CN104342463B - 一种1‑氰基环己基乙酸的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种1‑氰基环己基乙酸的制备方法，首先采用微生物转化的方法对底物1‑氰基环己基乙腈进行催化，然后采用分步分离的方法对转化液进行分离纯化，最终获得了蛋白残留100PPM以下，收率在85％以上，纯度达到98％的产物，很好的解决了后续加氢反应生成加巴喷丁时由于蛋白浓度过高对催化剂产生毒害作用的问题，也提高了加巴喷丁的产量。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种1-氰基环己基乙酸的制备方法，特别涉及利用含重组腈水解酶的工程菌生物转化制备1-氰基环己基乙酸的方法。
(二)背景技术
1-氰基环己基乙酸(1-cyanocyclohexaneacetic acid)是制备抗癫痫药物加巴喷丁的重要中间体。
加巴喷丁(gabapentin)，化学名称为1-氨甲基-1-环己基乙酸，别名为卡巴番定、迭力。其结构与γ-氨基丁酸(GABA)类似，主要用于治疗癫痫及多种神经性疼痛，是一种新型的抗癫痫药物。常温下，加巴喷丁为白色或类白色结晶性粉末，无味。分子式为：C9H17NO2。相对分子质量为171.24，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚。
加巴喷丁的分子结构比较简单，既有氨基又有羧基，易脱水形成五元环的螺环内酯，也是六元环的同一碳原子上带有两个取代基。所以，大部分研究者都以六元环化合物为起始原料。当前工业合成加巴喷丁主要通过化学方法以环己酮、环己基甲醛、亚甲基环己烷等为原料经过一系列的环化、脱羧、重排、水解等反应最终制得。但是现有路线有很多的问题：(1)反应条件苛刻，需在强酸、强碱条件下反应；(2)所用原料毒性较大，操作危险，运输困难，易污染环境；(3)反应时间长，费时费力；(4)反应收率低，影响经济效益。所以现使用一条化学酶法合成加巴喷丁的路线。
加巴喷丁的化学酶法合成路线，是以环己酮为原料，首先制得1-氰基环己基乙腈，然后再以腈水解酶催化生成1-氰基环己基乙酸，最后通过催化加氢得到加巴喷丁。整个过程操作方便、对环境友好而且收率高。而1-氰基环己基乙酸是腈水解酶法制取加巴喷丁过程中最关键的中间体。
化学酶法具有收率高，纯度高，副产物少，易操作和环境友好等优点， 是一种较为有效的廉价生产的方法。加巴喷丁化学酶法合成路线的关键，是腈水解酶催化1-氰基环己基乙腈生成1-氰基环己基乙酸，催化完成的生物转化液中含有大量菌体，以及一些细胞破裂后流出的细胞液，蛋白质，糖类等杂质。如需进行下一步反应，需先将生物转化液中的大量蛋白质等杂质除去。
现有对1-氰基环己基乙酸的分离提取的技术，还未见其文献报道。一般对有机羧酸的提取是通过有机溶剂的萃取，或者膜过滤装置，或者离子交换层析。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种1-氰基环己基乙酸的分离提取方法，可以快速、有效地将生物转化液中的蛋白质等杂质去除，并且拥有较高的收率，便于其进行下一步加氢反应。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种1-氰基环己基乙酸的制备方法，所述方法为：(1)生物转化：以腈水解酶为催化剂，以1-氰基环己基乙腈为底物，以pH值为7.0的缓冲液(优选PBS缓冲液)或去离子水为反应介质，在35℃进行转化反应，反应结束后，获得转化液；(2)分离纯化：①将步骤(1)获得的转化液调pH值至7.3～8.0，离心，获得上清液和沉淀；②取上清液加入聚合硫酸铁，搅拌絮凝，抽滤，获得滤液a和滤饼a；③向滤液a中加入活性炭，搅拌除色(优选60℃搅拌30min)，抽滤，获得滤液c和滤饼c；所述活性炭的质量加入量以滤液a体积计为0.001～0.01g/ml；④将滤液c调节pH值为2.0～2.5，静置沉淀，抽滤，获得滤饼e和滤液e，将滤饼e干燥，获得1-氰基环己基乙酸。
进一步，优选所述催化剂的质量终浓度为2.5～50g/L反应介质(纯酶浓度1g/L)，底物的初始浓度为1mol/L反应介质。
进一步，所述步骤②具体为：取上清液加入终浓度3～5g/L聚合硫酸铁，在20～30℃、200rpm条件下搅拌1-10min，使絮凝剂快速均匀分布在溶液中，然后再在30℃、50rpm条件下搅拌5-30min，使悬浮物微粒充分接触，碰撞，使絮凝物不断增大，4℃下静置沉降20-60min，抽滤，获得滤液a和滤饼a。
