CN101544972A - 一步纯化固定化γ-内酰胺酶及拆分(±)γ-内酰胺的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于酶工程领域，具体说一步纯化固定化γ－内酰胺酶及拆分(±)γ－内酰胺的方法。本发明是将γ－内酰胺水解酶固定在Ni－NTA琼脂糖亲和柱上，并在柱上水解(+)γ－内酰胺，从而拆分(±)γ－内酰胺。将带有硫磺矿硫化叶菌耐热γ－内酰胺水解酶基因的质粒转入大肠杆菌，构建能表达N端与C端均带组氨酸标记的γ－内酰胺水解酶的基因工程菌或N端与C端仅一端带组氨酸标记的γ－内酰胺水解酶的基因工程菌。然后将带组氨酸标记的该酶一步纯化固定化在Ni－NTA琼脂糖亲和柱上，并使(±)γ－内酰胺底物在pH值5～10，温度30～100℃条件下，在柱上连续转化，转化率可保持在80％以上，产物的光学纯度＞99％。
Description
技术领域
本发明属于酶工程领域，具体说是一种固定化γ-内酰胺水解酶新技术拆分(±)2-氮杂双环-[2.2.1]-庚烷-5-烯-3-酮(γ-内酰胺)。
背景技术
(-)γ-内酰胺((-)2-氮杂双环-[2.2.1]-庚烷-5-烯-3-酮)是合成许多生物活性化合物的重要中间体，可合成阿巴卡韦等抗艾滋病手性药物。
通过手性化合物拆分来制备光学纯手性化合物的方法，归纳起来：(1)根据起始原料分为外消旋体拆分法和不对称合成法；(2)根据所用手段分为化学法和生物催化两种类型。微生物酶法拆分技术由于具有酶促催化反应的特点，而备受科研工作者的青睐。微生物酶法拆分是利用微生物细胞内所含的酶，或用细胞中分离出的酶作为催化剂，通过化学酶催化反应拆分外消旋体的方法。酶拆分的独特作用是由于它们由L-氨基酸组成。其活性中心构成了一个不对称环境有利于识别对映体。因而酶是高度手性的催化剂，具有高度的立体选择性。微生物种类及其体内生物催化反应种类繁多，因此微生物酶法拆分手性化合物的研究具有巨大的发展潜力。
目前，国内外许多科研工作者从事利用生物转化法拆分(±)γ-内酰胺的研究，并取得了良好的效果。Nakano Hiroto等进行了利用脂肪酶的立体选择性，拆分γ-内酰胺的外消旋体的研究；Taylor Stephen和Talor Steve通过完整细胞转化实验，利用内酰胺酶对(±)γ-内酰胺进行拆分，并取得良好的效果；Mahmoudian M等提出了一种微生物酶法拆分γ-内酰胺外消旋体化合物的方法；Toogood等克隆了嗜热的Sulfolobus solfataricus菌株中的γ-酰胺酶基因，分离得到γ-内酰胺酶，该酶热稳定性强，催化γ-内酰胺水解反应有很高的选择性。
本发明将带有硫磺矿硫化叶菌耐热酰胺水解酶基因的质粒转入大肠杆菌，表达了能水解(+)γ-内酰胺，拆分(±)γ-内酰胺的酶。游离酶的空间结构易受各种因素：如物理因素(温度、压力、电磁场)、化学因素(氧化、还原、有机溶剂、金属离子、离子强度、pH)和生物因素(酶修饰和酶降解)的影响，酶生物活力有可能丧失。游离酶即使在最适条件下，也会部分失活，随着反应时间的延长，反应速率会逐渐下降，反应后不能回收，加大了产物提纯难度，增加生产成本。所以，对于现代工业来说，游离酶酶并很不理想。
与游离酶相比，固定化酶具有以下的优点：
(1)固定化酶极易与底物、产物分开；
(2)可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应；
(3)提高酶的稳定性；
(4)对酶反应过程能够严格控制；
(5)产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；
(6)酶的使用效率提高，成本降低。
固定化酶，是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用，它将游离酶的催化活动完全或基本上限制在一定空间范围内的过程。酶的固定化方法很多，通常按照用于结合的化学反应的类型进行分类，分别为：吸附法、交联法、共价键结合法和包埋法四大类。对于蛋白一级结构已知的酶，结合蛋白一级结构的特点来采取相应固定化方法。
金属鳌合亲和层析(Metal Chelate Affinity Chromatography，MCAC)或固定化金属离子亲和层析(Immobilized Metal Affinity Chromatography，简称IMAC)，是近30年发展起来的一项分离技术。它是利用金属离子鳌合配体与蛋白质表面的组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基发生亲和结合作用的原理进行蛋白质分离及纯化，其中以咪唑基的结合作用最强。由于它具有配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点，逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。
本发明将酶一步纯化固定化于金属鳌合亲和层析介质上，与传统酶固定化相比具有以下潜在的优势：
(1)本发明一步完成酶的纯化与固定化过程。传统酶的纯化、固定化过程，首先经过复杂的蛋白纯化过程：①硫酸铵分级沉淀法除粗蛋白，②得到的蛋白进一步透析除盐，③相对纯一点的酶进一步过DEAE-sepharose fast flow及强阳、阴离子交换柱等等柱子获得纯酶；④然后将纯酶固定于载体上。
