CN104561224A

CN104561224A - (-)γ-内酰胺的制备方法

Info

Publication number: CN104561224A
Application number: CN201410817665.1A
Authority: CN
Inventors: 徐剑锋; 曾淼; 宋亮; 繆骏颖; 李岩
Original assignee: SUZHOU KAIYUAN MINSHENG SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SUZHOU KAIYUAN MINSHENG SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-12-25
Filing date: 2014-12-25
Publication date: 2015-04-29
Anticipated expiration: 2034-12-25
Also published as: CN104561224B

Abstract

本发明揭示了一种(-)γ-内酰胺的制备方法，先通过硫磺矿硫化叶菌(+)γ-内酰胺酶基因的大肠杆菌工程菌进行发酵，制得相关酶液，然后通过共价结合法固定化γ-内酰胺酶，最后拆分γ-内酰胺酶制得(-)γ-内酰胺。本发明中对硫磺矿硫化叶菌(+)γ-内酰胺酶是一种耐高温且温度稳定性好的酶，80℃处理15min对酶的影响较小，而大肠杆菌的绝大多数蛋白都会变性沉淀，使得纯化方法变得简单有效。

Description

(-)γ-内酰胺的制备方法

技术领域

本发明涉及一种γ-内酰胺酶的固定化制备及其拆分方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

(1R,4S)-2-氮杂双环-[2.2.1]-庚烷-5-烯-3-酮((-)γ-内酰胺)是用于制备碳环核苷类抗病毒药物的重要手性中间体。例如用于抗艾滋病的重要药物阿巴卡韦、卡巴韦和用于抗流感病毒的帕拉米韦都能以(-)γ-内酰胺为原料制备。

目前制备(-)γ-内酰胺的方法主要有不对称合成法和外消旋体拆分法，外消旋拆分法中的生物酶拆分法由于其独特的优点，受到科研及生产人员的倍加重视和开发。生物酶法拆分主要利用具有高度立体选择性酶对外消旋γ-内酰胺进行拆分，去除(+)γ-内酰胺，获得(-)γ-内酰胺，其反应条件温和、环境污染小、产品的光学纯度高。

第一次报道使用生物酶法对外消旋γ-内酰胺进行拆分的是Nakano hiroto等，使用的是脂肪酶。Talor等使用全细胞的转化实验，利用酰胺酶拆分外消旋γ-内酰胺，并取得了较好的拆分效果。之后，Taylor等对食酸丛毛单胞菌(Comomonasacidovorans)中的内酰胺酶进行鉴定、分离和克隆，并将(+)γ-内酰胺酶的基因在大肠杆菌中克隆表达，使得重组后的大肠杆菌能够耐受500g/L的底物，具有较高的工业化潜力。

硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)中的(+)γ-内酰胺酶具有较强的温度稳定性、易于纯化，并且具有绝对的立体选择性。国内的相关研究相对较少，李海泉等从土壤中筛选得到一株具有高活力的(+)γ-内酰胺酶的微杆菌，经过鉴定为氧化烃微杆菌(Microbacteriumhydrcarbonixydans)，北京化工大学的郑国钧等对来源于的(+)γ-内酰胺酶进行了相关研究，并将其基因成功克隆至大肠杆菌中，构建了(+)γ-内酰胺酶的重组菌株。江南大学的倪晔等将PseudonmascepaciaDSM9959整体细胞进行固定化，并应用于拆分γ-内酰胺。

本发明使用的酶液来源于带有硫磺硫化叶菌(+)γ-内酰胺酶基因的大肠杆菌工程菌发酵并处理获得。具有较好的拆分效果，由于游离酶在各种理化因素(如温度、压力、有机溶剂、离子强度)下比较容易变性失活，甚至在最适条件下也会部分失活，使得反应时间延长。同时，游离酶在拆分反应后无法回收重复利用，从而增加了生产成本和加大了产物提取的难度。因此游离酶的工业化效果并不理想。

发明内容

本发明的目的在于解决上述的技术问题，提供一种(-)γ-内酰胺的制备方法。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

(-)γ-内酰胺的制备方法，包括如下步骤：

S1、共价结合法固定化γ-内酰胺酶；

S2、拆分γ-内酰胺酶制得(-)γ-内酰胺；

其中，所述S1包括，

S11、预处理步骤：

a、洗涤，用2-5倍质量体积比的0.2mol/L、pH＝7.0-9.0的磷酸缓冲液对伯氨基树脂用磷酸盐缓冲液洗涤2-3次，过滤得到洗涤平衡的伯氨基树脂，所述最终树脂的平衡pH值为6.5-8.5；

