CN110938620A - 一种磁性固定化酵母细胞及其在（r）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯合成中的应用 - Google Patents

一种磁性固定化酵母细胞及其在（r）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯合成中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种磁性固定化酵母细胞及其在(R)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯合成中的应用，所述磁性固定化酵母细胞是将Fe3O4磁性颗粒与氨基酸水溶液超声分散后，使用外加磁场回收沉淀，沉淀洗涤后冻干，获得氨基酸修饰磁性纳米粒子；然后将氨基酸修饰磁性纳米粒子与酵母细胞冻干粉、磷酸缓冲盐溶液振荡混匀，获得磁性固定化酵母细胞。本发明无需振荡和搅拌促进传质，显著缩短反应时间，极大提高了COBE转化效率，磁性固定化细胞可以重复利用多次。在交变磁场中重复使用13次后转化率仍有99.8％，相比在摇床中，重复利用次数得到了提高。

Description

一种磁性固定化酵母细胞及其在(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯 合成中的应用
(一)技术领域
本发明涉及(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的制备，特别涉及到使用氨基酸修饰的磁性纳米颗粒作为载体有效固定化酵母，并将其用于4-氯-3-羰基丁酸乙酯的不对称还原制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。
(二)背景技术
(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(Ethyl R-4-chloro-3-hydroxybutyrate，R-CHBE)，分子式C6H11ClO3，分子量166.6，外观为淡黄色液体，密度为1.19g/mL，沸点为94℃。R-CHBE是合成大量手性药物的重要中间体，可以合成L-肉毒碱、大环内酯A、和(R)-γ-氨基-β-羟基丁酸(GABOB)，负霉素(negamicyn)和2,5-环己二烯合成纤维，不对称还原4-氯-3-羰基丁酸乙酯(COBE)可以制备R-CHBE。
采用化学法和酶法不对称还原4-氯-3-羰基丁酸乙酯均可以制备R-CHBE。化学法不对称还原4-氯-3-羰基丁酸乙酯需要贵金属手性催化剂，价格昂贵，产物对映体过剩值不高。生物法包括全细胞不对称还原法和羰基还原酶转化法。采用羰基还原酶不对称还原COBE，需要提纯羰基还原酶并添加辅酶提高转化率，转化底物的量偏低。采用全细胞不对称还原4-氯-3-羰基丁酸乙酯，反应条件温和，羰基还原酶和辅酶存在于细胞内部，有利于实现辅酶的原位再生，羰基还原酶立体选择性好，反应过程环境友好，污染少，成本低廉，但是处理底物的量偏低。为了提高底物处理量，进一步提高生产效率，本发明拟采用磁性固定化细胞转化COBE制备R-CHBE，实现连续反应，提高底物转化量，提高生产效率。
与游离细胞相比，固定化细胞多次使用而没有明显的活性损失，具有较高的经济性。固定含有特定酶的细胞消除了分离和纯化酶的漫长而繁琐的程序，易于产物纯化，方便催化剂的回收利用。由于固定在载体上的生物催化剂无需重新填充，保留在载体上的微生物可实现连续生产。
对于非磁性载体固定化细胞的应用，存在着必须离心操作，样品不得不稀释及载体回收损失大等问题，因此，寻求更好的固定化细胞载体成了人们研究的热点。磁性载体不仅能有效避免以上问题，且因其具有颗粒小、超顺磁性、低毒性和借助外部磁场易从体系中分离等特点，引起了研究者的关注。
本发明制备了一系列磁性纳米颗粒，利用不同氨基酸修饰过的磁性纳米颗粒对产羰基还原酶的酵母菌进行固定化，为细胞的高效固定化提供了新的方法。四氧化三铁固定化细胞具有超顺磁性和低毒性，在外加磁场的条件下容易实现固定化细胞的高效分离。磁性固定化后的细胞拥有更好的稳定性和重复利用性，在生物催化反应中，固定化细胞拥有更好的催化效率和立体选择性，有利于反应的连续进行。
本发明采用氨基酸修饰的磁性纳米颗粒固定化酵母细胞转化COBE，分别使用四种不同的氨基酸(两种酸性氨基酸和两种碱性氨基酸)修饰磁性四氧化三铁纳米颗粒，制作本发明所需的四种固定化载体，并将其应用于酵母细胞的固定，实现COBE的转化得到R-CHBE。在反应器中，磁性固定化细胞在交变磁场作用下可以实现充分的传质，磁场对磁性固定化颗粒的作用代替了传统的生物反应器的搅拌作用，使磁性固定化细胞与底物充分接触，减少传质阻力，提高反应速率。合适强度的磁场有利于提高固定化细胞的催化活力，进一步提高催化反应效率。本发明的研究工作为进一步研究固定化技术在工业中的应用提供了新的思路，温和的固定化过程和易制备的载体大大降低了工业应用成本，对此领域相关研究起到推动作用。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种磁性固定化酵母细胞及其不对称还原4-氯-3-羰基丁酸乙酯高效制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的应用。将酸性氨基酸或碱性氨基酸的氨基或羧基与Fe3O4磁性颗粒表面的羟基通过化学键有效相连，得到氨基酸修饰的磁性纳米粒子，用于固定化酵母细胞。磁性固定化酵母细胞在交变磁场中受到磁场的作用可以均匀分散在反应液中，能够与底物充分接触，多次重复利用可以提高催化反应效率；反应条件温和，在磁场的作用下磁性固定化细胞更易于从反应液中分离，有利于产物的分离提取，解决了游离酵母细胞催化生物转化过程底物处理量偏低的问题，提高了酵母细胞的利用次数，进而提高生物转化效率。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种磁性固定化酵母细胞，所述磁性固定化酵母细胞是将Fe3O4磁性颗粒与氨基酸水溶液超声分散后，使用外加磁场回收沉淀，沉淀洗涤后冻干，获得基酸修饰磁性纳米粒子；然后将氨基酸修饰磁性纳米粒子与酵母细胞冻干粉、磷酸缓冲盐溶液(pH 9)振荡混匀，获得磁性固定化酵母细胞。所述Fe3O4磁性颗粒与氨基酸水溶液中氨基酸质量比为1:1；所述氨基酸为谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸中的一种，优选精氨酸；所述氨基酸修饰磁性纳米粒子与酵母细胞冻干粉质量比为1:50-300。所述超声分散条件为：20～50KHz超声30min；所述冻干条件为：-65℃真空干燥处理12h。
