polymerase 0.5μL；PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃1min，55℃ 1min，72℃ 1min，进行30个循环；72℃延伸10min；获得pnta基因；利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit(上海申能博彩生物科技有限公司)纯化DNA。
(6)重组质粒pETDuet-rcr-scr的构建：
先利用限制性内切酶NdeI和XhoI对基因rcr和载体pETDuetTM-1分别进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接，获得带有基因rcr的重组质粒pETDuet-rcr；再利用限制性内切酶EcoRI和NotI对基因scr和载体pETDuet-rcr分别进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接，获得带有两个目的基因rcr和scr的重组质粒pETDuet-rcr-scr；
(7)重组质粒pACYCDuet-pnta-pntb的构建：
先利用限制性内切酶EcoRV和XhoI对基因pntb和载体pACYCDuetTM-1分别进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接，获得带有基因pntb的重组质粒pACYCDuet-pntb；再利用限制性内切酶BamHI和HindIII对目的基因pnta和载体pACYCDuet-pntb分别进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接，获得带有两个目的基因pnta和pntb的重组质粒pACYCDuet-pnta-pntb；
(8)重组质粒共转化大肠杆菌
取重组质粒pETDuet-rcr-scr和pACYCDuet-pnta-pntb各2μL，共转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)惑受态细胞，转化液涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，获得阳性克隆E.coliBL21(pETDuet-rcr-scr/pACYCDuet-pnta-pntb)；
3、重组菌E.coli BL21(pETDuet-rcr-scr/pACYCDuet-pnta-pntb)的培养
采用LB培养基以g/L计：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH 7.0；固体培养基添加培养基重量1.5％的琼脂粉；
挑取阳性克隆单菌落接种于3mL含100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，于37℃200rpm振荡培养过夜；取1mL培养液转接于50mL含100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，于37℃200rpm振荡培养至OD600约为0.6；加入诱导物异丙基-B-D-硫代半乳糖苷1mmol/L，30℃下诱导培养重组菌E.coli BL21(pETDuet-rcr-scr/pACYCDuet-pnta-pntb)10h。
4、利用培养后的酶偶联重组菌CCTCC NO：M 208126不对称转化制备(S)-苯基乙二醇的方法，用生理盐水洗涤重组菌细胞两次，10,000rpm，10min离心收集菌体细胞，以细胞为催化剂，以(R)-苯基乙二醇为底物，进行不对称转化反应：在1mL 0.1mol/L pH 5.0～6.0的醋酸缓冲液，或1mL 0.1mol/L pH 6.5～7.0的磷酸缓冲液，或1mL 0.1mol/L pH 7.5～8.0的Tris-HCl缓冲液中，(R)-苯基乙二醇底物浓度为105mmol/L，5mmol/L硫酸锌，重组菌细胞浓度为0.1g/mL，30℃下反应48h。
反应结束后，将反应混合物离心除去菌体，上清液加入2倍体积乙酸乙酯萃取，有机相用于分析。产物通过手性固定相高效液相色谱(Agillent HP1100)进行分析，条件为Chiralcel OB-H柱(4.6mm×25cm；Daicel Chemical Ind.，Ltd.，Japan)，流动相为正己烷/异丙醇(9/1，V/V)，流速0.5mL/min，检测波长为215nm。产物的光学纯度通过对映过量值来衡量。
产物(S)-苯基乙二醇对映过量值的计算：对映过量值(e.e.％)＝[(CS-CR)/(CR+CS)]×100％
产物(S)-苯基乙二醇产率的计算：产率(％)＝CS/C0×100％
式中CR为反应后(R)-对映体的浓度，CS为反应后(S)-对映体的浓度，C0为反应前底物(R)-苯基乙二醇的浓度。
以全细胞为催化剂，不对称生物转化反应后，产物均为(S)-苯基乙二醇。
(3)有益效果
通过将(R)、(S)-专一性羰基还原酶(编码基因的GenBank登记号DQ675534和DQ295067)和嘧啶核苷酸转氢酶A、B(编码基因的GenBank登记号EG10744和EG10745)四个酶的编码基因共表达，实现了这四个酶的偶联，利用成功构建的重组菌E.coli BL21(pETDuet-rcr-scr/pCACYDuet-pnta-pntb)进行生物转化(R)-苯基乙二醇获得(S)-苯基乙二醇。通过优化反应条件，在pH7.0的醋酸缓冲液中加入5mmol/L硫酸锌，利用0.1g/mL重组细胞对105mmol/L底物(R)-苯基乙二醇催化转化48h，最终产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为93.3％e.e.，产率为82.6％。这些工作不仅为一步法从(R)-苯基乙二醇到(S)-苯基乙二醇的转化提供了有效途径，为辅酶再生循环途径耦合入(S)-苯基乙二醇的生物转化途径提供了新的研究思路，对于简化手性转化途径具有重要的意义。
