CN111218441B - 磁性固定化酵母细胞及其在制备（r）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯中的应用 - Google Patents
磁性固定化酵母细胞及其在制备（r）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种磁性固定化酵母细胞及其在制备(R)‑2‑羟基‑4‑苯基丁酸乙酯中的应用，所述磁性固定化酵母细胞是将赖氨酸修饰磁性纳米粒子与酵母细胞溶液混匀，20℃‑40℃、130‑170r/min摇床震荡中固定2‑6h，反应结束后，磁分离，沉淀用去离子水洗涤，冻干，获得磁性固定化酵母细胞。本发明固定化方法有效提高了酵母细胞的稳定性，增强了细胞对底物溶液的耐受性。在外加磁场的作用下磁性固定化细胞更易于从反应体系分离，有利于产物的分离提取，简化了工艺流程。在交变磁场反应器中合适的磁场频率和磁场强度能有效增强反应体系的传质过程，显著缩短还原反应时间，进而提高生物转化效率。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的制备，特别涉及到使用氨基酸修饰的磁性纳米颗粒作为载体有效固定化酵母，并将其用于2-氧代-4-苯基丁酸乙酯的不对称还原制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯。
(二)背景技术
(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯(Ethyl(R)-2-hydroxy-4-phenylbutyrate，R-HPBE)，CAS号90315-82-5，分子式C12H16O3，分子量208.25，密度为1.075g/mL，沸点为 212℃，不溶于水，易溶于有机溶剂。R-HPBE是合成赖诺普利、喹那普利、雷米普利、西拉普利等血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)类抗高血压和充血性心力衰竭药物的重要手性中间体，不对称还原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯(OPBE)可以制备R-HPBE。
高血压病是一种由于血管神经调节障碍而升高动脉压力的慢性疾病，随着生活水平的提高，中、老年人已成为该病的多发人群，高血压影响血管脆性，过度时会引起血管破裂等问题，并引发心脑血管疾病，肾脏病、眼底疾病、神经系统疾病等，更为严重的是高血压还与高血糖、高血黏度、高血脂等疾病紧密联系在一起，造成全身各组织器官的慢性损害，导致身体脏器功能丧失，严重威胁人们的生命与健康。普利类药物由于其高效性和低副作用成为目前市场上主要的抗高血压药物，占高血压等疾病治疗药物市场的五分之一。R-HPBE在合成普利类药物(ACEI)中具有关键作用，ACEI 药物通过切断肾素-血管紧张素-醛固酮系统，阻断血管紧张素Ⅱ的生成从而达到扩张血管、降血压的作用。故R-HPBE的制备方法在国内外引起众多关注，近几十年来不断有人致力于新的R-HPBE的制备技术路线研发，以期获得一条经济、原子利用率高的绿色合成工艺。
采用化学法和生物法不对称还原OPBE均可以制备R-HPBE。化学法包括化学拆分法和化学合成法，化学拆分法是拆分其相应外消旋体2-羟基-4-苯基丁酸，再酯化为 R-HPBE，所用拆分剂为手性有机胺类化合物，化学拆分法存在的问题有：以光学纯苯乙胺类衍生物作拆分剂，由于其价格昂贵，实用价值不大；而氯霉素中间体拆分收率较低(小于50％)。而传统的化学合成法往往步骤繁多，催化剂价格较贵，环境污染严重，产物对映体过剩值不高，且催化反应需要很高的氢气压力，对设备要求高。而生物法因其光学选择性高、反应条件温和、环境友好等特性，成为目前合成R-HPBE 最有效的方法之一。生物合成法包括全细胞不对称还原法和羰基还原酶转化法。采用羰基还原酶不对称还原OPBE，需要提纯羰基还原酶并添加辅酶提高转化率，转化底物的量偏低。利用微生物全细胞催化还原反应是目前国际上制备R-HPBE有效且极有发展前景的方法之一，该方法反应条件温和、环境友好，成本低廉，催化效果理想，且反应体系可实现辅酶原位再生，具有良好的工业应用前景。但是，该方法需进一步解决的问题是提高反应的底物浓度，降低对细胞的抑制作用以及提高细胞对底物和有机溶剂的耐受性。为了提高细胞的耐受性和稳定性，本发明拟采用磁性固定化细胞转化OPBE制备R-HPBE，提高催化剂的重复利用次数，实现连续反应，提高生产效率。
