CN111560365A - 一种碳纳米管基印迹固载酶的制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及功能材料技术领域，为解决环境污染物PAEs治理的日益紧迫，本发明提出了一种碳纳米管基印迹固载酶的制备方法与应用，以碳纳米管为载体，选用乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，表面经过硅烷偶联剂改性的纳米管为基底，以2‑丙烯酰胺为功能单体在载体表面接枝PAEs分子的印迹聚合物层。洗去模板分子获得印迹载体。制备方法切实可行，并对PAEs有显著的降解效果。制备的固定化酶固定更加稳定，固定量增大，同时具有专一、无毒、储量丰富、价格低廉、易分离回收、可重复使用、稳定性强等特点，在制备过程中具有节约成本、对环境无害等优点。

Description

一种碳纳米管基印迹固载酶的制备方法与应用
技术领域
本发明涉及功能材料技术领域，具体涉及一种碳纳米管基印迹固载酶的制备方法及其应用。
背景技术
酶作为一类高效的生物催化剂，具有温和的反应条件、环境友好、经济可行性、优秀的区域选择性和立体选择性等优点，因而应用很广，尤其是生物技术领域。但是，游离酶在大规模的实际应用中存在着一些显著的缺点，例如：酶不易回收、高成本、低稳定性等，使游离酶的使用广受限制。酶的固定化是酶工程的一种手段，因固定化酶技术提高了酶的稳定性，实现了酶的重复使用，并且能够降低成本，同时生物酶材料降解环境污染物，使其成为当前的研究热点，具有高效降解性能的生物酶以其专一、无毒的特点吸引了众多专家的关注。固定化酶技术的出现为克服游离酶的缺点和为酶的大规模应用提供了有效途径。固定化酶具有易分离回收、可重复使用、稳定性强等优点，其技术的研究成为酶研究与应用的最为活跃的热点之一，也成为了近年污染物降解技术的前沿，同时在环境、食品、生物技术等领域有大量应用。而固载基质是固定化酶高效、稳定的关键，已有文献和专刊报道：已发现了诸多不同基质固定化酶的研究应用，例如用纤维素衍生物、双醛淀粉-SiO2杂化材料等为基质，通过固定化酶技术制备了固载酶，但存在不能重复使用等不足，因此寻找合适的基质并开发固定化酶是该领域的方向和热点。
邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAEs，是邻苯二甲酸形成的酯的统称。(简言之就是塑化剂的一种)当被用作塑料增塑剂时，一般指的是邻苯二甲酸与4～15个碳的醇形成的酯。其中邻苯二甲酸二辛酯是最重要的品种。邻苯二甲酸酯是一类能起到软化作用的化学品还可干扰内分泌系统。邻苯二甲酸酯主要用于聚氯乙烯材料，令聚氯乙烯由硬塑胶变为有弹性的塑胶，起到增塑剂的作用。它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品(如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液)等数百种产品中，但是近年来，这类化合物引起的环境健康危害，受到了环境科学，公共卫生领域，媒体甚至普通大众的广泛关注。2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考，二(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯在2B类致癌物清单中。