所述酵母细胞为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.3361，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳大屯路中科院微生物研究所，100101，保藏日期：2009年10月23日，保藏编号CGMCC No.3361，已在专利申请200910154777.2中公开。所述酿酒酵母CGMCC No.3361的菌落特征：在琼脂培养基上呈现出乳白色、有光泽、平坦、边缘整齐、湿润、表面光滑，质地均匀的菌落形态。
进一步，所述氨基酸修饰磁性纳米粒子按如下方法制备：将Fe3O4磁性颗粒在超声波作用下分散到氨基酸水溶液中(优选20～50KHz超声30min，更优选40KHz超声30分钟)，利用磁铁磁分离获得沉淀，水洗(优选10次)，-65℃真空干燥(优选12h)，获得氨基酸修饰磁性纳米粒子；所述氨基酸水溶液浓度为0.5～1.5g/L(优选1g/L)，所述氨基酸水溶液体积用量以Fe3O4磁性颗粒重量计为800～1200mL/g(优选1000mL/g)。
进一步，所述Fe3O4磁性颗粒按如下方法制备：将0.1M的FeCl2水溶液、0.1M的FeCl3水溶液和去离子水按体积比3：6：2混合，在30-40℃下用机械搅拌器搅拌(优选1000rpm)均匀，逐滴加入氨水至pH 10，升温至60℃反应1h；再升温至80℃熟化1h；反应结束，冷却至室温，采用外加磁场收集沉淀，得到黑色磁性颗粒沉淀(即Fe3O4)，水洗数次直至上清液pH 7，在-80℃冰箱中预冻后放入冷冻干燥机中冻干(优选-65℃冻干12h)，获得Fe3O4磁性颗粒。
进一步，所述磁性固定化酵母细胞按如下方法制备：将氨基酸修饰磁性纳米粒子与酵母细胞冻干粉、磷酸缓冲盐溶液(pH 9)混合，在30℃摇床振荡固定化(天冬氨酸和赖氨酸优选4h，精氨酸和谷氨酸优选3h)，使用外加磁场回收沉淀，将回收的沉淀用去离子水小心洗涤数次至洗涤液在波长为260nm处无紫外吸收，说明已经洗去未结合的游离细胞，得到所述磁性固定化酵母细胞；所述氨基酸修饰磁性纳米粒子与酵母细胞冻干粉质量比为1:50-300(天冬氨酸和赖氨酸优选1：200，精氨酸优选1：300，谷氨酸优选1：50)，所述缓冲液体积用量以氨基酸修饰磁性纳米粒子重量计为0.5-2L/g(天冬氨酸和赖氨酸优选1.333L/g，精氨酸优选2L/g，谷氨酸优选0.667L/g)。
本发明所述酵母细胞冻干粉由如下方法制备得到：(1)斜面培养：将酿酒酵母(优选酿酒酵母CGMCC No.3361)接种到斜面培养基，26～35℃培养4～6天(优选30℃5天)得菌体斜面；所述的斜面培养基按如下组成配制：麦芽汁5～15g/L，酵母粉2～4g/L，蛋白胨4～6g/L，葡萄糖7～12g/L，琼脂15～25g/L，自然pH值，溶剂为水；121℃灭菌20min，灭菌后冷却制成斜面；优选所述斜面培养基组成：麦芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH自然；(2)种子培养：从菌体斜面取一环菌体转接到种子培养基，26～35℃、摇床转速为150～200r/min培养18～26h(优选35℃、150r/min培养24h)，得种子液；所述的种子培养基按如下组成配制：葡萄糖26～32g/L，酵母粉2～4g/L，硫酸铵3～6g/L，无水MgSO4 0.2～0.4g/L，K2HPO4·3H2O 0.5～1.5g/L，KH2PO4 0.6～1.5g/L，自然pH值，溶剂为水；优选所述种子培养基组成为：葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，硫酸铵5g/L，无水MgSO40.3g/L，K2HPO4·3H2O 1.0g/L，KH2PO4 1.0g/L，自然pH值，溶剂为水；(3)发酵培养：取种子液以体积浓度10～20％(优选10％)的接种量接种于发酵培养基中，培养温度为26～35℃、摇床转速为150～200r/min培养18～30h(优选35℃、150r/min培养24h)，得到含有含酶菌体细胞的发酵液，将发酵液离心，取沉淀-80℃中冷冻8h，再于冷冻干燥机中冻干，得到酿酒酵母冻干粉；所述发酵培养基按如下组成配制：葡萄糖26～32g/L，酵母粉2～4g/L，硫酸铵3～6g/L，无水MgSO4 0.2～0.4g/L，K2HPO4·3H2O 0.5～1.5g/L，KH2PO4 0.6～1.5g/L，自然pH值，溶剂为水；优选所述发酵培养基组成为：葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，硫酸铵5g/L，无水MgSO4 0.3g/L，K2HPO4·3H2O 1.0g/L，KH2PO4 1.0g/L，自然pH值，溶剂为水。