与游离细胞相比，固定化细胞多次使用而没有明显的活性损失，具有较高的经济性。固定含有特定酶的细胞消除了分离和纯化酶的漫长而繁琐的程序，易于产物纯化，方便催化剂的回收利用。由于固定在载体上的生物催化剂无需重新填充，保留在载体上的微生物可实现连续生产。
对于非磁性载体固定化细胞的应用，存在着必须离心操作，样品不得不稀释及载体回收损失大等问题，因此，寻求更好的固定化细胞载体成了人们研究的热点。磁性载体不仅能有效避免以上问题，且因其具有颗粒小、超顺磁性、低毒性和借助外部磁场易从体系中分离等特点，引起了研究者的关注。磁性固定化后的细胞拥有更好的稳定性和重复利用性，在生物催化反应中，固定化细胞拥有更好的催化效率和立体选择性，有利于反应的连续进行。
本发明通过筛选对前手性酮2-氧代-4-苯基丁酸乙酯具有高催化活性的微生物菌株，并用自制的磁性载体将其固定化得到固定化细胞，在摇床中利用细胞内的选择性羰基还原酶对前手性底物OPBE进行不对称还原，制备生成血管紧张素转换酶抑制剂合成中的重要手性关键体R-HPBE，并最大限度地提高产物的光学纯度和产率。
本发明首次在磁场实现磁性固定化细胞不对称还原OPBE得到R-HPBE，工艺流程简单、操作方便、催化效率高，为R-HPBE的制备提供简便可行途径，并且为高效生物催化合成具有重要应用前景的手性药物或重要中间体提供基础理论指导，具有较好应用前景。在反应器中，磁性固定化细胞在交变磁场作用下可以均匀分散在反应液中，实现充分的传质，磁场对磁性固定化颗粒的作用代替了传统的生物反应器的搅拌作用，使磁性固定化细胞与底物充分接触，减少传质阻力，提高反应速率。在磁场的作用下磁性固定化细胞更易于从反应液中分离，有利于产物的分离提取，解决了游离酵母细胞催化生物转化过程底物处理量偏低的问题，提高了酵母细胞的利用次数，进而提高生物转化效率。本发明的研究工作为进一步研究固定化技术在工业中的应用提供了新的思路，温和的固定化过程和易制备的载体大大降低了工业应用成本，对此领域相关研究起到推动作用。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种磁性固定化酵母细胞及其不对称还原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯高效制备R-HPBE的应用。通过筛选对前手性底物2-氧代-4-苯基丁酸乙酯具有高催化活性的酵母细胞，并进一步用自制磁性纳米载体高效固定目标酵母细胞，在最优条件下得到最大产量的固定化细胞，筛选摇床中生物转化条件得到高光学纯的 R-HPBE。将固定化细胞进一步应用在交变磁场中利用磁场作用代替传统的搅拌作用，实现充分的传质，在最优的磁场条件下固定化细胞的催化活力最高，催化反应效率得到显著提高，从而建立磁性固定化细胞在磁场反应器中高效还原OPBE制备R-HPBE 的工艺，为后期的工业应用提供了参考。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种磁性固定化酵母细胞，所述磁性固定化酵母细胞制备方法：(1)将Fe3O4磁性颗粒与氨基酸水溶液超声分散后，使用外加磁场回收沉淀，沉淀洗涤后冻干，获得氨基酸修饰磁性纳米粒子(记为Fe3O4-AA)；所述Fe3O4磁性纳米颗粒与赖氨酸水溶液中赖氨酸质量比为1:1；所述赖氨酸水溶液质量浓度为1g/L；所述超声分散条件为：20～50KHz超声30min；(2)将Fe3O4-AA与酵母细胞溶液混匀，20℃ -40℃(优选30℃)、130-170r/min(优选150r/min)摇床震荡中固定2-6h(优选3h)，反应结束后，磁分离，沉淀用去离子水洗涤(优选三次)，冻干，获得磁性固定化酵母细胞(记为Fe3O4-AA-Cell)；所述Fe3O4-AA与酵母细胞干重比为1:50-300，优选 1:100；所述酵母细胞溶液是将酵母细胞与pH 7磷酸缓冲液充分混匀制成，所述缓冲液添加量以酵母细胞重量计为20ml/3g；所述冻干条件为：然后-80℃冰箱中预冻8h 后放入冷冻干燥机-65℃真空干燥12h。
