CN101875959A

CN101875959A - 一种生物拆分制备阿巴卡韦手性中间体的方法

Info

Publication number: CN101875959A
Application number: CN 201010191922
Authority: CN
Inventors: 徐小海; 曾锡瑞; 倪晔; 孙志浩
Original assignee: JIANGXI CHIBANG PHARMACEUTICAL CO Ltd; Jiangnan University
Current assignee: JIANGXI CHIBANG PHARMACEUTICAL CO Ltd; Jiangnan University
Priority date: 2010-06-04
Filing date: 2010-06-04
Publication date: 2010-11-03

Abstract

本发明公开了一种生物拆分制备阿巴卡韦手性中间体的方法，具体涉及采用Pseudomonas cepacia DSM9959固定化细胞在生物拆分制备阿巴卡韦手性中间体中的应用。该固定化细胞的用量为5-50g/100mL反应体系，在10-500g/L外消旋2-氮杂双环-[2，2，1]-庚烷-5-烯-3-酮底物浓度，50mM pH7.5磷酸钾缓冲液，25℃200rpm水浴摇床的条件下，转化24-48小时，转化率最高可达48.5％，e.e值大于99.5％。反应液过滤后得到的残余固定化细胞，可在下批反应中重复利用五次以上，转化率仍大于35％，e.e.值大于99.5％。与游离细胞转化相比，达到其50％以上的活性。本工艺路线催化剂制备简易，可重复利用五次以上；反应条件温和，无需进行底物保护；反应步骤精简；产物的对映体过量值达99.5％以上，因此具有较好的经济性和技术可行性。

Description

一种生物拆分制备阿巴卡韦手性中间体的方法

技术领域

本发明涉及一种生物拆分制备阿巴卡韦手性中间体的方法，属于生物工程技术领域。具体涉及采用Pseudomonas cepacia DSM9959固定化细胞在生物拆分制备阿巴卡韦手性中间体中的应用。

背景技术

联合国艾滋病规划署在中国上海发表的《2009年全球艾滋病流行报告》指出，截至2009年10月31日，全球累计艾滋病感染者和艾滋病病人为3340万例。AIDS严重威胁着人类的健康和生存，已成为全球最为关注的问题之一。中国于1985年发现首例艾滋病感染病例，截至2009年底，估计中国目前存活艾滋病感染者和病人约74万人。面对这一严峻挑战，世界各国都在为控制艾滋病而积极地研制、开发抗艾滋病药物。

据联合国艾滋病规划署报告中提到，全球用于艾滋病防治的资金大幅增加。在2007年，全球用于艾滋病防治的资金总额达100亿美元，是2000年的7倍，2010年预计还需要投入154亿美元，2015年则可能需要投入225亿美元。报告呼吁各国加大投入力度，并特别呼吁发达国家进一步加大对中低收入国家应对艾滋病努力的资金扶持。国务院在《关于切实加强艾滋病防治工作的通知》中指出，要加强新型艾滋病治疗药品的研制和生产。食品药品监管部门要继续支持艾滋病治疗药品的研制与开发，加快艾滋病治疗药品审批过程，努力推出一批安全、有效的艾滋病治疗药品。

现阶段最有效的抗艾滋病药物的主体仍为核苷类逆转录酶抑制剂，阿巴卡韦(abacavir)就是这类新型具有光学活性的抗艾滋病药物。其硫酸盐片剂和口服液(商品名Ziagen)有良好的抗HIV活性，生物利用度佳、交叉耐药性较小，易渗入中枢神经系统，对细胞色素P450酶无影响，是当今抗艾滋病“鸡尾酒疗法”的重要成分之一。其临床疗效高于AZT(zidovuding)，预计2010年将有超过10亿美元的销售额，有取代AZT的趋势，其市场前景十分看好。目前市场上进口阿巴卡韦的价格已超过10000元/Kg，按目前艾滋病治疗现状，阿巴卡韦全世界约有每年150吨的市场需求。而我国迄今为止，尚无厂家能独立批量生产具有光学活性的阿巴卡韦。

合成阿巴卡韦首先必须制备两个中间体：1)(1S，4R)-cis-4-氨基-2-环戊烯-1-甲醇；2)2-氨基-4，6-二氯-5-甲酰氨基嘧啶。两个中间体经过缩合、环合等一系列反应最终得到阿巴卡韦原料药，其中手性中间体1的合成是关键。包括两个中间体合成在内，化学法合成阿巴卡韦手性的总反应步骤接近20步，而且化学法的产率和立体选择性都比较低，成本较高。