本发明还提供一种磁性固定化酵母细胞在不对称还原4-氯-3-羰基丁酸乙酯制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用，包括在摇床中进行生物转化还原反应、在交变磁场中进行分批或连续还原反应；所述的应用以4-氯-3-羰基丁酸乙酯(COBE)乙醇溶液为底物，以pH5-9磷酸缓冲盐溶液为反应介质，以磁性固定化酵母细胞为催化剂构成转化体系，在20-45℃条件下进行还原反应，反应结束后，使用外加磁场回收沉淀，从转化液中分离提取(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(R-CHBE)。所述底物浓度为0.0067-0.0555mmol/L(天冬氨酸和谷氨酸优选0.0320mmol/L，精氨酸和赖氨酸优选0.0440mmol/L)，所述底物体积用量以催化剂重量计为0.4～1.5mL/g(天冬氨酸优选0.5564mL/g，谷氨酸优选1.4282mL/g，精氨酸优选0.7646mL/g，赖氨酸优选0.4284mL/g)；所述缓冲液体积用量以催化剂重量计为3～15mL/g(天冬氨酸优选5.564mL/g，谷氨酸优选14.282mL/g，精氨酸优选7.646mL/g，赖氨酸优选4.284mL/g)。
所述分离提取(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(R-CHBE)方法为：去除反应液中的磁性固定化细胞获得转化液，乙酸乙酯萃取转化液中的R-CHBE，挥发掉乙酸乙酯后获得R-CHBE。
进一步，所述还原反应在摇床中进行，反应条件为：将磁性固定化酵母细胞加入COBE乙醇溶液中，在20-45℃、50-250rpm(优选35℃、150rpm)条件下进行还原反应，反应结束后，使用外加磁场回收沉淀，从转化液中分离提取(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。
进一步，所述还原反应在交变磁场中进行分批还原反应，所述方法为：在磁场频率为500Hz、磁场强度为4-20Gs(优选12Gs)的交变磁场中，将磁性固定化酵母细胞加入COBE乙醇溶液中，在20-45℃(优选35℃反应8h)条件下进行还原反应，反应结束后，使用外加磁场回收沉淀，从转化液中分离提取R-CHBE。
进一步，所述还原反应在交变磁场中进行连续还原反应，所述方法为：在磁场频率为500Hz、磁场强度为4-20Gs(优选12Gs)的交变磁场中，将磁性固定化酵母细胞加入连续流反应器中，以25-500μL/min(优选25μL/min)的速度流加底物COBE乙醇溶液至磁性固定化酵母细胞中，同时以25-500μL/min(与流加速度相同)的速度将生成的产物回流加入底物中，在20-45℃(优选35℃反应8h)条件下进行连续还原反应，反应结束后，使用外加磁场回收沉淀，从转化液中分离提取R-CHBE。
所述连续流反应器优选包括交流电源1、反应罐2、亥姆霍兹线圈3、恒流泵4、底物罐5和产物罐6；所述反应罐2放置在连接交流电源1的亥姆霍兹线圈3中形成的交变磁场；所述反应罐2通过恒流泵4与底物罐5连通，所述底物罐5通过恒流泵4与产物罐6连通，所述产物罐6与反应罐3连通。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
本发明采用一系列酸性和碱性氨基酸修饰的磁性纳米颗粒有效固定化细胞，利用氨基酸修饰的Fe3O4(Fe3O4-AA)能高效固定酵母细胞，在外加磁场作用下固定化细胞易于回收重复利用，磁性固定化细胞在交变磁场中呈均匀分布状态，可以与底物COBE溶液充分接触，无需振荡和搅拌促进传质，显著缩短反应时间，极大提高了COBE转化效率。在转化体系相同的情况下，Fe3O4-Arg-Cell在摇床中将底物转化完全需要24h，而在交变磁场中只需8h便可将底物完全转化，转化率达到100％。磁性固定化细胞可以重复利用多次，有利于提高(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯生产效率。在交变磁场中重复使用13次后转化率仍有99.8％，相比在摇床中，重复利用次数得到了提高。
(四)附图说明
图1为本发明酵母细胞还原COBE生成CHBE反应机理示意图。
图2为磁性固定化酵母细胞在交变磁场中催化反应的示意图；1.交流电源，2.反应罐，3.亥姆霍兹线圈。
图3为连续流反应器示意图，1.交流电源，2.反应器，3.亥姆霍兹线圈，4.恒流泵，5.底物罐，6.产物罐。
图4为实施例2制备的磁性纳米颗粒红外光谱图。
图5为实施例2制备的磁性纳米颗粒扫描电镜图，A:Fe3O4；B:Fe3O4-Arg；C:Fe3O4-Arg-Cell。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：酿酒酵母细胞的制备
(1)斜面培养：将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.3361接种到斜面培养基，37℃培养24h得菌体斜面；所述的斜面培养基按如下组成配制：麦芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂20g/L，自然pH值，溶剂为水；121℃灭菌20min，灭菌后冷却制成斜面；
(2)种子培养：从菌体斜面取一环菌体转接到种子培养基，35℃，摇床转速为150r/min，培养24h，得种子液；所述的种子培养基按如下组成配制：葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，硫酸铵5g/L，无水MgSO4 0.3g/L，K2HPO4·3H2O 1.0g/L，KH2PO4 1.0g/L，自然pH值，溶剂为水；
(3)发酵培养：取种子液，以体积比10％的接种量接种于100mL发酵培养基中，培养温度为35℃，摇床转速为150r/min，培养24h，得到含酶菌体细胞的发酵液，发酵液离心，取酵母细胞在超低温冰箱-80℃中冷冻8h，再于冷冻干燥机中冻干12h，得到干酵母(即酵母细胞冻干粉)1g；所述发酵培养基按如下组成配制：葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，硫酸铵5g/L，无水MgSO4 0.3g/L，K2HPO4·3H2O 1.0g/L，KH2PO4 1.0g/L，自然pH值，溶剂为水。
实施例2：磁性固定化细胞的制备