所述氨基酸为赖氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸，优选赖氨酸。
所述Fe3O4磁性颗粒制备方法为：将0.1M的FeCl2水溶液与0.1M的FeCl3水溶液以体积比1:2混合，加入去离子水，在1000rpm高速搅拌下，保持30-40℃水浴，缓慢滴加氨水调pH至10，溶液变黑发亮；升温至60℃，反应1h；再升温至80℃，熟化1h；反应结束后，冷却至室温，将其用去离子水反复清洗直至无色透明，且上清液pH为中性，使用外加磁场收集得到黑色磁性颗粒沉淀(Fe3O4)，在-80℃冰箱中预冻8h后放入冷冻干燥机中冻干12h，获得Fe3O4磁性颗粒；所述去离子水与FeCl2水溶液体积比为1.5：1。
本发明还提供一种磁性固定化酵母细胞在摇床中不对称还原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯(OPBE)制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯(R-HPBE)的应用，所述的应用以OPBE 乙醇溶液为底物，以pH9磷酸缓冲盐溶液为反应介质，以磁性固定化酵母细胞为催化剂构成转化体系，在20-45℃、50-250rpm条件下进行还原反应8～40h(优选30℃、 180rpm、24h)，反应液分离纯化，获得(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯；所述底物浓度为0.1～0.5mmol/mL(优选0.2mmol/mL)，所述底物与反应介质体积比为1:10；所述催化剂质量用量以缓冲液体积计为0.1-0.5g/mL。
进一步，所述应用在交变磁场中进行分批和连续还原反应，所述分批还原反应为：在磁场频率为500Hz、磁场强度为4-20Gs(优选12Gs)的交变磁场中，将磁性固定化酵母细胞加入OPBE乙醇溶液中，在20-45℃(优选30℃反应8h)条件下进行还原反应，反应液分离纯化，获得(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯；所述连续还原反应为：在磁场频率为500Hz、磁场强度为4-20Gs(优选12Gs)的交变磁场中，将磁性固定化酵母细胞加入连续流反应器中，以25-500μL/min(优选25μL/min)的速度流加底物OPBE乙醇溶液至磁性固定化酵母细胞中，同时以25-500μL/min(与流加速度相同) 的速度将生成的产物回流加入底物中，在20-45℃(优选30℃反应8h)条件下进行连续还原反应，反应液分离纯化，获得(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯。
本发明所述连续流反应器包括交流电源1、反应罐2、亥姆霍兹线圈3、恒流泵4、底物罐5和产物罐6；所述反应罐2放置在连接交流电源1的亥姆霍兹线圈3中形成的交变磁场；所述反应罐2通过恒流泵4与底物罐5连通，所述底物罐5通过恒流泵 4与产物罐6连通，所述产物罐6与反应罐2连通。
所述分离提取R-HPBE的方法为：反应结束后，使用外加磁场去除反应液中的磁性固定化细胞获得转化液，等体积乙酸乙酯萃取转化液中的R-HPBE，挥发掉乙酸乙酯后获得R-HPBE。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
本发明筛选到高活性干酵母，并将其活化配成酵母细胞溶液，用自制的Fe3O4-Lys载体将其固定化，制备成固定化酵母细胞，在摇床和磁场两种不同反应器中催化不对称还原反应高效制备R-HPBE。该固定化方法有效提高了酵母细胞的稳定性，增强了细胞对底物溶液的耐受性，多次重复利用仍具有较好催化活性，且固定化细胞可以在 35℃下催化反应。在外加磁场的作用下磁性固定化细胞更易于从反应体系分离，有利于产物的分离提取，简化了工艺流程。在交变磁场反应器中合适的磁场频率和磁场强度能有效增强反应体系的传质过程，显著缩短还原反应时间，进而提高生物转化效率。