近年，随着典型环境污染物PAEs治理的日益紧迫，利用生物活性酯酶催化降解PAEs的高效、专一性能，并开发其在PAEs污染物治理方面的应用成为目前研究的重点。
发明内容
为解决环境污染物PAEs治理的日益紧迫，本发明提出了一种碳纳米管基印迹固载酶的制备方法与应用，制备的固定化酶固定更加稳定，固定量增大，同时具有专一、无毒、储量丰富、价格低廉、易分离回收、可重复使用、稳定性强等特点，在制备过程中具有节约成本、对环境无害等优点。
本发明是通过以下技术方案实现的实现的：以碳纳米管(Carbon Nanotubes，CNTs)为载体，选用乙二醇二甲基丙烯酸酯(Ethylene Glycol Dimethacrylate，EGDMA)为交联剂，表面经过硅烷偶联剂改性的纳米管为基底，以2-丙烯酰胺(Crylamide，AM)为功能单体在载体表面接枝PAEs分子(邻苯二甲酸二甲酯(Dibutyl phthalate，DBP)为例)的印迹聚合物层。洗去模板分子获得印迹载体。制备方法切实可行，并对PAEs有显著的降解效果。
一种碳纳米管基印迹固载酶的制备方法包括以下步骤：
(1)碳纳米管的纯化：碳纳米管、H2SO4混合后，在室温下，搅拌反应，然后洗涤，然后在恒温条件下烘干，将烘干后产物、二甲基甲酰胺、硅烷偶联剂混合后，在通入保护气体的条件下回流；回流后的产物进行洗涤、干燥，然后研磨得到产物1；
H2SO4用于使碳纳米管扩孔，增加比表面，提高吸附量。所述碳纳米管、H2SO4的的质量体积比为1g∶5-15mL，H2SO4的优选为质量浓度为30％。
优选的搅拌的时间为24h以上，目的是使之混合均匀；所述混合物充分反应后，选用蒸馏水多次洗涤，洗涤次数应大于等于3次，直至pH稳定为止；所述恒温条件优选为50-60℃；所述烘干时间优选为24h以上。
烘干后产物、二甲基甲酰胺、硅烷偶联剂的质量体积比为1g∶2-6mL∶0.5-3mL。烘干产物、DMF和硅烷偶联剂全部混合后超声混匀；所述持续通入保护气后升温并在保护气中搅拌反应是指预先通保护气20-30min，然后升温至50-60℃，在持续通入保护气体的同时搅拌反应时间为8-12h。
硅烷偶联剂优选为KH550、KH560、KH570中的一种。
所述回流产物的洗涤试剂优选为甲醇、乙醇、乙醚中的一种；所述洗涤次数应大于等于3次；所述干燥时间优选4-12h。
碳纳米管(Carbon Nanotubes，CNTs)是一种天然的中空多壁纳米管，也是一种环境友好型纳米材料，储量丰富，价格低廉，具有较高长径比，较大比表面积、高机械强度、高分散性和热稳定性等，是一种绿色环保的纳米材料。随着典型环境污染物PAEs治理的日益紧迫，充分利用CNTs的结构特征和纳米尺度特点，结合生物活性漆酶催化降解PAEs的高效、专一性能，开展新型CNTs纳米管基固载酶材料的研究，并开发其在PAEs污染物治理方面的应用。
本发明以表面经过硅烷偶联剂改性的纳米管为基底，将生物酶与兼具稳定性和分散性的纳米管基底结合，制备集定向识别和高效降解于一体的新型功能材料，不但保持了酶的高效、专一等催化特性，且使其具备易分离回收、可重复使用、稳定性强等优点。
(2)将邻苯二甲酸二丁酯、2-丙烯酰胺、乙二醇二甲基丙烯酸酯溶于乙酯中，持续通入保护气后升温并在保护气中搅拌反应，完全溶解后，加入产物1混匀后，加入偶氮二异丁腈，得到印迹混合物；