附图说明
图1体系的催化原理图。
生物材料样品保藏
大肠杆菌Escherichia coli BL21(pETDuet-rcr-scr/pACYCDuet-pnta-pntb)，保藏日期：2008年9月3日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 208126。
具体实施方式
实施例1 近平滑假丝酵母和大肠杆菌的培养：
近平滑假丝酵母培养基组成：葡萄糖4％，酵母膏0.5％，(NH4)2HPO4 1.3％，KH2PO4 0.7％，ZnSO4.7H2O 0.03％，NaCl 0.01％，pH7.0。将菌种接种于50mL培养基的250mL摇瓶中，30℃、150rpm振荡培养48h。
大肠杆菌LB培养基组成：蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，pH 7.0。培养时加入氨苄青霉素(100μg/mL)和氯霉素(34μg/mL)。固体培养基添加1.5％琼脂粉。将菌种接种于50mL LB液体培养基的250mL摇瓶中，于37℃，200rpm振荡培养约12h。
实施例2 近平滑假丝酵母基因组和大肠杆菌基因组的获得：
菌体培养结束后，将菌体于6,000rpm离心20min，用生理盐水洗涤两次后收集细胞，利用基因组DNA提取试剂盒Genomic DNA Extraction MiniprepSystem(VIOGENE公司)提取基因组。
实施例3 rcr基因的获得：
利用含有NdeI限制性酶切位点的引物RCR_F和含有XhoI限制性酶切位点的引物RCR_R，
RCR_F：5’-ATCGATCGCATATGTCAATTCCAT CAAGCCAGTAC-3’(NdeI)，RCR_R：5’-TGACTCTCGAGTGGATTAAAAACAA CTCTACCTTC-3’(XhoI)；
PCR反应体系：ddH2O 37μL，10×Reaction Buffer 5μL，25mmol/L dNTP 0.5μL，50pmol/μL的引物RCR_F和RCR_R各1μL，近平滑假丝酵母基因组5μL，5U/μL Taq DNA polymerase 0.5μL；PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃ 1min，57℃ 1min，72℃ 1min，进行30个循环；72℃延伸10min；PCR反应获得rcr基因片段。
实施例4 scr基因的获得：
利用含有限制性酶切位点EcoRI的引物SCR_F和含有NotI限制性酶切位点的引物SCR_R，
SCR_F：5’-ATCGAATTCGATGGGCGAAATCGAATCTTATTG-3’(EcoRI)，SCR_R：5’-TGACTGCGGCCGCCTATGGACACGTGTATCCACCGTC-3’(NotI)，
PCR反应体系：ddH2O 37μL，10×Reaction Buffer 5μL，25mmol/L dNTP 0.5μL，50pmol/μL的引物SCR_F和SCR_R各1μL，近平滑假丝酵母基因组5μL，5U/μL Taq DNApolymerase 0.5μL；PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，进行30个循环；72℃延伸10min，PCR反应获得scr基因片段。
实施例5 pntb基因的获得：
利用含有EcoR V限制性酶切位点的引物PNTB_F，含有XhoI限制性酶切位点的引物PNTB_R，
PNTB_F：5’-CGCGATATCATGTCTGGAGGATTAGTTAC-3，(EcoR V)，
PNTB_R：5’-CCCCTCGAGTTACAGAGCTTTCAGGATTG-3’(XhoI)。
PCR反应体系：ddH2O 37μL，10×Reaction Buffer 5μL，25mmol/L dNTP0.5μL，50pmol/μL的引物PNTB_F和PNTB_R各1μL，大肠杆菌基因组5μL，5U/μL Taq DNA polymerase 0.5μL；PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 1min，进行30个循环；72℃延伸10min；PCR反应获得pntb基因片段。
实施例6 pnta基因的获得：
利用含有BamH I限制性酶切位点的引物PNTA_F，含有Hind III限制性酶切位点的引物PNTA_R，
PNTA_F：5’—CGCGGATCCATGCGA ATTGGCATACCAAG—3’(BamH I)PNTA_R：5’—CCCAAGCTTTTAA TTTTTGCGGAACATTTT C—3’(Hind III)，
PCR反应体系：ddH2O 37μL，10×Reaction Buffer 5μL，25mmol/L dNTP 0.5μL，50pmol/μL的引物PNTA_F和PNTA_R各1μL，大肠杆菌基因组5μL，5U/μLTaq DNA polymerase 0.5μL；PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，进行30个循环；72℃延伸10min，PCR反应获得pnta基因片段。
实施例7 重组质粒pETDuet-rcr-scr的获得：