(四)附图说明
图1为本发明固定化酵母细胞还原OPBE生成R-HPBE反应机理示意图。
图2为磁性固定化酵母细胞在交变磁场中催化反应的示意图；1.交流电源，2.反应罐，3.亥姆霍兹线圈。
图3为连续流反应器示意图，1.交流电源，2.反应器，3.亥姆霍兹线圈，4.恒流泵，5.底物罐，6.产物罐。
图4为实施例1制备的磁性纳米颗粒Fe3O4红外光谱图。
图5为实施例1制备的磁性纳米颗粒Fe3O4扫描电子显微镜图。
图6为实施例2制备的磁性纳米颗粒Fe3O4-Lys红外光谱图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：磁性纳米四氧化三铁(Fe3O4)的制备
称取12.675g FeCl2溶于1000mL去离子水中，配置成0.1M的FeCl2溶液。称取16.220g FeCl3溶于1000mL去离子水中，配置成0.1M的FeCl3溶液。取FeCl2溶液 30mL，FeCl3溶液60mL，混合放入250mL三口烧瓶中，加入去离子水20mL，在1000 rpm高速搅拌下，保持30-40℃水浴，缓慢滴加氨水调pH至10，溶液变黑发亮。升温至60℃，反应1h。再升温至80℃，熟化1h。反应结束后，冷却至室温，将其用去离子水反复清洗直至无色透明，且上清液pH为中性，使用外加磁场收集得到黑色磁性颗粒沉淀(Fe3O4)，在-80℃冰箱中预冻8h后放入冷冻干燥机中冻干12h，经傅里叶红外变换光谱(见图4)，获得的15.6g磁性颗粒，即为磁性Fe3O4纳米粒子，粒径范围在10～100nm(见图5)，将其保存备用。
实施例2：氨基酸修饰的磁性纳米四氧化三铁(Fe3O4-AA)的制备
准确称量四种氨基酸(赖氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸)各0.2g分别溶于 200mL去离子水中，待摇匀后加入0.2g磁性Fe3O4纳米粒子，适当摇晃均匀后，在 40KHz超声波作用下反应半小时后，取出锥形瓶，使用外加磁场收集黑色沉淀物，并用去离子水洗涤3次，然后-80℃冰箱中预冻8h后放入冷冻干燥机中冻干12h，获得氨基酸改性的Fe3O4纳米粒子(记为Fe3O4-AA)0.2-0.4g。其中赖氨酸修饰的磁性纳米四氧化三铁(Fe3O4-Lys)0.35g，Fe3O4-Arg 0.27g，Fe3O4-Glu 0.23g，Fe3O4-Asp 0.21g。经傅里叶红外变换光谱鉴定Fe3O4-AA制备成功(Fe3O4-Lys光谱见图6)。
实施例3：活性干酵母的筛选
分别称取购买的11种活性干酵母各3g加入到11个装有20mL磷酸缓冲液(pH 7)的锥形瓶中，摇匀，待充分溶解后，在11种20mL酵母细胞溶液中分别加入1mL 0.2mmol/mL的OPBE乙醇溶液，置于30℃、180r/min摇床中转化24h，待反应结束后，取出转化液，在8000rpm的转速下离心10min，收集上清液，用等体积的乙酸乙酯萃取，自然挥发浓缩至3mL体积制成样品待气相检测，结果见表1所示，选择7号活性酵母用于后续试验，即安琪酵母股份有限公司的百钻高活性干酵母(耐高糖)。
气相色谱法(GC)检测条件：手性色谱柱CP7502(25m×0.25mm×0.25μm)；进样口温度250℃，柱温130℃，检测器250℃，流速2mL/min，分流比1：15，进样量1uL。
产物的摩尔转化率(X)和对映体过剩值(eep)通过公式(1)和公式(2)计算：
式(1)中，Ms：底物的分子量；Mp：产物的分子量；Q：反应初始时底物的质量；P：反应结束时产物的质量。
式(2)中，CR：R-HPBE的浓度；Cs：S-HPBE的浓度。
表1不同活性干酵母筛选结果
实施例4：固定化时间对磁性固定化细胞(Fe3O4-AA-Cell)制备的影响
