CN112430591B - 纳米高分子-双酶复合物及其制备与在(r)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯合成中的应用 - Google Patents

纳米高分子-双酶复合物及其制备与在(r)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯合成中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种纳米高分子‑双酶复合物及其制备与在(R)‑2‑羟基‑4‑苯基丁酸乙酯合成中的应用，以葡萄糖脱氢酶和来源于Saccharomyces cerevisiae CGMCC No.3361的羰基还原酶为双酶，以聚丙烯酸为载体，以1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺为交联剂，以磷酸盐缓冲液为反应介质，在20℃‑40℃、180‑220rpm摇床中混合搅拌10‑60min，获得纳米高分子‑双酶复合物。本发明高分子‑双酶复合物用于油水两相中羰基化合物的不对称还原反应，可以同时实现辅酶再生，该方法可以提高催化剂的稳定性，延长催化剂使用寿命，实现重复利用，提高生产效率。

Description

纳米高分子-双酶复合物及其制备与在(R)-2-羟基-4-苯基丁 酸乙酯合成中的应用
(一)技术领域
本发明涉及一种(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的制备，特别涉及到使用聚丙烯酸高分子作为载体共固定化葡萄糖脱氢酶和来源于Saccharomyces cerevisiae CGMCCNo.3361的羰基还原酶，并将其用于2-氧代-4-苯基丁酸乙酯的不对称还原制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯。
(二)背景技术
(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯(Ethyl(R)-2-hydroxy-4-phenylbutyrate，R-HPBE)，CAS号90315-82-5，分子式C12H16O3，分子量208.25，密度为1.075g/mL，沸点为212℃，不溶于水，易溶于有机溶剂。R-HPBE是合成普利类药物的关键手性中间体，它在合成血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)中具有无可替代的作用。由于R-HPBE在生产治疗高血压、心血管疾病的普利类药物的重要性，故经济、高效的R-HPBE制备方法一直是国内外研究的热点之一。不对称还原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯(OPBE)可以制备R-HPBE。
高血压病是一种由于血管神经调节障碍而升高动脉压力的慢性疾病，随着生活水平的提高，中、老年人已成为该病的多发人群，高血压影响血管脆性，过度时会引起血管破裂等问题，并引发心脑血管疾病，肾脏病、眼底疾病、神经系统疾病等，更为严重的是高血压还与高血糖、高血黏度、高血脂等疾病紧密联系在一起，造成全身各组织器官的慢性损害，导致身体脏器功能丧失，严重威胁人们的生命与健康。赖诺普利、喹那普利、雷米普利、西拉普利等普利类药物通过切断肾素-血管紧张素-醛固酮系统，阻断血管紧张素Ⅱ的产生而扩张血管、降低血压，是一类安全有效的降压药。由于R-HPBE在此类药物合成中的重要性，故其制备方法在国内外引起众多关注，近几十年来不断有人致力于新的R-HPBE的制备技术路线研发，以期获得一条经济、原子利用率高的绿色合成工艺。
目前有关R-HPBE的合成方法可分为生物法和化学法，这两种方法又都包括拆分法和合成法。化学拆分法是拆分其相应外消旋体2-羟基-4-苯基丁酸，再酯化为R-HPBE，所用拆分剂为手性有机胺类化合物，化学拆分法存在的问题有：以光学纯苯乙胺类衍生物作拆分剂，由于其价格昂贵，实用价值不大；而氯霉素中间体拆分收率较低(小于50％)。传统的化学合成法往往步骤繁多，贵金属催化剂价格较贵，环境污染严重，产物对映体过剩值不高，且催化反应需要很高的氢气压力，对设备要求高。而生物法因其光学选择性高、反应条件温和、环境友好等特性，成为目前合成R-HPBE最有效的方法之一。其中生物拆分法通过拆分外消旋体制备手性R-HPBE的理论收率仅50％，且产物为混合物，不易分离，与生物合成法制备R-HPBE相比处于劣势。
生物合成法包括全细胞不对称还原法和还原酶转化法。使用全细胞微生物或分离的酶作为生物催化剂进行生物催化具有一些优缺点。全细胞生物催化剂易于获得，价格相对便宜且更稳定，但其催化反应会受到细胞中其他会产生副产物的代谢反应的影响，从而影响目标产物的分离和纯化。分离的酶尽管价格昂贵，但催化效率高，且具有高度选择性。通过酶催化获得的产物便于分离和纯化。用于不对称还原羰基化合物以制备手性醇的羰基还原酶(CBR)需要辅酶作为氢供体。鉴于辅酶(如NADH和NADPH)的高昂成本，必须将其从氧化形式转化为可循环利用。尽管微生物转化方法可以实现辅酶的原位再生，但底物处理量非常少，不足以大规模生产。如果辅酶可以在反应体系中直接原位再生，将大大提高转化率。根据对辅酶再生的需求，添加有助于辅酶再生的葡萄糖脱氢酶(GDH)，为不对称还原反应提供连续的辅酶供氢体。