上海玛耀化学技术有限公司孙猛等报道了一种制造阿巴卡韦的方法，该方法以4-氯-2-氨基-嘌呤为原料，与[(4-溴)-环戊-2-烯-1-基]甲醇反应制备关键中间体{(1R，4S)-4-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9基)环戊-2-烯-1-基}甲醇，然后再用常规方法制造阿巴卡韦(中国专利200510029670.7)；该公司还报道了采用4，6-二氯-5-硝基-2-氨基-嘧啶为起始原料制备阿巴卡韦的方法(中国专利200510029671.1)。上海中科院有机所姜标等报道了以[1R，4S]-4-氨基-2-环戊烯基-1-甲醇和2，5-二氨基-4，6-二氯嘧啶为起始原料，获得99.9％ee值的光学纯阿巴卡韦(中国专利200610027649.8)，其起始反应物已为手性中间体。以上方法均采用化学合成法。

在生物催化法方面，北京化工大学郑国钧等报道了将具有γ-内酰胺水解酶活性的微杆菌Microbacterium hydrocarbonoxydans应用于阿巴卡韦手性中间体[1R，4S]-2-氮杂双环-[2，2，1]-庚烷-5-烯-3-酮的制备(中国专利200710118064.1)，对该菌株进行了诱变以提高酰胺水解酶活(中国专利200810056829.8)，并对该酶进行了纯化和固定化(中国专利200910084258.3)。袁方等采用枯草蛋白酶交联酶晶体催化制备阿坝卡位的关键手性碳环中间体(中国专利200810123861.3)。Taylor SJC等人将来源于Comamonas acidovorans的γ-内酰胺酶在大肠杆菌中进行重组表达，并将部分纯化后的粗酶液应用于制备上述阿巴卡韦手性中间体。

目前国内外的报道中，阿巴卡韦的制备方法包括化学法和酶催化法。在酶催化法方面，有采用微生物整体细胞、粗酶液、固定化γ-内酰胺酶以及枯草蛋白酶交联酶晶体进行拆分制备阿巴卡韦手性中间体。

目前的报道没有将Pseudomonas cepacia DSM9959整体细胞进行固定化并应用于阿巴卡韦手性中间体制备的报道。本发明采用的菌种Pseudomonas cepacia DSM9959购自德国DSMZ菌种保藏中心，通过对P.cepacia整体细胞进行固定化，并将该固定化细胞应用于催化外消旋底物2-氮杂双环-[2，2，1]-庚烷-5-烯-3-酮的拆分反应，获得光学纯产物[1R，4S]2-氮杂双环-[2，2，1]-庚烷-5-烯-3-酮。与游离细胞相比，达到其50％以上的活性。本工艺路线催化剂制备简易，可重复利用五次以上；反应条件温和，无需进行底物保护；反应步骤精简；产物的对映体过量值达99.5％以上。本发明的工艺路线具有较好的经济性和技术可行性，完全可应用于实际产业化，所得阿巴卡韦产品符合企业标准要求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有γ-内酰胺酶活性的Pseudomonas cepacia DSM9959固定化细胞的制备方法，并将该固定化细胞应用于阿巴卡韦手性中间体的工业化制备。以下是本发明内容的详细描述。

本发明提供了一种生物拆分制备阿巴卡韦手性中间体的方法，其包含以下步骤：

a.固定化细胞的制备方法

将1-5g卡拉胶加入20-200mL生理盐水溶液中，煮沸溶解后冷却至45℃左右；与20-200mL，10-50％的P.cepacia菌悬液(生理盐水)混合，倒入浅盘硬化；加入0.1-0.5M的KCl溶液，静置1-10小时，生理盐水充分冲洗后切块，存于4℃环境中。

b.固定化细胞应用于阿巴卡韦手性中间体的制备

将制备好的固定化Pseudomonas cepacia细胞应用于阿巴卡韦手性中间体的制备。底物溶液为含有10-500g/L外消旋底物2-氮杂双环-[2，2，1]-庚烷-5-烯-3-酮的50mM pH7.5磷酸钾缓冲液。在200mL底物溶液加入10-100g步骤a所述固定化细胞，25℃，200rpm水浴摇床转化24-48小时。转化液过滤，残留的固定化细胞用磷酸钾缓冲液淋洗，储存于4℃待下批重复使用。对反应液中的产物浓度和光学纯度采用手性HPLC法测定。