邻苯二甲酸二丁酯、2-丙烯酰胺、乙二醇二甲基丙烯酸酯的摩尔比为1∶1-8∶10-30，产物1与邻苯二甲酸二丁酯的使用量比为5g∶0.1-3mmol，产物1与偶氮二异丁腈的质量比为1g∶1-10mg。
乙酯作为溶剂，使用量为是溶质溶解的量，作为优选，邻苯二甲酸二丁酯与乙酯的摩尔体积比为1mmol∶50-120mL。
所述持续通入保护气后升温并在保护气中搅拌反应是指预先通保护气20-30min，然后升温至50-60℃，在持续通入保护气体的同时搅拌反应时间为1-1.5h。
优选为超声混匀，所述超声混匀是指将反应物放入频率为80-120Hz的水浴超声箱中，超声时间优选为0.5-1h。
选用乙二醇二甲基丙烯酸酯(Ethylene Glycol Dimethacrylate，EGDMA)为交联剂，以2-丙烯酰胺(crylamide，AM)为功能单体在载体表面接枝PAEs分子的印迹聚合物层。
碳纳米管分子印迹聚合物反应结构式如图4所示。
(3)将印迹混合物用甲醛与乙酸的混合液提取，干燥后即得印迹碳纳米管；
作为优选，混合液中甲醛与乙酸的体积比为1-10∶1。
作为优选，所述提取方法为索氏提取，提取时间大于等于24h；
干燥优选为真空干燥，是指在真空条件下，控制温度恒定适宜，充分干燥12h以上；真空度-0.05--0.07MPa，控制温度恒定50-60℃，烘干至质量不再有明显变化，不大于总质量的0.5％。
(4)采用环氧树脂法(1，4-丁二醇缩水甘油醚)对印迹碳纳米管进行改性；
具体步骤为：将印迹碳纳米管加入到1mol/L的NaOH中，加入BTDE(1，4-丁二醇缩水甘油醚)作为化学偶联剂，充分混合后，置于微型离心管中；之后将微型离心管置于摇瓶培养箱中，在恒温30℃的条件下，pH恒为7，培养2.5-3h；经过培养后得到的活化物，放入高速离心机进行离心；离心转速应大于8000r/min；离心后用蒸馏水进行若干次洗涤，优选次数应大于等于3次，得改性后的印迹碳纳米管。
其中，印迹碳纳米管、NaOH、BTDE的使用量量比为0.1g∶0.1-1mL∶0.1-1uL，改性后的印迹碳纳米管为已经过环氧树脂法活化的印迹碳纳米管。
(5)将磷酸盐缓冲溶液加入PH值＝5.5-9.0的漆酶溶液中，混合搅匀后，加入步骤(4)改性后的印迹碳纳米管、CoCl2，所得悬浮液在4℃下，超声震荡24h，然后从混合物中分离出生物轭合物，并用含Tween20的磷酸盐缓冲溶液洗涤后加入猝灭剂，最后，用Tween20的磷酸盐缓冲溶液进行超声洗涤，制得碳纳米管基印迹固载酶。
作为优选，所述磷酸盐缓冲溶液的摩尔浓度为50mmol·L-1，pH＝8.5，与漆酶溶液的体积比为2-10∶1，漆酶的活性为0.2u/mL。
CoCl2作为固体溶解于磷酸盐缓冲溶液中，使CoCl2的摩尔浓度为0.1-5mmol·L-1，形成溶剂，保持酶的活性。
改性印记碳纳米管与磷酸盐溶液的量比为0.4-40g∶10mL。
作为优选，Tween20的磷酸盐缓冲溶液的质量浓度为0.05％，洗涤是为了分离出游离的酶和固定不牢的酶。
作为优选，猝灭剂为乙醇胺，阻断过量的反应基因。
作为优选，超声洗涤为超声震荡洗涤0.5h，超声震荡频率在80-120Hz，处理过程应恒温在2-28℃之间。
碳纳米管分子印迹固载酶反应结构式如图5所示.