传统的酶催化反应在水相中进行，而大量的有机底物难溶于水甚至在水相中不稳定。如果在单一的水相中进行酶催化，难溶性的有机底物与酶接触的机会很小，且有机底物和产物对酶有毒害作用，容易降低酶的活性，因而转化率偏低。解决这个问题的直接方法可以采用有机相-水相两相体系进行生物催化。酶蛋白分子既具有亲水性又有疏水性结构，易于在油水界面聚集并自组装形成特定排列的结构实现油水界面的催化反应。为了提高转化率，人们应用油水两相体系的生物催化来合成手性醇，酶在水相中可以保持活力和稳定性，底物和产物分散在有机相中，催化反应发生在油水界面，通过界面生物催化制备手性醇。有机相-水相双相催化是一类环境友好的方法，它提供了将催化剂和底物/产物均质化为两个独立且不混溶的相的机会，从而易于分离。尽管油水两相体系有许多优点，但有机相对酶的活力和稳定性同样存在负面影响，因此人们期待通过酶的分子改造来提高酶的活性和稳定性。
由于聚合物的柔韧性和具有的官能团，聚合物-酶的共结合结构吸引了人们的关注。一些常规的混合结构或自组装聚合物，如壳聚糖，琼脂糖，聚丙烯酰胺和聚丙烯亚胺，已广泛用于蛋白质吸附，生物分子固定，药物释放控制等生物医学领域。在这些功能性聚合物中，聚丙烯酸(PAA)由于其分散性和容量特性而为水溶性生物相容性聚合物。使用位点特异性附着策略，可以将单酶与PAA端基缀合。单酶也可以随机偶联在PAA骨架内，以使酶上的氨基与PAA上的羧基发生化学反应。
本发明通过两种不同的合成策略将高分子PAA与两种酶蛋白分子(CBR和GDH)结合实现双酶共固定化形成纳米高分子-双酶复合物(BECs)，并将BECs用于油水两相体系不对称转化前手性底物OPBE制备血管紧张素转换酶抑制剂合成中的重要手性关键体R-HPBE，实现辅酶的原位再生，并最大限度地提高产物的光学纯度和底物转化率。
本发明首次通过理性设计将具有还原能力的CBR和有助于辅酶再生的GDH共固定化于高分子PAA骨架上。蛋白质与高分子具有不同的功能性，结合形成的蛋白质高分子复合物具有两者的双重特性，拓宽了两种材料的应用效率和范围。由于高分子的加入，蛋白质高分子复合物能够延长蛋白质的循环半衰期、提高溶解度、增加稳定性。以PAA为骨架通过共价结合的方法将CBR和GDH共固定化，有效地防止了使用过程中酶的脱离和损失，提高了高温时酶的活力和稳定性，且双酶共固定化可增加反应的局部浓度，使多步反应在同一个反应器中迅速完成，并可在两相体系中实现辅酶的原位再生，提高催化效率。本发明的研究工作为制备具有辅酶再生能力的高效生物催化剂奠定理论基础，通过制备纳米高分子-双酶复合物为提高生物转化率开辟新路径。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种纳米高分子-双酶复合物及其在(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯合成中的应用，本发明采用通用性和模块化的方法将葡萄糖脱氢酶和来源于Saccharomyces cerevisiae CGMCC No.3361的羰基还原酶与聚丙烯酸结合实现双酶共固定化制备纳米高分子-双酶复合物。聚丙烯酸PAA骨架中的羧基与酶分子中的氨基共价结合起到对酶蛋白分子的修饰作用，进一步提高酶在油水界面的活性和稳定性，提高生物转化率。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种纳米高分子-双酶复合物，所述纳米高分子-双酶复合物按如下方法制备：以羰基还原酶(CBR)和葡萄糖脱氢酶(GDH)为双酶，以聚丙烯酸(PAA)为载体，以1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)为交联剂，以磷酸盐缓冲液(PB)(10mM，pH7.4)为反应介质，在20℃-40℃(优选30℃)、180-220rpm(优选200rpm)摇床中混合搅拌10-60min(优选30min)，获得纳米高分子-双酶复合物；所述羰基还原酶来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.3361。
进一步，所述羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶质量比为1：0.5-1(优选1：0.7)；所述羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶总量与聚丙烯酸质量比为1：1-5(优选1：3.75)；羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶总量与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺质量比为1：10-20(优选1：12)。