分别取五份实施例3筛选到的7号活性干酵母2g，分别加入到20mL磷酸缓冲盐溶液(pH 7)中，充分溶解形成酵母细胞溶液后，每份加入0.01g实施例2所制的 Fe3O4-AA(Fe3O4-Lys、Fe3O4-Arg、Fe3O4-Glu、Fe3O4-Asp)载体，30℃、150r/min摇床震荡中分别固定2h、3h、4h、5h、6h，反应结束后，用磁力倾析收集得到沉淀物，并用去离子水洗涤三次，然后-80℃冰箱中预冻8h后放入冷冻干燥机中冻干12h，得到磁性固定化细胞(Fe3O4-AA-Cell)。收集回收沉淀后的上层液，并将稀释10倍的上层液在波长为260nm处的紫外吸收值作为A1值，相同时间的对照组稀释10倍的细胞液紫外吸收值作为A0，固定化率均值见表2。固定化率AD＝(A0-A1)/A0×100％。
表2不同固定化时间对磁性固定化细胞制备的影响
当固定化时间太短时，细胞与载体未完全结合，随着时间的延长，载体表面的活性基团与细胞充分连接，达到饱和程度，固定化率和固定化量都趋于稳定。对于四种载体而言，最佳的固定化时间都为3h，此时的固定化效果最佳。Fe3O4-Lys载体相对于其他载体而言，固定化率更高，产量更高(见表3)。高产量为下一步催化还原反应提供有利的条件，故选用Fe3O4-Lys-Cell作为最终的生物催化剂。
表3固定化细胞原料及产量
实施例5：转化时间对还原反应的影响
在五个50mL小型锥形瓶中，分别将实施例4方法制备的1.3278g磁性固定化细胞Fe3O4-Lys-Cell分散于10mL磷酸缓冲盐溶液(pH9)中，加入1mL浓度为 0.02mmol/mL的OPBE乙醇溶液，于30℃、180rpm摇床中分别转化8h、16h、24h、 32h、40h。反应结束后，将反应液用外加磁场回收沉淀，上清液用等体积乙酸乙酯萃取，静置分层后，取出萃取液常温挥发浓缩至3mL体积，采用实施例3所述气相色谱(GC)检测分析底物OPBE和产物R-HPBE和S-HPBE的含量，确定转化率和 R-HPBE的对映体过剩值。
表4不同转化时间对还原反应的影响
由上表数据可知，随着反应时间的延长，底物的转化率呈上升再稳定趋势，在24 h时转化率达到最大值100％，表示此时1mL0.2mmol/mL的OPBE乙醇溶液被转化完全，且此时的产物全部是目标产物R-HPBE。24h之后的转化率及R-HPBE对映体过剩值保持稳定，故最终将24h确定为最佳还原反应时间。
实施例6：不同底物浓度对还原反应的影响
在五个50mL小型锥形瓶中，分别将实施例4方法制备的1.3278g磁性固定化细胞Fe3O4-Lys-Cell分散于10mL磷酸缓冲盐溶液(pH 9)中，加入1mL底物浓度分别为0.1mmol/mL、0.2mmol/mL、0.3mmol/mL、0.4mmol/mL、0.5mmol/mL的OPBE 乙醇溶液，于30℃、180rpm摇床中转化24h。反应结束后，将反应液用外加磁场回收沉淀，上清液用等体积乙酸乙酯萃取，静置分层后，取出萃取液常温挥发浓缩至3 mL体积，用实施例3所述气相色谱(GC)检测分析底物OPBE和产物R-HPBE和S-HPBE的含量，确定转化率和R-HPBE的对映体过剩值。
表5不同底物浓度对还原反应的影响
当底物浓度在0.1-0.2mmol/mL范围内，在30℃、180rpm摇床中转化24h后底物能被完全转化为产物，且全部为R-HPBE。随着底物浓度的增加，转化率不断地降低，有部分底物未能及时转化。在0.3-0.5mmol/mL浓度范围内，R-HPBE对映体过剩值大致相同，说明较高浓度影响转化率但不会对R-HPBE对映体过剩值产生明显影响。
实施例7：摇床中重复利用次数对还原反应的影响
在50mL小型锥形瓶中，将按照实施例4方法制备的1.3278g磁性固定化细胞 Fe3O4-Lys-Cell分散于10mL磷酸缓冲盐溶液(pH 9)中，加入1mL浓度为0.2 mmol/mL的OPBE乙醇溶液，于30℃和180rpm摇床中转化24h，反应结束后使用外加磁场回收沉淀，将回收的沉淀用乙醇和去离子水清洗10次后，保证磁性固定化细胞无底物和产物残留。之后将其重新应用于催化还原反应，在上述的转化条件下循环使用，直至转化率降低或对映体过剩值变小。每次回收沉淀后的上清液用等体积乙酸乙酯萃取，静置分层后，取出萃取液常温挥发浓缩至3mL体积，用实施例3所述气相色谱(GC)检测分析底物OPBE和产物R-HPBE和S-HPBE的含量，确定转化率和R-HPBE的对映体过剩值。