制备过程中所述的保护气体优选为N2。
所述的碳纳米管基印迹固载酶的制备方法得到的碳纳米管基印迹固载酶在PAEs污染物治理方面上的应用。本发明提供了一种固定化酶，制备方法切实可行，并对PAEs有显著的降解效果，同时具有专一、无毒、储量丰富、价格低廉、易分离回收、可重复使用、稳定性强等优点。在处理过程中具有节约成本、对环境无害等意义。
本发明以CNTs为载体，选用乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)为交联剂，表面经过硅烷偶联剂改性的纳米管为基底，以AM为功能单体在载体表面接枝PAEs分子的印迹聚合物层，最后洗去模板分子获得印迹载体，得到能高效识别去除PAEs的固载酶材料，能够有效提高PAEs效率，是集高效富集、特异降解和重复利用性能为一体的印迹固载酶。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)实现了酶的重复使用，降低了成本利用生物酶材料降解环境污染物，具有高效降解效能；
(2)具有易分离回收、可重复使用、稳定性强的特点；
(3)反应选择性高，能特异性降解PAEs。
附图说明
图1为CNTs、扩孔CNTs、活化CNTs、印迹CNTs和固载酶CNTs的红外谱图；
图2为本发明碳纳米管基印迹固载酶的热力学稳定性；
图3为游离酶的热力学稳定性；
图4为碳纳米管分子印迹聚合物反应结构式；
图5为碳纳米管分子印迹固载酶反应结构式。
具体实施方式
下面通过实施例和附图对本发明作进一步详细说明，实施例中所用原料均可市购或采用常规方法制备。
以下实施例中缩写的含义：碳纳米管(CNTs)，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)，邻苯二甲酸二丁酯(DBP)，偶氮二异丁腈(AIBN)，二甲基甲酰胺(DMF)，丙烯酰胺(AM)。
实施例中真空干燥的真空度为真空度-0.06Mpa，超声频率均为100Hz。
实施例1
(1)CNTs的纯化：将5g CNTs、50ml浓度为30％的H2SO4超声混匀后，水浴中机械搅拌反应24h。然后用蒸馏水超声离心洗涤3次，至pH恒定为止，在真空烘箱60℃恒温条件下烘干24h，将5g烘干后产物、20mL DMF和5mL KH550超声混合后，先通N220min，然后升温至60℃，在持续通入保护气体的同时搅拌反应时间为1.5h，在N2保护的条件下60℃回流8h；回流后的产物分别用甲醇、乙醇、乙醚超声离心洗涤三次，真空烘箱中60℃干燥8h，然后研磨得到产物1。
(2)将1mmol邻苯二甲酸二丁酯、4mmol AM和20mmol EDGMA溶于80mL乙酯，持续通入N230min后升温至55℃，并在保护气中搅拌反应1.5h，完全溶解后，加入5g产物1，水浴中超声混合搅拌30min。混匀后，加入20mg AIBN，充分反应24h，得到印迹聚合物。
(3)将印迹混合物用甲醛与乙酸的体积比为4∶1的混合溶剂索氏提取24h，待除去模板和杂质后，55℃真空烘箱干燥12h，即得印迹CNTs。
(4)采用环氧树脂法对印迹CNTs进行改性：将0.1g印迹物CNTs加入到0.45mL，1mol·L-1的NaOH中，加入0.4uL BTDE作为化学偶联，充分混合后，置于5mL的微型离心管中；之后将微型离心管置于摇瓶培养箱中，在恒温30℃的条件下，保证pH恒为7，培养2.5h；经过培养后得到的活化物，放入高速离心机进行离心；离心转速应大于8000r；离心后用蒸馏水进行4次洗涤，得改性后的印迹碳纳米管。