进一步，所述纳米高分子-双酶复合物按如下方法制备：将聚丙烯酸(PAA)溶液与羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶，在20℃-40℃、180-220rpm摇床中混合搅拌10-60min(优选30℃、200rpm搅拌30min)，加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和10mM，pH 7.4磷酸盐缓冲液，在20℃-40℃、180-220rpm摇床中混合搅拌10-60min(优选30℃、200rpm搅拌30min)，加入80-120倍体积10mM，pH 7.4磷酸盐缓冲液，25kDa透析膜透析3次，每次5h，以除去未反应的EDC和EDC-脲副产物，取截留液，获得纳米高分子-双酶复合物；所述聚丙烯酸(PAA)溶液是将0.02g/mL聚丙烯酸水溶液与等体积10mM，pH 7.4磷酸盐缓冲液混合制成。
进一步，所述纳米高分子-双酶复合物按如下方法制备：(1)将聚丙烯酸溶液与10mM，pH 7.4磷酸盐缓冲液混合，加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，在20℃-40℃、180-220rpm摇床中混合搅拌10-60min(优选30℃、200rpm搅拌30min)，加入羰基还原酶的10mM，pH 7.4磷酸盐缓冲液，在20℃-40℃、180-220rpm摇床中混合搅拌1-6h(优选30℃、200rpm搅拌2h)，加入80-120倍体积10mM，pH 7.4磷酸盐缓冲液，25kDa渗析膜渗析3次，每次5h，取截留液，获得羰基还原酶-聚丙烯酸共轭物；所述羰基还原酶与聚丙烯酸质量比为1：2-5(优选1:3.2)；所述羰基还原酶与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺质量比为1：10-20(优选1:10)；所述聚丙烯酸溶液是将0.02g/mL聚丙烯酸水溶液与等体积10mM，pH 7.4磷酸盐缓冲液混合制成；(2)将聚丙烯酸溶液与10mM，pH 7.4磷酸盐缓冲液混合，加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，在20℃-40℃、180-220rpm摇床中混合搅拌10-60min(优选30℃、200rpm搅拌30min)，加入葡萄糖脱氢酶的10mM，pH 7.4磷酸盐缓冲液在20℃-40℃、180-220rpm摇床中混合搅拌1-6h(优选30℃、200rpm搅拌2h)，加入80-120倍体积10mM，pH 7.4磷酸盐缓冲液，25kDa渗析膜渗析3次，每次5h，取截留液，获得葡萄糖脱氢酶-聚丙烯酸共轭物；所述葡萄糖脱氢酶与聚丙烯酸质量比为1：2-6(优选1:4.5)；所述葡萄糖脱氢酶与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺质量比为1：10-20；所述聚丙烯酸溶液是将0.02g/mL聚丙烯酸水溶液与等体积10mM，pH 7.4磷酸盐缓冲液混合制成；(3)将羰基还原酶-聚丙烯酸共轭物、葡萄糖脱氢酶-聚丙烯酸共轭物与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺混合，在20℃-40℃、180-220rpm摇床中混合搅拌10-60min(优选30℃、200rpm搅拌30min)，加入80-120倍体积10mM，pH 7.4磷酸盐缓冲液，25kDa渗析膜渗析3次，每次5h，取截留液，获得纳米高分子-双酶复合物；所述羰基还原酶-聚丙烯酸共轭物与葡萄糖脱氢酶-聚丙烯酸共轭物体积比为1:0.5-1.5(优选1:1)；所述羰基还原酶-聚丙烯酸共轭物与葡萄糖脱氢酶-聚丙烯酸共轭物总质量与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺质量比为1：0.5-1(优选1:0.74)。
本发明还提供一种所述纳米高分子-双酶复合物在不对称还原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯(OPBE)制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯(R-HPBE)中的应用，所述的应用以2-氧代-4-苯基丁酸乙酯(OPBE)为底物，以pH 7.4、10mM磷酸缓冲盐溶液为反应介质，以d-葡萄糖为辅助底物，以NADP为辅酶，以纳米高分子-双酶复合物为催化剂构成转化体系，在20-45℃、50-250rpm条件下进行还原反应8～40h(优选35℃、180rpm、40h)，反应液分离纯化，获得(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯；所述底物加入终浓度为300～700mmol/L(优选485-533mmol/L)；所述d-葡萄糖加入终浓度为0.05-0.15M(优选0.1M)；所述NADP加入终浓度为0.03-0.07mM(优选0.05mM)；所述催化剂加入终浓度为0.1-0.6mg/mL(优选2-S为0.25mg/ml，2-P为0.458mg/ml)。
进一步，所述反应介质为pH 7.4、10mM磷酸缓冲盐溶液与有机溶剂的混合；所述pH7.4、10mM磷酸缓冲盐溶液与有机溶剂体积比为1-5：3，优选1:1；所述有机溶剂为正己烷、邻苯二甲酸二丁酯、苯、甲苯或正庚烷，优选邻苯二甲酸二丁酯。
进一步，当反应介质为pH 7.4、10mM磷酸缓冲盐溶液时，底物加入终浓度为485mmol/L；当反应介质为pH 7.4、10mM磷酸缓冲盐溶液与有机溶剂的混合时，底物加入终浓度为533mmol/L。