(1)称取12.675g FeCl2溶于1000mL去离子水中，配置成0.1M的FeCl2溶液，称取16.220g FeCl3溶于1000mL去离子水中，配置成0.1M的FeCl3溶液。取FeCl2溶液30mL，FeCl3溶液60mL，混合放入250mL三口烧瓶中，加入去离子水20mL，在1000rpm高速搅拌下，保持30-40℃水浴，缓慢滴加氨水调pH至10，溶液变黑发亮。升温至60℃，反应1h。再升温至80℃，熟化1h。反应结束后，冷却至室温，将其用去离子水反复清洗直至无色透明，且上清液pH为中性，使用外加磁场收集得到黑色磁性颗粒沉淀(Fe3O4)，在-80℃冰箱中预冻8h后放入冷冻干燥机中冻干12h，经傅里叶红外变换光谱(见图4)和扫描电子显微镜检测鉴定(见图5所示)，获得的15.6g磁性颗粒，即为磁性Fe3O4纳米粒子，粒径范围在10～100nm，将其保存备用。
(2)分别准确称取0.1g氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸)溶于100mL纯水中，配成相应的氨基酸水溶液。在每种氨基酸水溶液100ml中相应加入0.1g步骤(1)制备的磁性Fe3O4纳米粒子，使得氨基酸水溶液中氨基酸与磁性Fe3O4纳米粒子质量比1:1，适当摇晃均匀后，在40 KHz超声波作用下分散30分钟后，用磁力倾析收集得到黑色沉淀物，并用去离子水洗涤三次，然后-80℃冰箱中预冻8 h后放入冷冻干燥机中冻干12 h，分别获得氨基酸改性的Fe3O4纳米粒子0.15 g(记为Fe3O4-AA，其中精氨酸改性的Fe3O4纳米粒子记为Fe3O4-Arg，赖氨酸改性的磁性纳米粒子记为Fe3O4-Lys，谷氨酸改性的磁性纳米粒子记为Fe3O4-Glu，天冬氨酸改性的磁性纳米粒子记为Fe3O4-Asp)，保存备用。其中Fe3O4-Arg傅里叶红外变换光谱见图4，扫描电子显微镜检测鉴定见图5所示。其他氨基酸改性纳米粒子经傅里叶红外变换光谱和扫描电子显微镜检测鉴定成功。
(3)在超净台上，根据表1，将实施例1方法制备的1.5～3 g干酵母用20 mL磷酸缓冲盐溶液(pH 9)充分溶解，加入0.01～0.03 g步骤(2)制备的Fe3O4-AA，混合均匀，在30℃、150r/min摇床震荡中固定3～4 h，去离子水洗至上层液在波长为260 nm处无紫外吸收，将得到的沉淀在超低温冰箱-80℃中冷冻8 h，再于冷冻干燥机中冻干12 h后，经傅里叶红外变化光谱和扫描电子显微镜检测鉴定成功制备得到磁性固定化细胞(记为Fe3O4-AA-Cell)0.7002～2.334 g。其中Fe3O4-Arg-Cell傅里叶红外变换光谱见图4，扫描电子显微镜检测鉴定见图5所示。
精氨酸的磁性固定化细胞记为Fe3O4-Arg-Cell，赖氨酸修饰的磁性固定化细胞记为Fe3O4-Lys-Cell，谷氨酸修饰的磁性固定化细胞记为Fe3O4-Glu-Cell，天冬氨酸修饰的磁性固定化细胞记为Fe3O4-Asp-Cell。
表1固定化细胞原料及产量
干酵母/g Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>-AA/g 固定时间/h 产量/g
Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>-Arg-Cell 3 0.01 3 1.3078
Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>-Lys-Cell 3 0.015 4 2.334
Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>-Glu-Cell 1.5 0.03 3 0.7002
Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>-Asp-Cell 3 0.015 4 1.7973
实施例3：固定化时间对固定化率的影响
(1)在五个50 mL小型锥形瓶中，将3 g实施例1方法制备的干酵母用20 mL磷酸缓冲盐溶液(pH 9)充分溶解，加入0.01 g载体Fe3O4-Arg，混合均匀，另外五个锥形瓶中不加入载体作为对照组，在30℃、150 r/min摇床震荡中分别固定2 h、3 h、4 h、5 h、6 h。反应结束后，将反应液用外加磁场回收沉淀，稀释10倍的上层液在波长为260 nm处的紫外吸收值作为A1值，相同时间的对照组稀释10倍的细胞液紫外吸收值作为A0，固定化率均值见表2。固定化率AD＝(A0-A1)/A0×100％。
(2)在五个50 mL小型锥形瓶中，将3 g实施例1方法制备的干酵母用20 mL磷酸缓冲盐溶液(pH 9)充分溶解，加入0.015 g载体Fe3O4-Lys，混合均匀，另外五个锥形瓶中不加入载体作为对照组，在30℃、150r/min摇床震荡中分别固定2h、3h、4h、5h、6h。反应结束后，固定化率测定方法如步骤(1)，固定化率均值见表2。
(3)在五个50mL小型锥形瓶中，将1.5g实施例1方法制备的干酵母用20mL磷酸缓冲盐溶液(pH 9)充分溶解，加入0.03g载体Fe3O4-Glu，混合均匀，另外五个锥形瓶中不加入载体作为对照组，在30℃、150r/min摇床震荡中分别固定2h、3h、4h、5h、6h。反应结束后，固定化率测定方法如步骤(1)，固定化率均值见表2。
(4)在五个50mL小型锥形瓶中，将3g实施例1方法制备的干酵母用20mL磷酸缓冲盐溶液(pH 9)充分溶解，加入0.015g载体Fe3O4-Asp，混合均匀，另外五个锥形瓶中不加入载体作为对照组，在30℃、150r/min摇床震荡中分别固定2h、3h、4h、5h、6h。反应结束后，固定化率测定方法如步骤(1)，固定化率均值见表2。
表2不同固定化时间对固定化率的影响
Figure BDA0002279351590000071
当固定化时间太短时，细胞与载体未完全结合，随着时间的延长，载体表面的活性基团与细胞充分连接，达到饱和程度，固定化率和固定化量都趋于稳定。对于Fe3O4-Asp和Fe3O4-Lys载体而言，4h时固定化率最高，之后基本保持恒定，因此最终选用固定4h，同理，Fe3O4-Arg和Fe3O4-Glu载体选用3h的固定化时间。