表6摇床中重复利用次数对还原反应的影响
使用外加磁场非常容易回收磁性固定化细胞，进一步投入到循环使用过程中，由结果可知Fe3O4-Lys-Cell可重新利用8次之多，其催化活性仍未受较大影响，对底物的转化率可达到91.28％。8次过后转化率以及R-HPBE对映体过剩值有了较明显下降。
实施例8：磁场强度对还原反应的影响
参照图2，将反应罐2放置在连接交流电源1的亥姆霍兹线圈3中形成的交变磁场中，可以调节磁场的强度和频率。在10mL反应瓶中，实施例4方法制备的1.3278 g磁性固定化细胞Fe3O4-Lys-Cell分散于10mL磷酸缓冲盐溶液(pH 9)中，加入1mL 浓度为0.2mmol/mL的OPBE乙醇溶液，于30℃、磁场频率为500Hz的交变磁场中反应8小时条件下，分别考察施加的磁场强度为4、8、12、16、20Gs对还原反应的影响。反应结束后使用外加磁场回收沉淀，反应液用等体积乙酸乙酯萃取，静置分层后，取出萃取液常温挥发浓缩至3mL体积，用实施例3所述气相色谱(GC)检测分析底物OPBE和产物R-HPBE和S-HPBE的含量，确定转化率和R-HPBE的对映体过剩值。
表7磁场强度对还原反应的影响
交变磁场可以引起磁性固定化细胞的运动而提高催化反应速率。随着磁场强度的增加，转化率先增加后减小。当磁场强度小于12Gs时，磁性固定化细胞处于活化状态，活力随着磁场强度的增加而增加。当磁场强度大于12Gs时，对于磁性固定化细胞来说，在外部磁场的作用下，自身能够产生感应磁场，将会与外部磁场叠加共同作用于细胞，最终对细胞的催化作用产生影响。实验结果表明，最佳磁场强度为12Gs。
实施例9：在交变磁场中磁性固定化细胞的重复利用
向图2所示的反应罐中加入实施例4方法制备的1.3278g磁性固定化细胞 Fe3O4-Lys-Cell和10mL的磷酸缓冲盐溶液(pH 9)，将1.0mL浓度为0.2mmol/mL 的OPBE乙醇溶液加入反应罐，在30℃、磁场频率为500Hz，磁场强度为12Gs的交变磁场下进行，连续反应8h。反应结束后使用外加磁场回收沉淀，将回收的沉淀用乙醇和去离子水清洗10次后，保证磁性固定化细胞无底物和产物残留。之后将其重新应用于催化还原反应，在上述的转化条件下循环使用，直至转化率降低或对映体过剩值变小。每次回收沉淀后的上清液用等体积乙酸乙酯萃取，静置分层后，取出萃取液常温挥发浓缩至3mL体积，用实施例3所述气相色谱(GC)检测分析底物OPBE 和产物R-HPBE和S-HPBE的含量，确定转化率和R-HPBE的对映体过剩值。
表8在交变磁场中磁性固定化细胞的重复利用对还原反应的影响
磁性固定化细胞使用外加磁场可以容易地从反应体系中分离而重复使用。在500Hz，12Gs的交变磁场下对磁性固定化细胞的重复使用性能进行了研究。重复使用10 次后转化率仍有84.58％，相比在摇床中，重复利用次数得到了提高。这是因为在交变磁场下磁性固定化细胞的微振动，促进了扩散，减少了固定化细胞的团聚以及产物在固定化细胞上的沉积。
实施例10：在连续流反应器中底物流速对还原反应的影响
(1)参照图3连续流反应器，将反应罐2放置在连接交流电源1的亥姆霍兹线圈3形成的交变磁场中；所述反应罐2通过恒流泵4与底物罐5连通，所述底物罐5 通过恒流泵4与产物罐6连通，所述产物罐6与反应罐2连通。
(2)向反应罐中加入依照实施例4方法制备的1.3278g磁性固定化细胞 Fe3O4-Lys-Cell和10mL的磷酸缓冲盐溶液(pH 9)，将1.0mL浓度为0.2mmol/mL 的OPBE乙醇溶液加入底物罐，通过恒流泵将底物泵入反应罐中，底物流速分别为 25、30、40、50、100、200、300、400、500μL/min，以底物流速相同的速度将反应产物泵入底物罐中。反应在30℃、磁场频率为500Hz，磁场强度为12Gs的交变磁场下进行，连续反应8h。反应结束后使用外加磁场回收沉淀，反应液用等体积乙酸乙酯萃取，静置分层后，取出萃取液常温挥发浓缩至3mL体积，用实施例3所述气相色谱(GC)检测分析底物OPBE和产物R-HPBE和S-HPBE的含量，确定转化率和R-HPBE的对映体过剩值。