进一步，所述反应液分离纯化方法为：反应结束后，于反应液中加入等体积乙酸乙酯萃取，萃取液用无水硫酸钠干燥后挥发掉乙酸乙酯获得R-HPBE。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
传统的酶催化反应在水相中进行，而大量的有机底物难溶于水，如果在单一的水相中进行酶催化，难溶性的有机底物与酶接触的机会很小，因而转化率偏低。为了提高转化率，人们将酶分散在油水两相体系，酶分子结构既含有亲水基团又含有疏水基团，在油水两相体系中酶分子迅速自组装于油水界面，实现界面催化。在油水界面催化过程中，酶分子的立体空间结构与在水相中不同，因而酶在油水两相催化的活力通常低于水相催化。同时，有机溶剂和底物与酶分子接触也会导致酶分子结构的变化，抑制酶活的充分发挥。为了提高酶分子在油水两相的催化效率和稳定性，进而提高生产效率，本发明使用高分子聚丙烯酸对酶蛋白分子进行修饰改造。聚丙烯酸PAA骨架中的羧基与酶分子中的氨基共价结合形成高分子-酶复合物。为了进一步提高转化率，本发明采用辅酶再生的方法，在反应体系中添加辅酶的同时，添加有助于辅酶再生的葡萄糖脱氢酶来促进辅酶的再生，为不对称还原反应提供源源不断的辅酶供氢体。基于辅酶再生的需求，本发明将葡萄糖脱氢酶和羰基还原酶共同结合于聚丙烯酸高分子骨架上形成高分子-双酶复合物，将其用于油水两相中羰基化合物的不对称还原反应，可以同时实现辅酶再生，该方法可以提高催化剂的稳定性，延长催化剂使用寿命，实现重复利用，提高生产效率。
表1有机-水相两相体系和单一水相还原反应的对比
Figure BDA0002794597830000061
(四)附图说明
图1为纳米高分子-双酶复合物的两种不同合成路线。
图2为纳米高分子-双酶复合物2-S的透射电子显微镜图。
图3为酶(泳道从左到右分别为GDH，CBR，GDH-PAA，CBR-PAA，2-P，2-S)的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳图(SDS-PAGE)。
图4为酶(GDH，CBR，GDH-PAA，CBR-PAA，2-P，2-S)的圆二色谱图(CD)。
图5为纳米高分子-双酶复合物在有机-水相两相体系中不对称还原OPBE反应机制。
图6为气相色谱图，A为S-HPBE标准品，B为R-HPBE标准品，C为OPBE标准品，D为样品。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明实施例所用羰基还原酶(CBR)来自于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CGMCC No.3361，该菌株保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，已在专利申请CN101709271B中公开。本发明实施例所用羰基还原酶(CBR)采用文献(解晴,吴坚平,林立,徐刚,杨立荣.拟热带假丝酵母中羰基还原酶的纯化及其酶学性质研究.高校化学工程学报，2009,23(1)：92-98.)2.3的方法从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCCNo.3361分离提取：超声波细胞破碎Saccharomyces cerevisiae CGMCC No.3361细胞、硫酸铵分级沉淀、DEAE sepharose FF阴离子交换层析和Blue sepharose 6FF亲和层析，获得CBR的比活力为21.4U/mg。
所述葡萄糖脱氢酶(GDH)酶活30U/mg，购于上海生工生物工程有限公司。
本发明实施例所用PB缓冲液是指10mM，pH 7.4磷酸盐缓冲液。
实施例1：顺序合成纳米高分子-双酶复合物2-S
合成路线参照图1中A，具体为：
(1)PAA溶液：准确称取0.8mg聚丙烯酸(PAA，Mv＝450000g mol-1)，溶于40μL蒸馏水中制备0.02g/mL的PAA储备溶液(40μL)，调pH至7。将40μL PAA储备溶液与40μL的PB缓冲液混合均匀，获得0.01g/mL的PAA溶液80μL。
(2)将上述0.01g/mL的PAA溶液80μL和0.124mg的CBR和0.089mg的GDH在30℃、200rpm摇床中混合搅拌30min，获得PAA混合酶液。
(3)将2.585mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)加入到步骤(2)PAA混合酶液中，再加入PB缓冲液使溶液总体积1mL，在30℃、200rpm搅拌条件下交联30min，将交联混合物加入100mL PB缓冲液中，使用25kDa渗析膜渗析3次，每次5h，以除去未反应的EDC和EDC-脲副产物，取截留液，获得纳米高分子-双酶复合物3mg，记为BECs(简称2-S)。2-S中每种酶(CBR和GDH)的终酶活均为2.5U(1U定义为1min能转化1umol底物的酶量)。制备的2-S纳米高分子-双酶复合物的粒径范围为50-70nm(见图2中A)。经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及圆二色谱(J-815；JASCO,Japan)验证2-S的合成是成功的(见图3、图4)。