(2)蛋白质和金属离子鳌合载体通过过渡金属离子形成配位键，结合紧密，在高盐洗脱液下不被洗脱，只有在竞争性洗脱剂或高盐ETDA存在下才能被洗脱；并且蛋白质能与金属离子鳌合载体结合的位点少，在结合过程中不需要交联剂，实现酶的定向固定，有效减少酶活的损失。
发明内容
本发明的目的提供一种固定化γ-内酰胺水解酶拆分(±)γ-内酰胺制备(-)γ-内酰胺的技术。
本发明提供一步纯化固定化γ-内酰胺酶及拆分(±)γ-内酰胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)γ-内酰胺水解酶的固定化：其特征是将N端与C端均带组氨酸标记的γ-内酰胺水解酶的基因工程菌或N端与C端仅一端带组氨酸标记的γ-内酰胺水解酶的基因工程菌，用上样缓冲液悬浮，然后采用超声破碎，破碎上清液流过Ni-NTA琼脂糖或Ni-NTA葡聚糖填料的亲和柱，将固定上该酶的亲和柱用水保存，待用。
(2)(±)γ-内酰胺的拆分：其特征是将固定上该酶的亲和柱置于30～100℃的水浴中，在该酶最适pH值5～10下，将2～20g·L-1的底物(±)γ-内酰胺连续流过的亲和柱，连续转化。
与传统酶的纯化、固定化过程相比，本发明简化了纯化过程、降低生产成本及减少了酶量及酶活损失。
具体实施方式
(1)蛋白酶的表达：将实验室制备质粒导入感受态细胞内，转化后细胞接入3～5mL LB培养基(5g·L-1酵母粉，10g·L-1NaCl，10g·L-1胰蛋白胨，先用去离子水溶解，再用4.0M·L-1NaOH调节PH值7.5)，在250rev·min-1，37℃摇床培养8～10h得到种子液，然后将2.5mL种子液接到250mL LB培养基中，直到250mL摇瓶中OD600达到0.8左右，加入诱导剂IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)，诱导后2～3h，将250mL培养基在5000rev·min-1离心10min，收集到含重组γ-内酰胺水解酶的湿菌体。
(2)一步纯化固定化重组γ-内酰胺水解酶到Ni-螯合柱上：先用20mL上样缓冲液悬浮由步骤(1)得到的湿菌体，然后用400w的功率超声波破碎细胞，并12000rev·min-1离心破碎液，得到含该酶的破碎上清液。先用20mL上样缓冲液平衡Ni-NTA琼脂糖亲和柱，再将破碎上清液倒入该亲和柱，上清液利用重力作用流经该柱，而带有组氨酸标记的重组γ-内酰胺水解酶会亲和结合至亲和柱上，然后用冲洗缓冲液(先用去离子水溶解50mM·L-1NaH2PO4，300m M·L-1NaCl，20mM·L-1咪唑，再用4.0M·L-1HCl调节pH值至8.0)洗掉吸附的杂蛋白，即得到固定化酶柱。
(3)柱上拆分(±)γ-内酰胺制备(-)γ-内酰胺：先将固定化酶柱连上蠕动泵装置，柱体置于水浴中，再把用pH值为6.9～9.0的上样缓冲液配制的10g·L-1底物(±)γ-内酰胺预热至50～70℃，然后流经柱体，使它与固定化酶进行生物转化作用，获得转化液，从而拆分(±)γ-内酰胺制备(-)γ-内酰胺。
(4)手性HPLC分析产品：用1mL乙酸乙酯萃取按步骤(3)获得的转化液1mL，萃取后的乙酸乙酯相作为样品，利用手性HPLC法测定(+)γ-内酰胺和(-)γ-内酰胺的含量，计算出e.e值及(-)γ-内酰胺的产率。
手性HPLC法：采用DAICEL CHIRALPAK AS-H柱(Daicel，Japan)，流动相：乙腈:异丙醇＝80:20(v/v)，流速：0.6mL·min-1，检测波长：230nm，进样量为20uL。手性HPLC法测得产品的e.e值最高达到99.9％，(-)γ-内酰胺的产率最高为46.5％((-)γ-内酰胺理论最高产率为50％)。
实例1
4.332mg酶固定化于亲和柱上，柱子于30℃水浴保温，2g·L-1底物以0.22mL·min-1流速过柱转化，转化率达到90％，e.e值到达99.02％。
实例2
4.332mg酶固定化于亲和柱上，柱子于60℃水浴保温，20g·L-1底物以0.22mL·min-1流速过柱转化，转化率达到88％，e.e值达到99.1％。
实例3
4.332mg酶固定化于亲和柱上，柱子于60℃水浴保温，5g·L-1底物以0.5mL·min-1流速过柱转化，转化率达到91％，e.e值达到99％。
实例4
4.332mg酶固定化于亲和柱上，柱子于60℃水浴保温，10g·L-1底物以0.22mL·min-1流速过柱转化，转化率达到89％，e.e值达到99.48％。
实例5
4.332mg酶固定化于亲和柱上，柱子于80℃水浴保温，10g·L-1底物以0.22ml/min流速过柱转化，转化率达到80％，e.e值达到99.67％。
Claims (1)
1、一步纯化固定化γ-内酰胺酶及拆分(±)γ-内酰胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)γ-内酰胺水解酶的固定化：其特征是将N端与C端均带组氨酸标记的γ-内酰胺水解酶的基因工程菌或N端与C端仅一端带组氨酸标记的γ-内酰胺水解酶的基因工程菌，用上样缓冲液悬浮，然后采用超声破碎，破碎上清液流过Ni-NTA琼脂糖或Ni-NTA葡聚糖填料的亲和柱，将固定上该酶的亲和柱用水保存，待用；
(2)(±)γ-内酰胺的拆分：其特征是将固定上该酶的亲和柱置于30～100℃的水浴中，在该酶最适pH值5～10下，将2～20g·L-1的底物(±)γ-内酰胺连续流过的亲和柱，连续转化。
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