实施例4：转化时间对还原反应的影响
(1)在五个50mL小型锥形瓶中，分别将实施例2方法制备的1.3078g Fe3O4-Arg-Cell分散于10mL磷酸缓冲盐溶液(pH 9)中，加入1mL浓度为0.0440mmol/L的COBE乙醇溶液，于35℃、150rpm摇床中分别转化16h、24h、32h、40h、48h。反应结束后，将反应液用外加磁场回收沉淀，上清液11mL用4mL乙酸乙酯萃取，取0.3mL萃取液用气相检测方法测定转化率。气相色谱检测条件：手性色谱柱CP7502(25m×0.25mm×0.25μm)；进样口温度250℃，柱温110℃，检测器250℃，流速1mL/min，分流比1：15，进样量1μL。
产物对映体过剩值的检测采用衍生化方法：反应结束后，将反应液使用外加磁场回收沉淀，上清液11mL保存在具塞试管中，加入4mL乙酸乙酯，反复震荡混匀萃取，静置后取1mL乙酸乙酯萃取液置于玻璃瓶中做衍生化反应(常温下自然挥发干溶剂，然后在通风橱内加入2滴乙酸酐和2滴吡啶，置于沸水浴中反应1h)，稍冷后加入乙酸乙酯作为溶剂，用岛津气相色谱仪GC-2014检测产物的对映体过剩值。气相色谱检测条件：手性色谱柱CP7502(25m×0.25mm×0.25μm)；进样口温度250℃，柱温110℃，检测器250℃，流速1mL/min，分流比1：15，进样量1μL。
(2)在五个50mL小型锥形瓶中，分别将2.334g实施例2方法制备的Fe3O4-Lys-Cell分散于10mL磷酸缓冲盐溶液(pH 9)中，加入1mL浓度为0.0440mmol/L的COBE乙醇溶液，于35℃和150rpm摇床中分别转化16h、24h、32h、40h、48h。转化率及对映体过剩值检测方法同步骤(1)。
(3)在五个50mL小型锥形瓶中，分别将0.7002g实施例2方法制备的Fe3O4-Glu-Cell分散于10mL磷酸缓冲盐溶液(pH 9)中，加入1mL浓度为0.0320mmol/L的COBE溶液，于35℃和150rpm摇床中分别转化16h、24h、32h、40h、48h。转化率及对映体过剩值检测方法同步骤(1)。
(4)在五个50mL小型锥形瓶中，分别将1.7973g实施例2方法制备的Fe3O4-Asp-Cell分散于10mL磷酸缓冲盐溶液(pH 9)中，加入1mL浓度为0.0320mmol/L COBE乙醇溶液，于35℃和150rpm摇床中分别转化16h、24h、32h、40h、48h。反应结束后，按照前述检测方法进行检测。转化率及对映体过剩值检测方法同步骤(1)。
表3不同转化时间对还原反应的影响
Figure BDA0002279351590000081
随着反应时间的延长，四种固定化细胞对底物溶液都能逐渐地转化完全，Fe3O4-Arg-Cell相比其他三种固定化细胞，催化效率更高，其在24h内即可完全将底物转化成R-CHBE。
实施例5：反应温度对还原反应的影响
(1)在五个50mL小型锥形瓶中，分别将1.3078g实施例2方法制备的Fe3O4-Arg-Cell分散于10mL磷酸缓冲盐溶液(pH 9)中，加入1mL浓度为0.0440mmol/L的COBE溶液，150rpm摇床中转化24h条件下，分别考察20℃、25℃、30℃、35℃、40℃的反应温度对还原反应的影响。转化率及对映体过剩值检测方法同实施例4。
(2)在五个50mL小型锥形瓶中，分别将2.334g实施例2方法制备的Fe3O4-Lys-Cell分散于10mL磷酸缓冲盐溶液(pH 9)中，加入1mL浓度为0.0440mmol/L的COBE溶液，于150rpm摇床中转化40h条件下，分别考察20℃、25℃、30℃、35℃、40℃的反应温度对还原反应的影响。转化率及对映体过剩值检测方法同实施例4。
(3)在五个50mL小型锥形瓶中，分别将0.7002g实施例2方法制备的Fe3O4-Glu-Cell分散于10mL磷酸缓冲盐溶液(pH 9)中，加入1mL浓度为0.0320mmol/L的COBE溶液，于150rpm摇床中转化40h条件下，分别考察20℃、25℃、30℃、35℃、40℃的反应温度对还原反应的影响。转化率及对映体过剩值检测方法同实施例4。
(4)在五个50mL小型锥形瓶中，分别将实施例2方法制备的1.7973g Fe3O4-Asp-Cell分散于10mL磷酸缓冲盐溶液(pH 9)中，加入1mL浓度为0.0320mmol/L COBE溶液，于150rpm摇床中转化48h条件下，分别考察20℃、25℃、30℃、35℃、40℃的反应温度对还原反应的影响。转化率及对映体过剩值检测方法同实施例4。
表4不同反应温度对还原反应的影响
Figure BDA0002279351590000091
温度显著影响细胞中酶的活性和立体选择性。由于蛋白质的变性，酶活性在高温下会丧失或被抑制。在20℃-35℃随着温度的不断升高，转化率也随之增大直至达到最大值，R-CHBE的对映体过剩值随之升高，当温度为35℃时R-CHBE的对映体过剩值达到100％。当温度达到40℃时，反应转化率开始明显下降，在45℃时转化率为最低。因此，反应最佳的温度为35℃。
实施例6：底物浓度对还原反应的影响
(1)在五个50mL小型锥形瓶中，分别将1.3078g实施例2方法制备的Fe3O4-Arg-Cell分散于10mL磷酸缓冲盐溶液(pH 9)中，加入1mL底物浓度为0.0067mmol/L、0.0196mmol/L、0.0320mmol/L、0.0440mmol/L、0.0555mmol/L的COBE乙醇溶液，于35℃和150rpm摇床中转化24h的条件下考察底物浓度对还原反应的影响。转化率及对映体过剩值检测方法同实施例4。
(2)在五个50mL小型锥形瓶中，分别将2.334g实施例2方法制备的Fe3O4-Lys-Cell分散于10mL磷酸缓冲盐溶液(pH 9)中，加入1mL底物浓度为0.0067mmol/L、0.0196mmol/L、0.0320mmol/L、0.0440mmol/L、0.0555mmol/L的COBE乙醇溶液，于35℃和150rpm摇床中转化40h条件下考察底物浓度对还原反应的影响。转化率及对映体过剩值检测方法同实施例4。