实施例2：并行合成纳米高分子-双酶复合物2-P
参照图1中B，使用并行法合成纳米高分子-双酶复合物2-P，具体为：
(1)CBR-PAA共轭物：将20μL、0.02g/mL的PAA储备溶液(制备方法如实施例1所示)与等体积的PB缓冲液混合，加入1.292mg的EDC，在30℃、200rpm摇床中混合搅拌30min后，滴加50μL CBR溶液(由0.124mg CBR溶于PB缓冲液所制)，并搅拌2h，加入50mL的PB缓冲液，使用25kDa渗析膜渗析3次，每次5h，取截留液，获得CBR-PAA共轭物1.8mg。
(2)GDH-PAA缀合物：将步骤(1)中CBR溶液中CBR替换为0.089mg的GDH，其他操作相同，获得GDH-PAA缀合物1.70mg。
(3)纳米高分子-双酶复合物：将CBR-PAA共轭物1.8mg，GDH-PAA缀合物1.70mg混合，加入2.585mg EDC构成1mL的反应体系，在30℃、200rpm摇床中混合搅拌30min，加入100mL PB缓冲液中，使用25kDa渗析膜渗析3次，每次5h，以除去未反应的EDC和EDC-脲副产物，取截留液，获得纳米高分子-双酶复合物(记为BECs，简称2-P)5.5mg。2-P中每种酶(CBR和GDH)的终酶活均为2.5U。制备的2-P粒径范围为50-70nm(见图2中B)。经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及圆二色谱验证2-P的合成是成功的(见图3、图4)。
实施例3：单一水相中底物浓度对还原反应的影响
将实施例1和2中制备的两种BECs(3mg 2-S或5.5mg 2-P)添加到含有终浓度0.05mM NADP，终浓度0.1M d-葡萄糖，以及终浓度分别为388mM、436mM、485mM、533mM、582mM和630mM的OPBE的PB缓冲液中，构成反应体系总体积12mL。在35℃，180rpm的恒温摇床中还原反应40h，反应结束后，于反应液中加入等体积乙酸乙酯萃取，萃取液(上层)用无水硫酸钠干燥后气相色谱检测获得的产物情况，结果见表2。
采用Shimadzu GC-2014气相色谱仪分析底物转化率和产物R-HPBE对映体过剩值，转化率定义为转化后的底物浓度与初始底物浓度的比率。通过配备有Agilent CP7502 J&WCP-Chirasil-Dex CB手性色谱柱(Machery-Nagel；25m×0.25mm×0.25mm)的气相色谱(GC)对样品进行分析。进样口、色谱柱和FID检测器温度分别为250、130和250℃。分流比为1：15。流速为2mL/min。OPBE、R-HPBE和S-HPBE的保留时间分别为20.898、27.948和28.923分钟。使用公式(1)和(2)计算OPBE的转化率(X)和HPBE的对映体过剩值(eep)。
Figure BDA0002794597830000091
Ms和Mp是底物和产物的分子量。P代表反应结束时产物的质量，Q代表底物的初始质量。
Figure BDA0002794597830000092
CR和CS代表R-HPBE和S-HPBE的浓度。
表2单一水相中不同底物浓度对还原反应的影响
Figure BDA0002794597830000093
在该实验中，研究了OPBE浓度(388-630mM)对还原反应的影响。表2中显示高浓度的OPBE对酶有一定的毒性作用，但是OPBE浓度太低会降低反应效率。在OPBE的浓度从388mM增加到485mM过程中，所有底物仍可以完全转化为HPBE。当浓度高于485mM时，转化率开始呈现下降趋势。2-S和2-P催化533mM OPBE时，转化率可分别达到94.17％和87.08％。当OPBE浓度超过485mM时，以2-P为催化剂的R-HPBE的对映体过剩值略有降低，而以2-S作为催化剂仍保持最高值(99.9％)。两种类型的纳米BECs(2-P和2-S)的结构和制备工艺不同可能导致对底物浓度的耐受性不同。显然，对于2-S和2-P而言，最合适的OPBE浓度均为485mM。
实施例4：单一水相中摇床转速对还原反应的影响
将终浓度485mM底物OPBE，终浓度0.1M辅助底物d-葡萄糖，终浓度0.05mM辅酶NADP和纳米BECs(3mg 2-S或5.5mg 2-P)添加到装有PB缓冲液的反应瓶中，反应体系的总体积保持在12mL。分别在不同转速(150rpm，160rpm，170rpm，180rpm，190rpm)的恒温(35℃)摇床中反应40h。反应结束后，采用实施例3方法检测底物转化率和R-HPBE对映体过剩值(％)。
表3单一水相中摇床转速对还原反应的影响
Figure BDA0002794597830000094
Figure BDA0002794597830000101
摇床的转速会影响反应体系中底物和产物的扩散和分布，这最终将影响摩尔转化率和产物的构型。表3中显示当恒温振动器速度小于180rpm时，转化率随着振动器速度的增加而增加，进而导致摩尔转化率相应增加，表明在这种情况下传质是反应的主要决定因素。如果摇床速度进一步提高到180rpm以上，转化率和R-HPBE的对映体过剩值都将保持不变。因此，对于两种纳米BECs(2-S和2-P)而言，180rpm被认为是最合适的摇床速度。
实施例5：有机-水相两相体系中有机溶剂对还原反应的影响