b、预活化，在洗涤后的伯氨基树脂中加入戊二醛溶液进行树脂的预活化，使混合物的终浓度为1％-6％，在室温下连续搅拌4-8h，过滤得到固定前树脂；所述反应式如下：

S12、制备酶液：

c、菌体制备，将含有硫磺矿硫化叶菌(+)γ-内酰胺酶基因的大肠杆菌工程菌进行发酵，罐上发酵条件为：温度37℃，通气量1vvm，转速偶联溶氧，使溶氧范围为20-50％之间，诱导剂为乳糖，发酵时间16h。离心获得湿菌体；

d、将获得的湿菌体按照200g/L置于0.1mol/L、pH＝7.0的磷酸盐缓冲液中进行重悬，菌悬液使用高压匀质机匀质2-5次，压力不低于800bar；

e、匀质后的破碎液于80℃处理10-15min，以9000rpm离心5min，去除沉淀杂质，获得上清酶液；

S13、共价结合固定化酶：

f、混合，将经预处理后的树脂与获得的酶液按1:5-10的比例混合，在室温下搅拌固定12-24h；

g、过滤，过滤去除混合后的残留酶液，得到γ-内酰胺酶；

所述S2包括，

S21，在g得到的γ-内酰胺酶中加入γ-内酰胺和去离子水，在40℃进行搅拌反应，进行拆分转化得到(-)γ-内酰胺，所述γ-内酰胺酶与γ-内酰胺的质量比为1:1。

优选地，所述γ-内酰胺酶的蛋白浓度＞0.5g/L。

优选地，所述S21中γ-内酰胺的浓度＞300g/L。

优选地，所述制备方法制得的(-)γ-内酰胺光学纯度为99.98％。

本发明的有益效果主要体现在：硫磺矿硫化叶菌(+)γ-内酰胺酶是一种耐高温且温度稳定性好的酶，80℃处理10-15min对酶的影响较小，而大肠杆菌的绝大多数蛋白都会变性沉淀，使得纯化方法变得简单有效。

采用伯氨基树脂为原料用共价结合的方式制备固定化酶，由于其含有大量的氨基基团，在经过戊二醛预活化后，戊二醛与氨基结合，形成能够与酶蛋白结合的基团，在酶结合时，酶与活化后的树脂形成稳定的亚氨键，将酶蛋白牢固地固定在树脂上。

该方法的优点：1、固定化酶的稳定性提高，不易失活；2、反应完成后，固定化酶与反应液易分开；3、酶与树脂结合紧密，反应液中没有酶残留，减少了产物提取的难度；4、固定化酶可以反复利用多次，大大降低了成本。

附图说明

图1为本实施例中的HPLC的图谱示意图。

具体实施方式

以下结合实施例具体说明本发明的制备方法：

(-)γ-内酰胺的制备方法，包括如下步骤：

S1、共价结合法固定化γ-内酰胺酶；

S2、拆分γ-内酰胺酶制得(-)γ-内酰胺；

其中，所述S1包括，

S11、预处理步骤：

a、洗涤，取直径为0.15-0.3mm的伯氨基树脂100g，用0.2mol/L、pH＝7.0的磷酸盐缓冲液洗涤2-3次，最终树脂的平衡pH值为6.5-8.5之间，过滤得到洗涤平衡的伯氨基树脂；

b、预活化，将洗涤平衡后的树脂加入200ml 0.2mol/L、pH＝7.0的磷酸盐缓冲液，加入24ml浓度为25％的戊二醛溶液，使其终浓度为3％。在室温下搅拌，共价结合6h后，过滤得到固定前树脂。

S12、制备酶液：

c、菌体制备，将含有硫磺矿硫化叶菌(+)γ-内酰胺酶基因的大肠杆菌工程菌用LB培养基37℃、200rpm培养12h后进罐培养，罐上发酵条件为：温度37℃，通气量1vvm，转速偶联溶氧使溶氧范围为20-50％之间，诱导剂乳糖，发酵时间16h，离心获得湿菌体。

d、取200g/L湿菌体置于0.1mol/L、pH＝7.0的磷酸盐缓冲液中，搅拌重悬，菌悬液使用高压匀质机匀质2-5次，压力800bar。

e、匀质后的破碎液于80℃处理10-15min后，9000rpm离心5min，去除沉淀杂质，获得1L上清酶液。

S13、共价结合固定化酶：

f、混合，将以上经预处理后的树脂与获得的1L酶液按1:10的质量比例混合，在室温下搅拌固定20h；

g、过滤，过滤去除混合后的残留酶液，得到γ-内酰胺酶。

所述S2包括，

S21，在g得到的γ-内酰胺酶中加入100gγ-内酰胺和333ml去离子水，在40℃温度下，以转速为200rpm，搅拌反应8h，进行拆分转化得到(-)γ-内酰胺，所述γ-内酰胺酶与γ-内酰胺的质量比为1:1。