(3)在五个50mL小型锥形瓶中，分别将0.7002g实施例2方法制备的Fe3O4-Glu-Cell分散于10mL磷酸缓冲盐溶液(pH 9)中，加入1mL底物浓度为0.0067mmol/L、0.0196mmol/L、0.0320mmol/L、0.0440mmol/L、0.0555mmol/L的COBE乙醇溶液，，于35℃和150rpm摇床中转化40h条件下考察底物浓度对还原反应的影响。转化率及对映体过剩值检测方法同实施例4。
(4)在五个50mL小型锥形瓶中，分别将1.7973g实施例2方法制备的Fe3O4-Asp-Cell分散于10mL磷酸缓冲盐溶液(pH 9)中，加入1mL底物浓度为0.0067mmol/L、0.0196mmol/L、0.0320mmol/L、0.0440mmol/L、0.0555mmol/L的COBE乙醇溶液，于35℃和150rpm摇床中转化48h条件下考察底物浓度对还原反应的影响。转化率及对映体过剩值检测方法同实施例4。
表5不同底物浓度对还原反应的影响
Figure BDA0002279351590000101
在一定的底物浓度范围内，四种固定化细胞催化的还原反应都可以完全将COBE转化为R-CHBE。Fe3O4-Asp-Cell和Fe3O4-Glu-Cell两种酸性氨基酸修饰的载体固定化细胞对底物的耐受性低于另两种碱性氨基酸固定化细胞，从结果可以看出，四种固定化细胞催化的还原反应，随着底物浓度的增加，产率明显降低。底物浓度对R-CHBE的对映体过剩值也有一定的影响。
实施例7：缓冲液pH值对还原反应的影响
(1)在五个50mL小型锥形瓶中，分别将1.3078g实施例2方法制备的Fe3O4-Arg-Cell分散于10mL pH值为5、6、7、8、9的磷酸缓冲盐溶液中，加入1mL浓度为0.0440mmol/L的COBE乙醇溶液，于35℃和150rpm摇床中转化24h的条件下考察缓冲液pH值对还原反应的影响。转化率及对映体过剩值检测方法同实施例4。
(2)在五个50mL小型锥形瓶中，分别将2.334g实施例2方法制备的Fe3O4-Lys-Cell分散于10mL pH值为5、6、7、8、9的磷酸缓冲盐溶液中，加入1mL浓度为0.0440mmol/L的COBE乙醇溶液，于35℃和150rpm摇床中转化40h条件下考察缓冲液pH值对还原反应的影响。转化率及对映体过剩值检测方法同实施例4。
(3)在五个50mL小型锥形瓶中，分别将0.7002g实施例2方法制备的Fe3O4-Glu-Cell分散于10mL pH值为5、6、7、8、9的磷酸缓冲盐溶液中，加入1mL浓度为0.0320mmol/L的COBE乙醇溶液，于35℃和150rpm摇床中转化40h条件下考察缓冲液pH值对还原反应的影响。转化率及对映体过剩值检测方法同实施例4。
(4)在五个50mL小型锥形瓶中，分别将1.7973g实施例2方法制备的Fe3O4-Asp-Cell分散于10mL pH值为5、6、7、8、9的磷酸缓冲盐溶液中，加入1mL浓度为0.0320mmol/L的COBE乙醇溶液，于35℃和150rpm摇床中转化48h条件考察缓冲液pH值对还原反应的影响。转化率及对映体过剩值检测方法同实施例4。
表6不同pH值对还原反应的影响
Figure BDA0002279351590000111
在pH 5-pH 9范围内，考察了不同固定化细胞催化性能受缓冲液pH值的影响，在pH5-pH7内，转化率随着pH值的增大呈现逐步提高的趋势，除Fe3O4-Arg-Cell外，其他三种固定化细胞在缓冲液pH为8时达到最高的转化率，之后维持不变，而Fe3O4-Arg-Cell在缓冲液pH为9时，底物完全转化。缓冲液pH值的大小不影响Fe3O4-Arg-Cell催化产生R-CHBE。
实施例8：摇床转速对还原反应的影响
(1)在五个50mL小型锥形瓶中，分别将1.3078g实施例2方法制备的Fe3O4-Arg-Cell分散于10mL磷酸缓冲盐溶液(pH 9)中，加入1mL浓度为0.0440mmol/L的COBE乙醇溶液，35℃，于转速为120rpm、130rpm、140rpm、150rpm、160rpm、170rpm的摇床中转化24h，考察摇床转速对还原反应的影响。转化率及对映体过剩值检测方法同实施例4。
(2)在五个50mL小型锥形瓶中，分别将2.334g实施例2方法制备的Fe3O4-Lys-Cell分散于10mL磷酸缓冲盐溶液(pH 9)中，加入1mL浓度为0.0440mmol/L的COBE乙醇溶液，35℃，于转速为120rpm、130rpm、140rpm、150rpm、160rpm、170rpm的摇床中转化24h，考察摇床转速对还原反应的影响。转化率及对映体过剩值检测方法同实施例4。
(3)在五个50mL小型锥形瓶中，分别将0.7002g实施例2方法制备的Fe3O4-Glu-Cell分散于10mL磷酸缓冲盐溶液(pH 9)中，加入1mL浓度为0.0320mmol/L的COBE乙醇溶液，35℃，于转速为120rpm、130rpm、140rpm、150rpm、160rpm、170rpm的摇床中转化40h，考察摇床转速对还原反应的影响。转化率及对映体过剩值检测方法同实施例4。
(4)在五个50mL小型锥形瓶中，分别将1.7973g实施例2方法制备的Fe3O4-Asp-Cell分散于10mL磷酸缓冲盐溶液(pH 9)中，加入1mL浓度为0.0320mmol/L的COBE乙醇溶液，35℃，于转速为120rpm、130rpm、140rpm、150rpm、160rpm、170rpm摇床中转化48h条件下，考察摇床转速对还原反应的影响。转化率及对映体过剩值检测方法同实施例4。
表7摇床转速对还原反应的影响
Figure BDA0002279351590000121