将实施例1和2中制备的两种纳米BECs(3mg 2-S或5.5mg 2-P)分散在PB缓冲液中形成6mL水相，然后将等体积的6mL不同种类的有机溶剂(正己烷，邻苯二甲酸二丁酯，苯，甲苯，正庚烷)分别加入水相中形成五种两相体系，另外分别加入终浓度533mM OPBE，终浓度0.05mM NADP，终浓度0.1M d-葡萄糖，构成反应体系总体积12mL，在35℃、120rpm的振荡器中还原40小时。反应结束后加入等体积的乙酸乙酯充分混匀，8000rpm离心10分钟分离有机相。有机相经无水Na2SO4干燥，采用实施例3方法检测底物转化率及R-HPBE对映体过剩值(％)，结果见表4。
表4有机-水相两相体系中有机溶剂对还原反应的影响
Figure BDA0002794597830000102
选择合适的有机溶剂原位萃取剂对于有机-水双相系统非常重要。本实施例探讨了在由不同有机溶剂和PB组成的双相体系中的生物催化作用，其结果如表4所示。有机溶剂的logP(疏水常数)是评估其对酶催化剂影响的重要常数。它是正丁醇/水系统中溶剂分布常数的对数值。实验发现当邻苯二甲酸二丁酯(1ogP＞5)用作有机相时，摩尔转化率和R-HPBE的对映体过剩值相比其他四种有机溶剂而言更高。其他有机溶剂(正己烷、苯、甲苯、正庚烷)用作有机相时转化率不高的原因可能是，它们对酶的毒害作用使酶失去了大部分的活性，进而影响了酶的催化性能。根据实验结果，选择具有良好生物相容性和萃取性能的邻苯二甲酸二丁酯作为最佳有机相以进行以下研究。
实施例6：有机-水相两相体系中相体积比对还原反应的影响
将实施例1和2中制备的纳米BECs(3mg 2-S或5.5mg 2-P)分散在不同体积(3、4.8、6、6.8、7.5mL)PB缓冲液中形成水相。之后，相应加入不同体积(9、7.2、6、5.2、4.5mL)的邻苯二甲酸二丁酯以使有机相与水相的体积比分别为1：3、2：3、3：3、4：3、5：3构成两相体系，再加入终浓度533mM OPBE，终浓度0.05mM NADP和终浓度0.1M d-葡萄糖，构成反应体系总体积12mL。将上述具有不同相体积比的反应瓶置于恒温振荡器(35℃，120rpm)中反应40h，然后用等体积的乙酸乙酯萃取。有机相经无水Na2SO4干燥，采用实施例3方法检测底物转化率和R-HPBE的对映体过剩值，结果见表5。
表5有机-水相两相体系中相体积比对还原反应的影响
Figure BDA0002794597830000111
通常，有机溶剂和水的体积比对酶催化的反应影响较大。比例过大将导致严重的酶失活。但是，当相体积比例太低时，将无法实现增加底物处理能力并减少底物和产物对酶催化反应的抑制的目的。本实施例研究了邻苯二甲酸二丁酯-PB两相反应体系中有机溶剂和PB的体积比(0％-62.5％)对摩尔转化率和R-HPBE的对映体过剩值的影响。从表5可以看出，相体积比(Vo/Va)对底物处理能力有显著影响，而对R-HPBE的对映体过剩值影响很小。随着Vo/Va在一定范围内(≤1)的增加，摩尔转化率呈现缓慢增加的趋势，并且转化率处于较高水平。当有机溶剂的比例继续增加时，转化率严重下降。因此，选择50％的有机溶剂比例(Vo/Va为1：1)作为最佳体积比，以进行进一步的研究。
实施例7：有机-水相两相体系中反应温度对还原反应的影响
将实施例1和2中制备的纳米BECs(3mg 2-S或5.5mg 2-P)分散在12mL的邻苯二甲酸二丁酯与PB缓冲液体积比1:1的两相体系中，再加入终浓度533mM OPBE，终浓度0.05mMNADP和终浓度0.1M d-葡萄糖，构成反应体系总体积12mL，分别置于恒温振荡器(120rpm)中在20℃、25℃、30℃、35℃和40℃反应40h，然后用等体积的乙酸乙酯萃取，离心(8000rpm，10min)以获得分层的水相和有机相。有机相经无水Na2SO4干燥，采用实施例3方法检测底物转化率和R-HPBE的对映体过剩值，结果见表6所示。
表6有机-水相两相体系中反应温度对还原反应的影响
Figure BDA0002794597830000121
在酶促反应中，温度对生物催化剂的活性和立体选择性产生不同程度的影响。在最佳反应温度下，生物催化剂可以表现出高催化活性。本实验研究了在20-40℃范围内OPBE的转化率和R-HPBE的对映体过剩值的变化。表6表明，当温度从20℃升至35℃时，转化率显着增加至稳定的最大值(100％)。随着温度进一步升高，转化率开始下降。转化率受温度影响的变化规律同时适用于2-S和2-P催化的还原反应。这种变化规律可能是由于过高的温度破坏了酶的空间结构，酶活性的降低导致转化率的降低。R-HPBE的对映体过剩值不会随温度的变化而显著变化。表6表明，当反应温度为35℃时，摩尔转化率和R-HPBE的对映体过剩值分别达到100％和99.9％。因此，以2-S或2-P为催化剂的还原反应的最佳温度为35℃。
实施例8：有机-水相两相体系中底物浓度对还原反应的影响
向12mL的邻苯二甲酸二丁酯与PB缓冲液体积比1:1的两相体系中，添加质量分别为3mg的2-S或5.5mg的2-P，再加入终浓度分别为388mM,436mM,485mM,533mM,582mM和630mMOPBE，终浓度0.05mM NADP和终浓度0.1M d-葡萄糖后，将六种反应瓶置于振荡器(35℃，120rpm)中反应40h。还原反应结束时，反应溶液用等体积的乙酸乙酯萃取。离心(8000rpm，10min)以获得分层的水相和有机相。有机相经无水Na2SO4干燥，采用实施例3方法检测底物转化率和R-HPBE的对映体过剩值，结果见表7。