共价结合法制得得到的固定化酶与反应液易分开，可进行重复反应利用，即当以上拆分反应结束后，过滤得到固定化酶，按照γ-内酰胺酶与γ-内酰胺的质量比为1:1的比例，加入底物和去离子水，重复反应，所述的γ-内酰胺酶可利用30次以上，酶的拆分能力保存80％以上。

产物(-)γ-内酰胺的手性产品的HPLC分析：取0.5ml拆分获得的反应转化液，加入1ml的乙酸乙酯萃取，萃取后的有机相为样品，手性HPLC测定光学纯度和转化率，采用的色谱柱为Daicel的ChiralparkOD-H，流速0.6ml/min，流动相：正己烷：乙醇＝80：20，检测波长：220nm，进样量25μl。手性HPLC法测得产品的e.e％值达99.98％，(-)γ-内酰胺的收率可达到47.3％，所述HPLC图谱如图1所示，由该图谱可得出表1的结果。

表1：HPLC图谱结果分析表

本发明中的酶液采用80℃处理10-15min后，进行后续的除沉淀杂质，获得1L上清酶液，经过该处理后的酶液经过共价结合法能高效率的制得(-)γ-内酰胺。

以下提供相关对比例以更好的表明本发明中优选参数的选择：

对比例1：

将步骤d得到的破碎菌液，分别在不同温度下处理5分钟，12000rpm离心2min后，检测上清酶液中的蛋白浓度和酶拆分能力。结果如表1-1所示。

表1-1：不同处理温度下酶液的蛋白浓度和酶拆分能力

温度(℃)	蛋白浓度(g/L)	酶拆分能力(ee％)
			40	2.85±0.05	68.4±0.2

45	2.66±0.04	68.2±0.3
			50	2.54±0.06	68.6±0.5
55	2.21±0.04	68.1±0.5
			60	1.86±0.02	69.0±0.4
65	1.59±0.03	68.6±0.2
			70	1.33±0.02	68.3±0.3
75	1.04±0.02	68.1±0.2
			80	0.74±0.04	68.1±0.3
85	0.68±0.03	63.6±0.1
			90	0.56±0.02	51.3±0.4
95	0.42±0.02	42.5±0.2

注：蛋白浓度测定方法为标准Bardford法；酶拆分能力检测方法为：5ml酶液加入0.1gγ-内酰胺，40℃温度下，转速为200rpm，搅拌反应1h反应液萃取后检测ee％值。

随着温度的升高蛋白浓度越来越低，而在低于80℃之前，拆分能力几乎无变化，综上，80℃之前失活除去的蛋白均为杂蛋白，当温度高于80℃后，目的酶开始失活。

对比例2：

将步骤d得到的破碎菌液，在80℃下别处理不同时间，12000rpm离心2min后，检测上清酶液中的蛋白浓度和酶拆分能力。结果如表1-2所示。

表1-2：不同处理时间下酶液的蛋白浓度和拆分能力

处理时间(min)	蛋白浓度(g/L)	酶拆分能力(ee％)
			5	0.75±0.01	67.9±0.4
10	0.66±0.02	67.6±0.3
			15	0.63±0.01	66.5±0.4

20	0.58±0.03	57.6±0.2
			25	0.52±0.01	46.2±0.6
30	0.42±0.04	39.1±0.4
			35	0.30±0.02	30.5±0.2
40	0.18±0.02	21.0±0.1

处理时间约10-15min左右时，酶液酶活损失少，同时能尽量除去其他杂蛋白。

对比例3：

将步骤e得到的1L酶液，加入100g的γ-内酰胺，温度40℃时，转速200rpm下搅拌反应8h，反应中间取样，检测反应的e.e％值，最终e.e％值达99.9％，(-)γ-内酰胺的收率达到47.1％。

相对于本发明的方法，虽然对比例的方法的反应收率和光学纯度与本发明方法相当。但对比例中未经共价结合法获得的酶液无法回收，在反应液萃取酶液时完全失活，无法重复利用，同时，反应液中的酶增加了后续提取产物的难度。

本发明尚有多种具体的实施方式，凡采用等同替换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明要求保护的范围之内。

Claims

1.(-)γ-内酰胺的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、共价结合法固定化γ-内酰胺酶；

S2、拆分γ-内酰胺酶制得(-)γ-内酰胺；

其中，所述S1包括，

S11、预处理步骤：

S12、制备酶液：

S13、共价结合固定化酶：

g、过滤，过滤去除混合后的残留酶液，得到γ-内酰胺酶；

所述S2包括，

2.根据权利要求1所述的(-)γ-内酰胺的制备方法，其特征在于：所述γ-内酰胺酶的蛋白浓度＞0.5g/L。

3.根据权利要求1所述的(-)γ-内酰胺的制备方法，其特征在于：所述S21中γ-内酰胺的浓度＞300g/L。

4.根据权利要求1所述的(-)γ-内酰胺的制备方法，其特征在于：所述制备方法制得的(-)γ-内酰胺光学纯度为99.98％。