结果表明，四种固定化细胞催化还原反应当其他条件处于最佳条件，摇床转速≦150rpm时，转化率随着摇床转速的升高而变大，直至转化完全，转化率达到一个最大值。因为在低转速时，反应瓶中的固定化细胞大都沉积在瓶底，没有很好地分散在整个体系中，细胞与底物没有充分的接触，当转速提高时，细胞在体系中的分配状态得以改善，能够均匀的分散在整个体系中。整体来说，摇床转速对转化率及R-CHBE的对映体过剩值影响不大。从经济节能因素来考虑，150rpm的转速己经达到搅拌的混合效果，因此反应过程控制摇床转速在150rpm最佳。
实施例9：摇床中重复利用次数对还原反应的影响
(1)在50mL小型锥形瓶中，将1.3078g实施例2方法制备的Fe3O4-Arg-Cell分散于10mL磷酸缓冲盐溶液(pH 9)中，加入1mL浓度为0.0440mmol/L的COBE乙醇溶液，于35℃和150rpm摇床中转化24h，转化率及对映体过剩值检测方法同实施例4。
(2)使用外加磁场回收沉淀，将回收的沉淀用乙醇和去离子水清洗10次后，保证磁性固定化细胞无底物和产物残留。之后将其重新应用于催化还原反应，在上述的转化条件下循环使用，直至转化率降低或对映体过剩值变小。另外三种固定化细胞使用类似方法进行催化反应。
表8摇床中重复利用次数对还原反应的影响
Figure BDA0002279351590000131
使用外加磁场非常容易回收磁性固定化细胞，进一步投入到循环使用过程中，由结果可知Fe3O4-Arg-Cell可重新利用11次之多，其催化活性仍未受较大影响，对底物的转化率可达到99.8％。重复使用次数未对产物的对映体过剩值产生影响。Fe3O4-Arg-Cell相比其他种类的固定化细胞，每次需要的转化时间较短，重复使用的次数较多，从经济角度考虑，最终选用Fe3O4-Arg-Cell进一步研究。
实施例10：磁场强度对还原反应的影响
(1)Fe3O4-Arg-Cell的制备：方法与实施例1相同。
(2)参见图2，将反应罐2放置在连接交流电源1的亥姆霍兹线圈3中形成的交变磁场中，可以调节磁场的强度和频率。在10mL反应瓶中，将1.3078g实施例2方法制备的Fe3O4-Arg-Cell分散于10mL磷酸缓冲盐溶液(pH 9)中，加入1mL浓度为0.0440mmol/L的COBE乙醇溶液，于35℃、磁场频率为500Hz的交变磁场中反应8小时条件下，分别考察施加的磁场强度为4、8、12、16、20Gs对还原反应的影响。转化率及对映体过剩值检测方法同实施例4。
表9磁场强度对还原反应的影响
Figure BDA0002279351590000132
交变磁场可以引起磁性固定化细胞的运动而提高催化反应速率。随着磁场强度的增加，转化率先增加后减小。当磁场强度小于12Gs时，磁性固定化细胞处于活化状态，活力随着磁场强度的增加而增加。当磁场强度大于12Gs时，对于磁性固定化细胞来说，在外部磁场的作用下，自身能够产生感应磁场，将会与外部磁场叠加共同作用于细胞，最终对细胞的催化作用产生影响。实验结果表明，最佳磁场强度为12Gs。
实施例11：在交变磁场中反应时间对还原反应的影响
(1)在图2所示的装置中放入五个30mL反应瓶，分别将1.3078g实施例2方法制备的Fe3O4-Arg-Cell分散于10mL磷酸缓冲盐溶液(pH 9)中，加入1mL浓度为0.0440mmol/L的COBE乙醇溶液，于35℃、磁场频率为500Hz和磁场强度为12Gs的交变磁场中，探究反应时间分别为2h、4h、6h、8h、10h对还原反应的影响。转化率及对映体过剩值检测方法同实施例3。
表10在交变磁场中反应时间对还原反应的影响
Figure BDA0002279351590000141
在转化体系相同的情况下，Fe3O4-Arg-Cell在摇床中将底物转化完全需要24h，而在交变磁场中只需8h便可将底物完全转化，转化率达到100％。因为磁性固定化细胞在交变磁场中呈均匀分布状态，可以与COBE溶液充分接触，无需振荡和搅拌促进传质，显著缩短反应时间，极大提高了转化效率。
实施例12：在连续流反应器中底物流速对还原反应的影响
(1)参照图3连续流反应器，将反应罐2放置在连接交流电源1的亥姆霍兹线圈3形成的交变磁场中；所述反应罐2通过恒流泵4与底物罐5连通，所述底物罐5通过恒流泵4与产物罐6连通，所述产物罐6与反应罐3连通。
(2)向反应罐中加入实施例2方法制备的1.3078gFe3O4-Arg-Cell和10mL的磷酸缓冲盐溶液(pH 9)，将1.0mL浓度为0.0440mmol/L的COBE乙醇溶液加入底物罐，通过恒流泵将底物泵入反应罐中，底物流速分别为25、30、40、50、100、200、300、400、500μL/min，以底物流速相同的速度将反应产物泵入底物罐中。反应在35℃、磁场频率为500Hz，磁场强度为12Gs的交变磁场下进行，连续反应8h。转化率及对映体过剩值检测方法同实施例4。
表11连续流反应器中不同底物流速对还原反应的影响
Figure BDA0002279351590000151
研究底物的流速是为了在合适的流速下获得较高的转化率。当底物流速由25μL/min提高到70μL/min时，其转化率从71.8％下降到54.3％，这是因为随着流速的提高，底物的停留时间降低，足够长的停留时间才能保证底物与磁性固定化细胞的充分接触。因此最佳底物流速为25μL/min。
实施例13：在交变磁场中磁性固定化细胞的重复利用
(1)向图2所示的反应罐中加入实施例2方法制备的1.3078g Fe3O4-Arg-Cell和10mL的磷酸缓冲盐溶液(pH 9)，将1.0mL浓度为0.0440mmol/L的COBE乙醇溶液加入底物罐，通过恒流泵将底物泵入反应罐中，底物流速为25μL/min将反应产物泵入底物罐中。反应在35℃、磁场频率为500Hz，磁场强度为12Gs的交变磁场下进行，连续反应8h。转化率及对映体过剩值检测方法同实施例4。
(2)使用外加磁场回收沉淀，将回收的沉淀用乙醇和去离子水清洗10次后，保证磁性固定化细胞无底物和产物残留。之后将其重新应用于催化还原反应，在上述的转化条件下循环使用，直至转化率降低或对映体过剩值变小。
表12在交变磁场中磁性固定化细胞的重复利用对还原反应的影响
Figure BDA0002279351590000152