利用限制性内切酶Nde I和XhoI对基因rcr和pETDuetTM-1(pETDuetTM-1质粒来源于Novagen公司)分别进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接，获得带有基因rcr的重组质粒pETDuet-rcr。利用限制性内切酶EcoRI和NotI对基因scr和pETDuet-rcr分别进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接，获得带有两个目的基因rcr和scr的重组质粒pETDuet-rcr-scr。
基因rcr及质粒pETDuetTM-1的酶切
利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(北京博大泰克生物基因技术有限公司)提取质粒pETDuetTM-1。
分别按照水、缓冲液、基因rcr和酶的顺序，及水、缓冲液、质粒pETDuetTM-1和酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机离心2s使液体集中于管底，37℃水浴3h，在管中加入1/10的Loading Buffer或将管置于65℃保温10min，终止酶切反应。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，回收和浓缩目的片段。
反应体系组成：10×Buffer H 4μL，基因rcr或质粒pETDuetTM-1 10μL，Nde I 2μL，XhoI 2μL，ddH2O将体系补足40μL。
基因rcr与质粒pETDuetTM-1的连接
连接反应体系组成：质粒pETDuetTM-1 0.8μL，基因rcr 4.2μL，LigationSolution 5μL。混合连接液，将其置于16℃培养箱中连接12-16h。
重组质粒转化大肠杆菌
在每管的100μL E.coli Top10(DE3)感受态细胞悬液中加入10μL连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置30min。转入42℃水浴中，热击90s。快速转移至冰浴中，冷却2min。每管中加入700μL LB液体培养基，37℃ 100rpm摇床温育培养1h。培养后菌液3,000rpm离心2min，弃上清600μL，剩余菌液混匀后涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜。
LB培养基：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，pH 7.0。需要时使用前加入氨苄青霉素(100μg/mL)，固体培养基添加1.5％琼脂粉。
挑取4个克隆，转接入装有3mL的含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养12h，利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(北京博大泰克生物基因技术有限公司)从培养的菌液中提取质粒。用以下反应体系进行酶切验证：10×Buffer H 2μL，质粒DNA 5μL，Nde I 0.5μL，XhoI 0.5μL，ddH2O将体系补足20μL。获得阳性质粒pETDuet-rcr。
基因scr及质粒pETDuet-rcr的酶切
利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(北京博大泰克生物基因技术有限公司)提取质粒pETDuet-rcr。
按上述方法进行酶切，酶切反应体系组成：10×Buffer H 4μL，基因scr或质粒pETDuet-rcr 10μL，EcoRI 2μL，NotI 2μL，ddH2O将体系补足40μL。
基因scr与质粒pETDuet-rcr的连接
连接反应体系组成：质粒pETDuet-rcr 0.8μL，基因scr 4.2μL，LigationSolution 5μL。混合连接液，将其置于16℃培养箱中连接12-16h。
重组质粒转化大肠杆菌
按照上述方法转化E.coli Top10(DE3)，菌液涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜。
挑取4个克隆，转接入装有3mL的含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养12h，利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(北京博大泰克生物基因技术有限公司)从培养的菌液中提取质粒。用以下反应体系进行酶切验证：10×Buffer H 2μL，质粒DNA 5μL，EcoRI 0.5μL，NotI 0.5μL，ddH2O将体系补足20μL。获得阳性质粒pETDuet-rcr-scr。
实施例8 重组质粒pACYCDuet-pnta-pntb的获得：
利用限制性内切酶EcoR V和XhoI对基因pntb和pACYCDuetTM-1(pACYCDuetTM-1质粒来源于Novagen公司)分别进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接，获得带有基因pntb的重组质粒pACYCDuet-pntb。利用限制性内切酶BamHI和Hind III对基因pnta和pACYCDuet-pntb分别进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接，获得带有两个目的基因pnta和pntb的重组质粒pACYCDuet-pnta-pntb。
基因pntb和pACYCDuetTM-1的酶切
利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(北京博大泰克生物基因技术有限公司)提取质粒pACYCDuetTM-1。