(5)将2.5mL 0.2mol·L-1磷酸盐缓冲溶液加入pH值＝7的0.5mL酶溶液中，混合搅匀后，加入0.1g得改性后的印迹碳纳米管，此时酶的活性为0.2u·mL-1，固体氯化钴使其浓度为1mmol·L-1，所得悬浮液在4℃下，超声震荡1h。然后从混合物中分离出生物轭合物，并用含0.05％Tween20的磷酸盐缓冲溶液频繁洗涤，分离出游离的酶和固定不牢的酶后，再用乙醇胺5uL作为猝灭剂阻断过量的反应基因。最后，用含0.05％Tween20的磷酸盐缓冲溶液对所得样品进行彻底超声震荡洗涤0.5h，制得碳纳米管基印迹固载酶1。
实施例2
(1)CNTs的纯化：将5g CNTs、25ml浓度为30％的H2SO4超声混匀后，水浴中机械搅拌反应24h，然后用蒸馏水超声离心洗涤3次，至pH恒定为止，在真空烘箱50℃恒温条件下烘干24h，将5g烘干后产物、10mL DMF和2.5mL KH560超声混合后，先通N230min，然后升温至50℃，在持续通入保护气体的同时搅拌反应时间为1h，在N2保护的条件下50℃回流12h；回流后的产物分别用甲醇、乙醇、乙醚超声离心洗涤三次，真空烘箱中50℃干燥12h，然后研磨得到产物1。
(2)将1mmol邻苯二甲酸二丁酯、2mmol AM和10mmol EDGMA溶于80mL乙酯，持续通入N220min后升温至50℃，并在保护气中搅拌反应1.5h，完全溶解后，加入2g产物1，水浴中超声混合搅拌30min。混匀后，加入10mg AIBN，充分反应24h，得到印迹聚合物。
(3)将印迹混合物用甲醛与乙酸的体积比为6∶1的混合溶剂索氏提取24h，待除去模板和杂质后，55℃真空烘箱干燥12h，即得印迹CNTs。
(4)采用环氧树脂法对印迹CNTs进行改性：将0.1g印迹物加入到0.45mL 1mol·L-1的NaOH中，加入0.8uL BTDE作为化学偶联，充分混合后，置于5mL的微型离心管中；之后将微型离心管置于摇瓶培养箱中，在恒温30℃的条件下，保证pH恒为7，培养2.5h；经过培养后得到的活化物，放入高速离心机进行离心；离心转速应大于8000r；离心后用蒸馏水进行3次洗涤，得改性后的印迹碳纳米管。
(5)将4mL 0.2m01·L-1磷酸盐缓冲溶液加入pH值＝8的0.5mL酶溶液中，混合搅匀后，加入0.1g得改性后的印迹碳纳米管，此时酶的活性为0.2u·mL-1，加入固体氯化钴使其浓度为1mmol·L-1，所得悬浮液在4℃下，超声震荡1h。然后从混合物中分离出生物轭合物，并用含0.05％Tween20的磷酸盐缓冲溶液频繁洗涤，分离出游离的酶和固定不牢的酶后，再用5uL乙醇胺作为猝灭剂阻断过量的反应基因。最后，用含0.05％Tween20的磷酸盐缓冲溶液对所得样品进行彻底超声震荡洗涤0.5h，制得碳纳米管基印迹固载酶2。
实施例3
(1)CNTs的纯化：将5g CNTs、75mL浓度为30％的H2SO4超声混匀后，水浴中机械搅拌反应24h。然后用蒸馏水超声离心洗涤3次，至pH恒定为止，在真空烘箱55℃恒温条件下烘干24h，将5g烘干后产物、30mL DMF和15mL KH570超声混合后，先通N2 30min，然后升温至55℃，在持续通入保护气体的同时搅拌反应时间为1h，在N2保护的条件下55℃回流12h；回流后的产物分别用甲醇、乙醇、乙醚超声离心洗涤三次，真空烘箱中55℃干燥6h，然后研磨得到产物1。(2)将1mmol邻苯二甲酸二丁酯、7mmol AM和30mmol EDGMA溶于80mL乙酯，持续通入N2 30min后升温至60℃，并在N2中搅拌反应1.5h，完全溶解后，加入5g产物1，水浴中超声混合搅拌30min。混匀后，加入20mg AIBN，充分反应24h，得到印迹聚合物。