表9连续流反应器中不同底物流速对还原反应的影响
研究底物的流速是为了在合适的流速下获得较高的转化率。当底物流速由25 μL/min提高到70μL/min时，其转化率从91.83％下降到54.39％，这是因为随着流速的提高，底物的停留时间降低，足够长的停留时间才能保证底物与磁性固定化细胞的充分接触。因此最佳底物流速为25μL/min。
Claims (9)
1.一种磁性固定化酵母细胞在不对称还原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯中的应用，其特征在于所述磁性固定化酵母细胞按如下方法制备：(1)将Fe3O4磁性颗粒与氨基酸水溶液超声分散后，使用外加磁场回收沉淀，沉淀洗涤后冻干，获得氨基酸修饰磁性纳米粒子；所述氨基酸为赖氨酸、精氨酸、谷氨酸或天冬氨酸；(2)将氨基酸修饰磁性纳米粒子与酵母细胞溶液混匀，20-40℃、130-170r/min摇床震荡中固定2-6h，反应结束后，磁分离，沉淀用去离子水洗涤后冻干，获得磁性固定化酵母细胞；所述酵母细胞为安琪酵母股份有限公司的耐高糖百钻高活性干酵母。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于步骤(1)所述Fe3O4磁性纳米颗粒与氨基酸水溶液中氨基酸质量比为1:1；所述氨基酸水溶液质量浓度为1g/L。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于步骤(1)所述超声分散条件为：20～50KHz超声30min。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于步骤(2)所述氨基酸修饰磁性纳米粒子与酵母细胞溶液中酵母细胞干重比为1:50-300；所述酵母细胞溶液是将酵母细胞与pH 7磷酸缓冲液充分混匀制成，所述缓冲液添加量以酵母细胞干重计为20ml/3g。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于步骤(2)所述冻干条件为：-80℃冰箱中预冻8h后，放入冷冻干燥机中冻干-65℃真空干燥12h。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的应用以2-氧代-4-苯基丁酸乙酯乙醇溶液为底物，以pH9磷酸缓冲盐溶液为反应介质，以磁性固定化酵母细胞为催化剂构成转化体系，在20-45℃、50-250rpm条件下进行还原反应8～40h，反应液分离纯化，获得(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述底物浓度为0.1～0.5mmol/mL，所述底物与反应介质体积比为1:10；所述催化剂质量用量以缓冲液体积计为0.1-0.5g/mL。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述应用在交变磁场中进行分批还原反应，所述分批还原反应为：在磁场频率为500Hz、磁场强度为4-20Gs的交变磁场中，将磁性固定化酵母细胞加入2-氧代-4-苯基丁酸乙酯乙醇溶液中，在20-45℃条件下进行还原反应，反应液分离纯化，获得(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯。
9.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述应用在交变磁场中进行连续还原反应，所述连续还原反应为：在磁场频率为500Hz、磁场强度为4-20Gs的交变磁场中，将磁性固定化酵母细胞加入连续流反应器中，以25-500μL/min的速度流加2-氧代-4-苯基丁酸乙酯乙醇溶液至磁性固定化酵母细胞中，同时以25-500μL/min的速度将生成的产物回流加入底物中，在20-45℃条件下进行连续还原反应，反应液分离纯化，获得(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯。
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