按上述方法进行酶切，酶切反应体系：10×Buffer H 4μL，基因pntb或质粒pACYCDuetTM-1 10μL，EcoR V 2μL，XhoI 2μL，ddH2O将体系补足40μL。
基因pntb与质粒pACYCDuetTM-1的连接
连接反应体系组成：质粒pACYCDuetTM-10.8μL，基因pntb 4.2μL，LigationSolution 5μL。混合连接液，将其置于16℃培养箱中连接12-16h。
重组质粒转化大肠杆菌
按照上述方法转化E.coli Top10(DE3)，菌液涂布到含有34μg/mL氯霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜。
挑取4个克隆，转接入装有3mL的含有34μg/mL氯霉素的LB培养基中，37℃培养12h，利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(北京博大泰克生物基因技术有限公司)从培养的菌液中提取质粒。进行酶切反应验证：10×Buffer H 2μL，质粒DNA 5μL，EcoR V 0.5μL，XhoI 0.5μL，ddH2O将体系补足20μL。获得阳性质粒pACYCDuet-pntb。
基因pnta和pACYCDuet-pntb的酶切
利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(北京博大泰克生物基因技术有限公司)提取质粒pACYCDuet-pntb。
按上述方法进行酶切，酶切反应体系：10×Buffer M 4μL，DNA 10μL，BamH I 2μL，HindIII 2μL，ddH2O将体系补足40μL。
基因pnta与质粒pACYCDuet-pntb的连接
连接反应体系组成：质粒pACYCDuet-pntb 0.8μL，基因pnta 4.2μL，LigationSolution 5μL。混合连接液，将其置于16℃培养箱中连接12-16h。
连接反应液转化大肠杆菌
按照上述方法转化E.coli Top10(DE3)，菌液涂布到含有34μg/mL氯霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜。
挑取4个克隆，转接入装有3mL的含有34μg/mL氯霉素的LB培养基中，37℃培养12h，利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(北京博大泰克生物基因技术有限公司)从培养的菌液中提取质粒。进行酶切反应验证：10×Buffer M 2μL，质粒DNA 5μL，BamH I 0.5μL，HindIII 0.5μL，ddH2O将体系补足20μL。获得阳性质粒pACYCDuet-pnta-pntb。
实施例9 重组大肠杆菌的获得：
将重组质粒pETDuet-rcr-scr和pACYCDuet-pnta-pntb共转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，通过含有100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB平板筛选，37℃倒置培养过夜。获得重组菌E.coliBL21(pETDuet-rcr-scr/pACYCDuet-pnta-pntb)；该重组大肠杆菌送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCC NO：M208126。
实施例10 重组大肠杆菌的诱导表达：
LB培养基组成同实施例1。挑取阳性克隆单菌落接种于3mL含100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养12h。取1mL培养液转接于50mL含100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养至OD600约为0.6。加入诱导物异丙基-B-D-硫代半乳糖苷1mmol/L，30℃下诱导培养重组菌E.coliBL21(pETDuet-rcr-scr/pACYCDuet-pnta-pntb)10h。
实施例11 用培养结束后的菌体进行生物转化试验。
在1mL 0.1mol/L醋酸缓冲液(pH 6.0)中，分别加入105mmol/L底物(R)-苯基乙二醇，5mmol/L硫酸锌，0.1g/mL重组大肠杆菌CCTCC NO：M208126湿菌体，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为67.1％e.e.，产率为57.4％。
实施例12 用培养结束后的菌体进行生物转化试验。
在1mL 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH 6.5)中，分别加入105mmol/L底物(R)-苯基乙二醇，5mmol/L硫酸锌，0.1g/mL重组大肠杆菌CCTCC NO：M208126湿菌体，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为79.3％e.e.，产率为71.5％。
实施例13 用培养结束后的菌体进行生物转化试验。
在1mL 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)中，分别加入105mmol/L底物(R)-苯基乙二醇，5mmol/L硫酸锌，0.1g/mL重组大肠杆菌CCTCC NO：M208126湿菌体，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为93.3％e.e.，产率为82.6％。