进一步，所述腈水解酶为含腈水解酶突变体的工程菌经发酵培养获得的湿菌体，所述含腈水解酶突变体的工程菌按如下方法获得：(1)含腈水解酶的工程菌：以敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)ZJB09122基因组DNA为模板，以序列1和序列2为引物，通过PCR方法获得含重组腈水解酶基因的克隆载体；然后再以含重组腈水解酶基因的克隆载体为模板，以序列3和序列4为引物，使用高保真的DNA聚合酶扩增目标腈水解酶基因，运用酶切连接的方法，构建了含重组腈水解酶基因的表达载体，并将表达载体转化至宿主菌，得到含腈水解酶的工程菌；
序列1：5’-ATGGTTTCGTATAACAGCAAG-3’，
序列2：5’-CTACTTTGCTGGGACCGG-3’，
序列3：5’-AATGGATCCATGGTTTCGTATAACAGCAAG-3’，
序列4：5’-AGGGTCGACCTACTTTGCTGGGACCGG-3’；
(2)含腈水解酶突变体的工程菌：以步骤(1)构建的含重组腈水解酶基因的表达载体为模版，以序列5和序列6为引物，根据Quikchange 定点突变方法，扩增得到含重组腈水解酶突变体的表达载体，并将突变表达载体转化至宿主菌，得到含腈水解酶突变体的工程菌；
序列5：5’-GAGCACGTTCAGCCGCTGTCCAAAT-3’，
序列6：5’-CGGCTGAACGTGCTCCCAGCAGTTC-3’。
进一步，所述聚合硫酸铁为[Fe2(OH)n(SO4)3-n/2]m(n＜2，m＞10)，硫酸铁含量20～21％，所述聚合硫酸铁的加入量为3～5g/L。
进一步，所述活性炭的质量加入量以滤液a体积计为0.001～0.01g/ml，优选0.005g/ml。
进一步，所述③中将滤饼a用蒸馏水洗涤，抽滤，获得滤饼b和滤液b，将滤液b和滤液a合并后加入活性炭(优选HC-767针剂用活性炭)；所述活性炭的质量加入量以滤液a和滤液b总体积计为0.001～0.01g/ml，优选0.005g/ml。
进一步，所述④中将滤饼c用蒸馏水洗涤，抽滤，获得滤饼d和滤液d，合并滤液c和滤液d并调节pH值为2.0～2.5。
本发明所述湿菌体按如下步骤制备：
(1)斜面培养
将含腈水解酶的工程菌或含腈水解酶突变体的工程菌接种至斜面培养基，30℃培养24h，获得菌体斜面；斜面培养基终浓度组成为：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，琼脂30g/L，溶剂为去离子水，pH值自然；
(2)种子培养
从菌体斜面挑取一接种环菌体接种至种子培养基，37℃培养10h，获得种子液；种子培养基终浓度组成为：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，卡纳霉素50mg/L，溶剂为去离子水，pH值自然；
(3)发酵培养
将步骤(2)获得的种子液以体积浓度2％的接种量接种至发酵罐(优选5L发酵罐，装液量60％)，37℃发酵培养4h后，降温至30℃，添加终浓度10g/L乳糖进行诱导，诱导培养至OD值达到25-40，停止发酵，发酵过程中pH维持在6.5，取发酵液离心，得到湿菌体；发酵培养基每3L组成为：蛋白胨45g、酵母粉36g、NaCl30g、甘油36g、磷酸二氢钾4.08g、磷酸氢二钾6.84g、硫酸镁1.125g、硫酸铵15g，溶剂为去离子水，pH值为6.5。
此外，本发明还提供另一种分离纯化1-氰基环己基乙酸的方法，其所述分离纯化方法为：①将步骤(1)获得的转化液调pH值至7.3～8.0，离心，获得上清液和沉淀；②取上清液加入1.5～4倍体积的无水乙醇(优选4倍)，在20～30℃、200rpm条件下搅拌1h，抽滤，获得滤液A和滤饼A；将滤液A在35℃减压浓缩至无液体流出，获得浓缩液；③向浓缩液中加去离子水定容至浓缩前体积，再加入活性炭(优选HC-767针剂用活性炭)，60℃搅拌30min，抽滤，获得滤液B和滤饼B，将滤饼B用蒸馏水洗涤，抽滤，获得滤饼C和滤液C；所述活性炭的质量加入量以浓缩前浓缩液体积(即滤液A体积)计为0.001～0.01g/ml，优选0.005g/ml；④合并滤液B和滤液C并调节pH值为2.0～2.5，20～30℃静置沉淀，抽滤，获得滤饼D和滤液D，将滤饼D干燥，获得1-氰基环己基乙酸。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