(3)将印迹混合物用甲醛与乙酸的体积比为2∶1的混合溶剂索氏提取24h，待除去模板和杂质后，55℃真空烘箱干燥12h，即得印迹CNTs。
(4)采用环氧树脂法对印迹CNTs进行改性：将0.1g印迹物加入到0.45mL 1mol·L-1的NaOH中，加入0.2uL BTDE作为化学偶联，充分混合后，置于5mL的微型离心管中；之后将微型离心管置于摇瓶培养箱中，在恒温30℃的条件下，保证pH恒为7，培养3h；经过培养后得到的活化物，放入高速离心机进行离心；离心转速应大于8000r；离心后用蒸馏水进行5次洗涤，得改性后的印迹碳纳米管。
(5)将5mL 0.2mol·L-1磷酸盐缓冲溶液加入pH值＝6的0.5mL酶溶液中，混合搅匀后，加入0.1g得改性后的印迹碳纳米管，此时酶的活性为0.2u·mL-1，加入固体氯化钴使其浓度为2mmol·L-1，所得悬浮液在4℃下，超声震荡1h。然后从混合物中分离出生物轭合物，并用含0.05％Tween20的磷酸盐缓冲溶液频繁洗涤，分离出游离的酶和固定不牢的酶后，再用5uL乙醇胺作为猝灭剂阻断过量的反应基因。最后，用含0.05％Tween20的磷酸盐缓冲溶液对所得样品进行彻底超声震荡洗涤0.5h，制得碳纳米管基印迹固载酶3。
测试例
(1)新型印迹固载酶的表征的目的：红外光谱(FTIR)、热重分析(TGA)等对各产物进行表征，观测反应物、中间产物与合成终产物结构表征谱的异同，证实预期产物的获得。建立新型纳米管基印迹固载酶的最佳合成路线。
CNTs、扩孔CNTs、活化CNTs、印迹CNTs和固载酶CNTs的红外谱图如图1所示，由红外谱图可知通过本发明方法，成果能制得印迹固载酶材料。
(2)研究CNTs基印迹固载酶富集PAEs污染物的热力学特性，测试新型固载酶材料对PAEs的富集率和富集因子等性能，计算热力学参数，推断热力学识别机理。
实施例1制备的碳纳米管基印迹固载酶热力学稳定性如图2所示，游离酶漆酶，为市购产品，热力学稳定性如如3所示，与固载酶的相对酶活力曲线图进行对比，说明相比于游离酶来说，固载酶更易于储存，重复使用性更强，能更好地降低成本。
(3)碳纳米管基印迹固载酶的重复使用性能如表1所示。
表1：
循环次数 1 2 3 4 5 6
相对酶活性/％ 100 90 84 80 74 65
(4)实施例1-实施例3制备的碳纳米管基印迹固载酶固定化酶固载率如表2所示，
表2
实施例 实施例1 实施例2 实施例3
酶的固载率/％ 70％ 63％ 68％
(5)实施例1制备的碳纳米管基印迹固载酶在不同温度的固载酶活性如表3所示，不同温度的游离酶活性如表4所示。
表3(相对酶活力/％)
Figure BDA0002442447200000091
说明随着温度的升高和时间的，埃洛石基印迹固载酶的相对酶活力不断下降。
表4(相对酶活力/％)
Figure BDA0002442447200000092
Figure BDA0002442447200000101
不同温度下的游离酶的热力学稳性曲线如图3所示，与固载酶的相对酶活力曲线图，如图2所示，进行对比，说明相比于游离酶来说，固载酶更易于储存，重复使用性更强，能更好地降低成本。
(6)实施例1制备的碳纳米管基印迹固载酶的储存稳定性与游离酶的比较如表5所示。
表5(相对酶活力/％)
时间/天 7 14 21 28 35 42 49
固定化酶 100 93 87 84 79 71 62
游离酶 100 72 54 46 39 31 19
(7)将实施例1-3制备所得的埃洛石基印迹固载酶进行酶活检测，结果如下表6所示。
表6
酶活力
实施例1 5100u
实施例2 4400u
实施例3 4900u