磁性固定化细胞使用外加磁场可以容易地从反应体系中分离而重复使用。在500Hz，12Gs的交变磁场下对磁性固定化细胞的重复使用性能进行了研究。重复使用13次后转化率仍有99.8％，相比在摇床中，重复利用次数得到了提高。这是因为在交变磁场下磁性固定化细胞的微振动，促进了扩散，减少了固定化细胞的团聚以及产物在固定化细胞上的沉积。

Claims (10)

1.一种磁性固定化酵母细胞，其特征在于所述磁性固定化酵母细胞是将Fe3O4磁性颗粒与氨基酸水溶液超声分散后，使用外加磁场回收沉淀，沉淀洗涤后冻干，获得氨基酸修饰磁性纳米粒子；然后将氨基酸修饰磁性纳米粒子与酵母细胞冻干粉、磷酸缓冲盐溶液振荡混匀，获得磁性固定化酵母细胞。
2.如权利要求1所述磁性固定化酵母细胞，其特征在于所述Fe3O4磁性颗粒与氨基酸水溶液中氨基酸质量比为1:1，所述氨基酸为谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸或精氨酸中的一种，所述氨基酸修饰磁性纳米粒子与酵母细胞冻干粉质量比为1:50-300。
3.如权利要求1所述磁性固定化酵母细胞，其特征在于所述酵母细胞为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.3361。
4.如权利要求2所述磁性固定化酵母细胞，其特征在于所述氨基酸修饰磁性纳米粒子按如下方法制备：将Fe3O4磁性颗粒在超声波作用下分散到氨基酸水溶液中，磁分离获得沉淀，水洗，-65℃真空干燥，获得氨基酸修饰磁性纳米粒子；所述氨基酸水溶液浓度为0.5～1.5g/L，所述氨基酸水溶液体积用量以Fe3O4磁性颗粒重量计为800～1200mL/g。
5.如权利要求1所述磁性固定化酵母细胞，其特征在于所述Fe3O4磁性颗粒按如下方法制备：将0.1M的FeCl2水溶液、0.1M的FeCl3水溶液和去离子水按体积比3：6：2混合，在30-40℃下搅拌均匀，逐滴加入氨水至pH 10，升温至60℃反应1h；再升温至80℃熟化1h；反应结束，冷却至室温，采用外加磁场收集沉淀，水洗数次直至上清液pH为7，在-80℃预冻后放入冷冻干燥机中冻干，获得Fe3O4磁性颗粒。
6.如权利要求1所述磁性固定化酵母细胞，其特征在于所述酵母细胞冻干粉由如下方法制备得到：(1)斜面培养：将酵母细胞接种到斜面培养基，26～35℃培养4～6天得菌体斜面；所述的斜面培养基组成：麦芽汁5～15g/L，酵母粉2～4g/L，蛋白胨4～6g/L，葡萄糖7～12g/L，琼脂15～25g/L，自然pH值，溶剂为水；(2)种子培养：从菌体斜面取一环菌体转接到种子培养基，26～35℃、摇床转速为150～200r/min培养18～26h，得种子液；所述的种子培养基组成：葡萄糖26～32g/L，酵母粉2～4g/L，硫酸铵3～6g/L，无水MgSO4 0.2～0.4g/L，K2HPO4·3H2O 0.5～1.5g/L，KH2PO4 0.6～1.5g/L，自然pH值，溶剂为水；(3)发酵培养：取种子液以体积浓度10～20％的接种量接种于发酵培养基中，培养温度为26～35℃、摇床转速为150～200r/min培养18～30h，得到含有含酶菌体细胞的发酵液，将发酵液离心，取沉淀-80℃中冷冻8h，再于冷冻干燥机中冻干，得到酵母细胞冻干粉；所述发酵培养基组成：葡萄糖26～32g/L，酵母粉2～4g/L，硫酸铵3～6g/L，无水MgSO4 0.2～0.4g/L，K2HPO4·3H2O 0.5～1.5g/L，KH2PO4 0.6～1.5g/L，自然pH值，溶剂为水。
7.一种权利要求1磁性固定化酵母细胞在不对称还原4-氯-3-羰基丁酸乙酯制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用，其特征在于所述的应用以4-氯-3-羰基丁酸乙酯乙醇溶液为底物，以pH5-9磷酸缓冲盐溶液为反应介质，以磁性固定化酵母细胞为催化剂构成转化体系，在20-45℃条件下进行还原反应，反应结束后，使用外加磁场回收沉淀，从转化液中分离提取(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述底物浓度为0.0067-0.0555mmol/L，所述底物体积用量以催化剂重量计为0.4～1.5mL/g；所述缓冲液体积用量以催化剂重量计为3～15mL/g。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述还原反应在摇床中进行，反应条件为：将磁性固定化酵母细胞加入4-氯-3-羰基丁酸乙酯乙醇溶液中，在20-45℃、50-250rpm条件下进行还原反应，反应结束后，使用外加磁场回收沉淀，从转化液中分离提取(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。
10.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述还原反应在交变磁场中进行分批或连续还原反应，所述分批还原方法为：在磁场频率为500Hz、磁场强度为4-20Gs的交变磁场中，将磁性固定化酵母细胞加入4-氯-3-羰基丁酸乙酯乙醇溶液中，在20-45℃条件下进行还原反应，反应结束后，使用外加磁场回收沉淀，从转化液中分离提取(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯；
所述连续还原反应方法为：在磁场频率为500Hz、磁场强度为4-20Gs的交变磁场中，以25-500μL/min的速度流加4-氯-3-羰基丁酸乙酯乙醇溶液至磁性固定化酵母细胞中，同时以25-500μL/min的速度将生成的产物回流加入4-氯-3-羰基丁酸乙酯乙醇溶液中，在20-45℃条件下进行连续还原反应，反应结束后，使用外加磁场回收沉淀，从转化液中分离提取(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。
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