实施例14 用培养结束后的菌体进行生物转化试验。
在1mL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中，分别加入105mmol/L底物(R)-苯基乙二醇，5mmol/L硫酸锌，0.1g/mL重组大肠杆菌CCTCC NO：M208126湿菌体，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为83.4％e.e.，产率为72.0％。
实施例15 用培养结束后的菌体进行生物转化试验。
在1mL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，分别加入105mmol/L底物(R)-苯基乙二醇，5mmol/L硫酸锌，0.1g/mL重组大肠杆菌CCTCC NO：M208126湿菌体，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度为66.8％e.e.，产率为55.2％。
Claims (2)
1.一株四个酶偶联的不对称转化制备(S)-苯基乙二醇的重组菌，其分类命名为大肠杆菌BL21/(pETDuet-rcr-scr/pACYCDuet-pnta-pntb)Escherichia coliBL21(pETDuet-rcr-scr/pACYCDuet-pnta-pntb)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 208126。
2.权利要求1所述重组菌CCTCC NO：M 208126的构建方法，其特征是将基因rcr和scr有序插入载体pETDuetTM-1，构建重组质粒pETDuet-rcr-scr；将基因pnta和pntb有序插入载体pACYCDuetTM-1，构建重组质粒pACYCDuet-pnta-pntb；将质粒pETDuet-rcr-scr和pACYCDuet-pnta-pntb共转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，通过含有100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB平板筛选，获得目的重组菌株E.coliBL21(pETDuet-rcr-scr/pACYCDuet-pnta-pntb)；
(1)近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)CCTCC M203011基因组和大肠杆菌(E.coli DH5 α)基因组的获取
近平滑假丝酵母的培养基组成以g/L计：葡萄糖40，酵母膏5，(NH4)2HPO413，KH2PO4 7，ZnSO4·7H2O0.3，NaCl0.1，pH 7.0；将近平滑假丝酵母菌种接种于培养基装液量为20％的250mL摇瓶中于30℃、150rpm振荡培养48h；
大肠杆菌的培养基组成以g/L计：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH7.0；将大肠杆菌菌种接种于培养基装液量为20％的250mL摇瓶中于37℃、200rpm振荡培养12h；
上述两种菌体培养结束后，分别将菌体于6,000rpm离心20min，用生理盐水洗涤两次后收集细胞，利用VIOGENE公司的基因组DNA提取试剂盒GenomicDNA Extraction Miniprep System提取基因组；
(2)基因rcr的获得：以近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)CCTCC M203011基因组作为PCR反应模板，利用含有NdeI限制性酶切位点的引物RCR_F，含有XhoI限制性酶切位点的引物RCR_R，通过PCR扩增反应，获得rcr基因，其全长为1008bp；
RCR_F：5’-ATCGATCGCATATGTCAATTCCATCAAGCCAGTAC-3’，
RCR_R：5’-TGACTCTCGAGTGGATTAAAAACAACTCTACCTTC-3’，
PCR反应体系：ddH2 O 37μL，10×Reaction Buffer 5μL，25mmol/L的dNTP0.5μL，50pmol/μL的引物RCR_F和RCR_R各1μL，近平滑假丝酵母基因组5μL，5U/μL的Taq DNA polymerase 0.5μL；PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃ 1min，57℃ 1min，72℃ 1min，进行30个循环；72℃延伸10min；获得rcr基因；
(3)基因scr的获得：以近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)CCTCC M203011基因组作为PCR反应模板，利用含有EcoRI限制性酶切位点的引物SCR_F，含有NotI限制性酶切位点的引物SCR_R，通过PCR扩增反应，获得scr基因，其全长为837bp；
SCR_F：5’-ATCGAATTCGATGGGCGAAATCGAATCTTATTG-3’，
SCR_R：5’-TGACTGCGGCCGCCTATGGACACGTGTATCCACCGTC-3’，
PCR反应体系：ddH2 O 37μL，10×Reaction Buffer 5μL，25mmol/L的dNTP0.5μL，50pmol/μL的引物SCR_F和SCR_R各1μL，近平滑假丝酵母基因组5μL，5U/μL的Taq DNA polymerase 0.5μL；PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，进行30个循环；72℃延伸10min；获得scr基因；