表7有机-水相两相体系中底物浓度对还原反应的影响
Figure BDA0002794597830000122
底物浓度将影响在有机相和水相之间的界面上BECs的催化效率。在不使用底物进料的情况下，本研究考察了不同初始底物浓度(388-630mM)对以2-S和2-P为生物催化剂的双相系统中不对称还原的影响。表7显示，当底物浓度从388mM增加到533mM时，转化率一直稳定在最高值(100％)。如若进一步增加底物浓度，转化率将急剧下降。高底物浓度(>533mM)可能导致底物在水相中过度积聚，进而抑制了反应。实验发现R-HPBE的对映体过剩值几乎不受底物浓度的影响。因此，对于邻苯二甲酸二丁酯-PB(1：1)双相体系中以2-P和2-S为催化剂的还原反应，最合适的底物浓度为533mM。
实施例9：有机-水相两相体系中摇床转速对还原反应的影响
向12mL的邻苯二甲酸二丁酯与PB缓冲液体积比1:1的两相体系中，添加质量分别为3mg的2-S或5.5mg的2-P，再加入终浓度533mM OPBE，终浓度0.05mM NADP和终浓度0.1Md-葡萄糖后，分别置于振荡器(80rpm、100rpm、120rpm、150rpm、180rpm)中，35℃反应40h。还原反应结束时，反应溶液用等体积的乙酸乙酯萃取。离心(8000rpm，10min)以获得分层的水相和有机相。有机相经无水Na2SO4干燥，采用实施例3方法检测底物转化率和R-HPBE的对映体过剩值，结果见表8。
表8有机-水相两相体系中摇床转速对还原反应的影响
Figure BDA0002794597830000131
恒温振荡器的适宜转速可以使底物和产物更充分地溶解在邻苯二甲酸二丁酯中，并提高物料转移效率。在此实验中，在其他条件保持不变的情况下，探索了80-180rpm范围内的摇床转速对转化率和R-HPBE的对映体过剩值的影响。在80-120rpm的范围内，转化率不断提高，直到达到最大值(100％)，然后随着转速的提高保持稳定。当振荡器速度低于120rpm时，可能会导致在油水界面处的生物催化剂纳米BECs(2-S和2-P)与有机底物之间的接触不充分。使用2-P或2-S作为催化剂，最佳振荡器速度都为120rpm。2-P或2-S可以在120rpm的反应体系中获得最大的催化活性(见图6)。
实施例10：有机-水相两相体系中辅酶再生能力的探究
向12mL的邻苯二甲酸二丁酯与PB缓冲液体积比1:1的两相体系中，添加1.7mgGDH-PAA、1.8mg CBR-PAA、纳米BECs(3mg 2-S或5.5mg 2-P)，再加入终浓度533mM OPBE，终浓度0.05mM NADP和终浓度0.1M d-葡萄糖后，分别置于振荡器(35℃，120rpm)中反应40h。还原反应结束时，反应溶液用等体积的乙酸乙酯萃取。离心(8000rpm，10min)以获得分层的水相和有机相。有机相经无水Na2SO4干燥，采用实施例3方法检测底物转化率和R-HPBE的对映体过剩值，结果见表9。
表9有机-水相两相体系中辅酶再生能力研究结果
Figure BDA0002794597830000141
在邻苯二甲酸二丁酯-PB(1：1)双相体系中，使用CBR-PAA、GDH-PAA和双酶-PAA共轭物(2-S和2-P)作为催化剂，以研究辅酶的再生能力。在以GDH-PAA为催化剂的反应体系中未检测到产物R-HPBE。此外，在以CBR-PAA作为催化剂的反应中获得的R-HPBE的量(349mM)明显低于在以双酶-PAA共轭物2-S或2-P)作为催化剂的反应中获得的R-HPBE的量(533mM)。结果表明，与CBR-PAA相比，将CBR和GDH共固定在高分子PAA上的总转化率提高了34.52％(表2)。结合对反应机理的分析(图5)，纳米BECs(2-S或2-P)具有辅酶再生的能力，这有助于提高转化率。

Claims (10)

1.一种纳米高分子-双酶复合物，其特征在于所述纳米高分子-双酶复合物按如下方法制备：以羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶为双酶，以聚丙烯酸为载体，以1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺为交联剂，以磷酸盐缓冲液为反应介质，在20℃-40℃、180-220rpm摇床中混合搅拌10-60min，获得纳米高分子-双酶复合物；所述羰基还原酶来源于Saccharomycescerevisiae CGMCC No.3361。
2.如权利要求1所述纳米高分子-双酶复合物，其特征在于所述羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶质量比为1：0.5-1；所述羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶总量与聚丙烯酸质量比为1：1-5；羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶总量与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺质量比为1：10-20。