手性HPLC法测定浓度和光学纯度

采用的色谱柱为Daicel的Chiralpark AS-H，流动相：乙腈∶异丙醇＝80∶20，流速0.6mL/min，检测波长230nm。

本发明的有益效果是：采用一株具有γ-内酰胺酶活性的菌种Pseudomonas cepaciaDSM9959，对其进行整体细胞固定化，并将固定化细胞应用于催化外消旋底物2-氮杂双环-[2，2，1]-庚烷-5-烯-3-酮的拆分反应，以获得制备阿巴卡韦的关键手性中间体[1R，4S]2-氮杂双环-[2，2，1]-庚烷-5-烯-3-酮。该固定化细胞反应与游离细胞相比，可达到其50％以上的活性。本工艺路线催化剂制备简易，可重复利用五次以上；反应条件温和，无需进行底物保护；反应步骤精简；产物的对映体过量值达99.5％以上。本发明的工艺路线具有较好的经济性和技术可行性，完全可应用于实际产业化，所得阿巴卡韦产品符合企业标准要求。

具体实施方式

实施例

1.采用卡拉胶包埋的固定化方法。将3g卡拉胶加入50mL生理盐水溶液中，煮沸溶解后冷却至45℃左右，与50mL 20％的Pseudomonas cepacia细胞菌悬液(生理盐水)混合，倒入浅盘硬化，然后加入0.3M的KCl溶液，静置4小时，生理盐水充分冲洗后切块，存于4℃待用。

2.采用卡拉胶包埋的固定化方法。将5g卡拉胶加入50mL生理盐水溶液中，煮沸溶解后冷却至45℃左右，与50mL 30％的Pseudomonas cepacia细胞菌悬液(生理盐水)混合，倒入浅盘硬化，然后加入0.5M的KCl溶液，静置10小时，生理盐水充分冲洗后切块，存于4℃待用。

3.于500mL具塞锥形瓶中加入200mL外消旋2-氮杂双环-[2，2，1]-庚烷-5-烯-3-酮底物溶液，50g步骤1的固定化细胞，在25℃200rpm水浴摇床中转化36小时，期间取样手性HPLC测定。反应最终转化率为48.3％，e.e值为99.5％。反应液过滤，用50mM pH7.5磷酸钾缓冲液淋洗，得到残留固定化细胞，待重复利用。

4.于500mL具塞锥形瓶中加入200mL外消旋2-氮杂双环-[2，2，1]-庚烷-5-烯-3-酮底物溶液，10g步骤1的固定化细胞，在25℃200rpm水浴摇床中转化24小时，期间取样手性HPLC测定。反应最终转化率为44.6％，e.e值为99.5％。反应液过滤，用50mM pH7.5磷酸钾缓冲液淋洗，得到残留固定化细胞，待重复利用。

5.于500mL具塞锥形瓶中加入200mL外消旋2-氮杂双环-[2，2，1]-庚烷-5-烯-3-酮底物溶液，100g步骤1的固定化细胞，在25℃200rpm水浴摇床中转化48小时，期间取样手性HPLC测定。反应最终转化率为48.5％，e.e.值为99.5％。反应液过滤，用50mM pH7.5磷酸钾缓冲液淋洗，得到残留固定化细胞，待重复利用。

6.于500mL具塞锥形瓶中加入200mL上述的底物溶液，加入步骤2的残留固定化细胞，25℃200rpm水浴反应36h，期间取样手性HPLC测定。反应最终转化率为43.7％，e.e.值为99.5％。实验证明，该固定化细胞经过五次重复利用，转化率大于35％，e.e.值大于99.5％。

对比例

将培养好的Pseudomonas cepacia游离细胞直接应用于阿巴卡韦手性中间体的制备。底物溶液为含有200g/L底物的50mMpH7.5磷酸钾缓冲液。于500mL具塞锥形瓶中加入200mL外消旋2-氮杂双环-[2，2，1]-庚烷-5-烯-3-酮底物溶液，2.5g Pseudomonas cepacia整体细胞，在25℃200rpm水浴摇床中转化36小时，期间取样，离心，手性HPLC测定上清液组分。反应最终转化率为47.1％，e.e.值为99.5％。相对于本发明提供的方法，该方法所采用的游离细胞较难进行回收重复利用，最终转化率与本发明提供的方法的转化率相当。

Claims

1.一种生物拆分制备阿巴卡韦手性中间体的方法，其特征在于包含以下步骤：

a.将1-5g卡拉胶加入20-200mL生理盐水溶液中，煮沸溶解后冷却至45℃左右；与20-200mL，10-50％的P.cepacia菌悬液(生理盐水)混合，倒入浅盘硬化；加入0.1-0.5M的KCl溶液，静置1-10小时，生理盐水充分冲洗后切块，存于4℃环境中；

b.底物溶液为含有10-500g/L外消旋2-氮杂双环-[2，2，1]-庚烷-5-烯-3-酮的50mM pH7.5磷酸钾缓冲液；于200mL底物溶液中加入10-100g步骤a所述的固定化细胞，在25℃200rpm水浴摇床中转化24-48小时；反应结束后过滤，用50mM pH7.5磷酸钾缓冲液淋洗固定化细胞，待下批反应重复利用。