(8)对以上实施例1-3所制备的印迹碳纳米管固载酶进行性能检测。具体检测中，以获得分别对PAEs的降解效率来进行，选取的PAEs溶液成分为：邻苯二甲酸二甲酯(DMP)，邻苯二甲酸二乙酯(DEP)，邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)，邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP)，20ug/L。固载酶降解效率表如表7所示：
表7：
实例 实例1 实例2 实例3
降解效率(％) 93.4 85.1 89.6
由表6的检测结果表明，本发明所制备的印迹碳纳米管固载酶对PAEs有着较好的降解效率，从而有利于在污染水体中
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种碳纳米管基印迹固载酶的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：
（1）碳纳米管的纯化：碳纳米管、H2SO4混合后，在室温下，搅拌反应,然后洗涤，然后在恒温条件下烘干，将烘干后产物、二甲基甲酰胺、硅烷偶联剂混合后，在通入保护气体的条件下回流；回流后的产物进行洗涤、干燥，然后研磨过筛得产物1；
（2）将邻苯二甲酸二丁酯、2-丙烯酰胺、乙二醇二甲基丙烯酸酯溶于乙酯中，持续通入保护气后升温并在保护气中搅拌反应，完全溶解后，加入产物1混匀后，加入偶氮二异丁腈反应，得到印迹混合物；
（3）将印迹混合物用甲醛与乙酸的混合液提取，干燥后即得印迹碳纳米管；
（4）采用环氧树脂法对印迹碳纳米管进行改性；
（5）将磷酸盐缓冲溶液加入pH值=5.5-9.0的漆酶溶液中，混合搅匀后，加入步骤（4）改性后的印迹碳纳米管、CoCl2，所得悬浮液在4℃下，超声震荡24 h，然后从混合物中分离出生物轭合物，并用含Tween20的磷酸盐缓冲溶液洗涤后加入猝灭剂，最后，用Tween20的磷酸盐缓冲溶液进行超声洗涤，制得碳纳米管基印迹固载酶。
2.根据权利要求1所述的碳纳米管基印迹固载酶的制备方法，其特征在于，步骤（1）中步骤（1）中所述碳纳米管、H2SO4的质量体积比为1g：5-15mL。
3.根据权利要求2所述的碳纳米管基印迹固载酶的制备方法，其特征在于，步骤（1）烘干后产物、二甲基甲酰胺、硅烷偶联剂的质量体积比为1g：2-6mL：0.5-3mL。
4.根据权利要求1所述的碳纳米管基印迹固载酶的制备方法，其特征在于，步骤（2）中邻苯二甲酸二丁酯、2-丙烯酰胺、乙二醇二甲基丙烯酸酯的摩尔比为1：1-8：10-30。
5.根据权利要求1所述的碳纳米管基印迹固载酶的制备方法，其特征在于，步骤（2）中产物1与邻苯二甲酸二丁酯的使用量比为5g：0.1-3mmol，产物1与偶氮二异丁腈的质量比为1g：1-10mg。
6.根据权利要求1所述的碳纳米管基印迹固载酶的制备方法，其特征在于，步骤（3）混合液中甲醛与乙酸的体积比为1-10:1。
7.根据权利要求1所述的碳纳米管基印迹固载酶的制备方法，其特征在于，步骤（4）中环氧树脂为1,4-丁二醇缩水甘油醚。
8.根据权利要求1所述的碳纳米管基印迹固载酶的制备方法，其特征在于，步骤（5）磷酸盐缓冲溶液与漆酶溶液的体积比为2-10:1，CoCl2 在磷酸盐缓冲溶液中的摩尔浓度为0.1-5 mmol·L-1。
9.根据权利要求1或8所述的碳纳米管基印迹固载酶的制备方法，其特征在于，步骤（5）中猝灭剂为乙醇胺。
10.一种根据权利要求1-9中任一项所述的碳纳米管基印迹固载酶的制备方法得到的碳纳米管基印迹固载酶在PAEs污染物治理方面上的应用。
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