3.如权利要求1所述纳米高分子-双酶复合物，其特征在于所述纳米高分子-双酶复合物按如下方法制备：将聚丙烯酸溶液与羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶，在20℃-40℃、180-220rpm摇床中混合搅拌10-60min，加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和10mM，pH7.4磷酸盐缓冲液，在20℃-40℃、180-220rpm摇床中混合搅拌10-60min，加入10mM，pH 7.4磷酸盐缓冲液，采用25kDa透析膜透析，取截留液，获得纳米高分子-双酶复合物；所述聚丙烯酸溶液是将0.02g/mL聚丙烯酸水溶液与等体积10mM，pH 7.4磷酸盐缓冲液混合制成。
4.如权利要求1所述纳米高分子-双酶复合物，其特征在于所述纳米高分子-双酶复合物按如下方法制备：(1)将聚丙烯酸溶液与10mM，pH 7.4磷酸盐缓冲液混合，加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，在20℃-40℃、180-220rpm摇床中混合搅拌10-60min，加入羰基还原酶的10mM，pH 7.4磷酸盐缓冲液，在20℃-40℃、180-220rpm摇床中混合搅拌1-6h，加入10mM，pH 7.4磷酸盐缓冲液，采用25kDa渗析膜渗析，取截留液，获得羰基还原酶-聚丙烯酸共轭物；所述羰基还原酶与聚丙烯酸质量比为1：2-5；所述羰基还原酶与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺质量比为1：10-20；所述聚丙烯酸溶液是将0.02g/mL聚丙烯酸水溶液与等体积10mM，pH 7.4磷酸盐缓冲液混合制成；(2)将聚丙烯酸溶液与10mM，pH 7.4磷酸盐缓冲液混合，加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，在20℃-40℃、180-220rpm摇床中混合搅拌10-60min，加入葡萄糖脱氢酶的10mM，pH 7.4磷酸盐缓冲液在20℃-40℃、180-220rpm摇床中混合搅拌1-6h，加入10mM，pH 7.4磷酸盐缓冲液，采用25kDa渗析膜渗析，取截留液，获得葡萄糖脱氢酶-聚丙烯酸共轭物；所述葡萄糖脱氢酶与聚丙烯酸质量比为1：2-6；所述葡萄糖脱氢酶与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺质量比为1：10-20；所述聚丙烯酸溶液是将0.02g/mL聚丙烯酸水溶液与等体积10mM，pH 7.4磷酸盐缓冲液混合制成；(3)将羰基还原酶-聚丙烯酸共轭物、葡萄糖脱氢酶-聚丙烯酸共轭物与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺混合，在20℃-40℃、180-220rpm摇床中混合搅拌10-60min，加入10mM，pH 7.4磷酸盐缓冲液，采用25kDa渗析膜渗析，取截留液，获得纳米高分子-双酶复合物；所述羰基还原酶-聚丙烯酸共轭物与葡萄糖脱氢酶-聚丙烯酸共轭物体积比为1:0.5-1.5；所述羰基还原酶-聚丙烯酸共轭物与葡萄糖脱氢酶-聚丙烯酸共轭物总质量与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺质量比为1：0.5-1。
5.一种权利要求1所述纳米高分子-双酶复合物在不对称还原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的应用以2-氧代-4-苯基丁酸乙酯为底物，以pH 7.4、10mM磷酸缓冲盐溶液为反应介质，以d-葡萄糖为辅助底物，以NADP为辅酶，以纳米高分子-双酶复合物为催化剂构成转化体系，在20-45℃、50-250rpm条件下进行还原反应8～40h，反应液分离纯化，获得(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述底物加入终浓度为300～700mmol/L；所述d-葡萄糖加入终浓度为0.05-0.15M；所述NADP加入终浓度为0.03-0.07mM；所述催化剂加入终浓度为0.1-0.6mg/mL。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述反应介质为pH 7.4、10mM磷酸缓冲盐溶液与有机溶剂的混合；所述有机溶剂为正己烷、邻苯二甲酸二丁酯、苯、甲苯或正庚烷。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述pH 7.4、10mM磷酸缓冲盐溶液与有机溶剂体积比为1-5：3。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于当反应介质为pH 7.4、10mM磷酸缓冲盐溶液时，底物加入终浓度为485mmol/L；当反应介质为pH 7.4、10mM磷酸缓冲盐溶液与有机溶剂的混合时，底物加入终浓度为533mmol/L。
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