(4)基因pntb的获得：以大肠杆菌(E.coli DH5 α)基因组作为PCR反应模板，利用含有EcoRV限制性酶切位点的引物PNTB_F，含有XhoI限制性酶切位点的引物PNTB_R，通过PCR扩增反应，获得pntb基因，其全长为1386bp；
PNTB_F：5’-CGCGATATCATGTCTGGAGGATTAGTTAC-3’，
PNTB_R：5’-CCCCTCGAGTTACAGAGCTTTCAGGATTG-3’，
PCR反应体系：ddH2O 37μL，10×Reaction Buffer 5μL，25mmol/L的dNTP0.5μL，50pmol/μL的引物PNTB_F和PNTB_R各1μL，大肠杆菌基因组5μL，5U/μL的Taq DNA polymerase 0.5μL；PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃1min，58℃ 1min，72℃ 1min，进行30个循环；72℃延伸10min；获得pntb基因；
(5)基因pnta的获得：以大肠杆菌(E.coli DH5 α)基因组作为PCR反应模板，利用含有BamHI限制性酶切位点的引物PNTA F，含有Hind III限制性酶切位点的引物PNTA_R，通过PCR扩增反应，获得pnta基因，其全长为1530bp；
PNTA_F：5’-CGCGGATCCATGCGAATTGGCATACCAAG-3’，
PNTA_R：5’-CCCAAGCTTTTAATTTTTGCGGAACATTTTC-3’；
PCR反应体系：ddH2O 37μL，10×Reaction Buffer 5μL，25mmol/L的dNTP0.5μL，50pmol/μL的引物PNTA_F和PNTA_R各1μL，大肠杆菌基因组5μL，5U/μL的Taq DNA polymerase 0.5μL；PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃1min，55℃ 1min，72℃ 1min，进行30个循环；72℃延伸10min；获得pnta基因；
(6)重组质粒pETDuet-rcr-scr的构建：
先利用限制性内切酶NdeI和XhoI对基因rcr和载体pETDuetTM-1分别进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接，获得带有基因rcr的重组质粒pETDuet-rcr；再利用限制性内切酶EcoRI和NotI对基因scr和载体pETDuet-rcr分别进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接，获得带有两个目的基因rcr和scr的重组质粒pETDuet-rcr-scr；
(7)重组质粒pACYCDuet-pnta-pntb的构建：
先利用限制性内切酶EcoRV和XhoI对基因pntb和载体pACYCDuetTM-1分别进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接，获得带有基因pntb的重组质粒pACYCDuet-pntb；再利用限制性内切酶BamHI和HindIII对目的基因pnta和载体pACYCDuet-pntb分别进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接，获得带有两个目的基因pnta和pntb的重组质粒pACYCDuet-pnta-pntb；
(8)重组质粒共转化大肠杆菌
取重组质粒pETDuet-rcr-scr和pACYCDuet-pnta-pntb各2μL，共转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)惑受态细胞，转化液涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，获得阳性克隆E.coliBL21(pETDuet-rcr-scr/pACYCDuet-pnta-pntb)；
3、重组菌E.coli BL21(pETDuet-rcr-scr/pACYCDuet-pnta-pntb)的诱导培养，其特征是采用LB培养基以g/L计：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH 7.0；固体培养基添加培养基重量1.5％的琼脂粉；
挑取阳性克隆单菌落接种于3mL含100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，于37℃、200rpm振荡培养过夜；取1mL培养液转接于50mL含100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，于37℃、200rpm振荡培养至OD600为0.6；加入诱导物异丙基-B-D-硫代半乳糖苷1mmol/L，30℃下诱导培养酶偶联重组菌E.coli BL21(pETDuet-rcr-scr/pACYCDuet-pnta-pntb)10h。
4、利用培养后的酶偶联重组菌CCTCC NO：M208126不对称转化制备(S)-苯基乙二醇的方法，其特征是以(R)-苯基乙二醇为底物，进行不对称转化反应：在1mL0.1mol/L pH5.0～6.0的醋酸缓冲液，或1mL0.1mol/L pH 6.5～7.0的磷酸缓冲液，或1mL0.1mol/L pH 7.5～8.0的Tris-HCl缓冲液中，(R)-苯基乙二醇底物浓度为105mmol/L，5mmol/L硫酸锌，重组菌细胞浓度为0.1g/mL，30℃下反应48h，产物为(S)-苯基乙二醇。
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