本发明提供一种1-氰基环己基乙酸的制备方法，首先采用微生物转化的方法对底物1-氰基环己基乙腈进行催化，然后采用分步分离的方法对转化液进行分离纯化，最终获得了蛋白残留100PPM以下，收率在85％以上，纯度达到98％的产物，很好的解决了后续加氢反应生成加巴喷丁时由于蛋白浓度过高对催化剂产生毒害作用的问题，也提高了加巴喷丁的产量；本发明较有机溶剂法对环境未造成污染，有机溶剂不仅对环境造成 污染，需回收再利用，还威胁到人体的健康；本发明简便易操作，耗时少，可直接应用于工业化生产。本发明在保证1-氰基环己基乙酸含量的前提下，也保证了1-氰基环己基乙酸的收率和纯度，提高了生产效益，使生产加巴喷丁成本较化学法相比减少30％以上。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1含腈水解酶的重组基因工程菌的构建
本发明采用快速核酸提取仪及微生物基因组提取试剂盒(美国MP公司)提取敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)ZJB09122基因组DNA。该菌种保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M 209044，已在先前申请的专利CN101629192 B中披露。
根据NCBI上报道的敏捷食酸菌腈水解酶基因及同源性分析，设计了一对克隆引物用以扩增AcN基因：
序列1：上游引物AcN(F)
5’-ATGGTTTCGTATAACAGCAAG-3’
序列2：下游引物AcN(R)
5’-CTACTTTGCTGGGACCGG-3’
以敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)ZJB09122基因组DNA为模板进行聚合酶链式反应(PCR)。PCR体系为：模板(～10ng/μL)1μL，上游引物AcN1(F)(25μM)1μL，下游引物AcN1(R)(25μM)1μL，dNTPs(2.5mM)1μL，10×Buffer for pfu5μL，pfu DNA聚合酶(5U/μL)1μL，ddH2O40μL。PCR反应进程为：(1)95℃预变性5min，(2)94℃变性50s，(3)55℃退火1.5min，(4)72℃延伸2min，步骤(2)-(4)重复35个循环，(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。
取5μL PCR反应液用0.9％琼脂糖凝胶电泳检测。切胶回收该片段并 纯化，利用TaqDNA聚合酶向片段5’端引入碱基A。在T4DNA连接酶作用下将该片段同T载体进行连接，得到克隆重组质粒pMD18-T-AcN。将该重组质粒转化至大肠杆菌JM109中，测序，利用软件分析测序结果。
根据分析结果设计表达引物：
序列3：上游引物AcN(F)
5’-AATGGATCCATGGTTTCGTATAACAGCAAG-3’
序列4：下游引物AcN(R)
5’-AGGGTCGACCTACTTTGCTGGGACCGG-3’
为了便于原核表达载体的构建，在5’端引物和3’端引物中分别引入了NcoⅠ、XhoⅠ限制酶位点(下划线部分)。
在引物3和引物4的引发下，利用高保真Pyrrobest DNA聚合酶进行扩增，获得长为1116bp的AcN腈水解酶基因片段。
获得的AcN腈水解酶基因片段与pET28b(+)都分别用Nco I和Xho I进行双酶切，大约酶切6h后，回收酶切产物，利用T4连接酶在16℃下连接16h，得到重组表达质粒pET28b(+)-AcN。将表达质粒pET28b(+)-AcN转化至E.coli BL21(DE3)受体菌，涂布于含卡那霉素(终浓度50mg/L)的LB琼脂平板上，37℃培养过夜后，平板上长出菌落(黄白色圆形菌落)。随机挑取单克隆，培养后提取质粒进行测序，得到原始阳性克隆含腈水解酶的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28b(+)-AcN。
根据Quikchange定点突变方法，设计了一对引物(下划线部分为突变位点)：
序列5：上游引物F168V(F)
5’-GAGCACGTTCAGCCGCTGTCCAAAT-3’
序列6：下游引物F168V(R)
5’-CGGCTGAACGTGCTCCCAGCAGTTC-3’
以pET28b-AcN质粒为模板，进行PCR扩增(PCR反应参数为：94 ℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸6min，重复30个循环；72℃继续延伸10min)。将扩增后回收的PCR产物用DpnI酶切3小时，酶切产物纯化后转化至E.coli BL21(DE3)受体菌，涂布于含卡那霉素(终浓度50mg/L)的LB琼脂平板上，37℃培养过夜后，随机挑取菌落提取质粒进行测序，测序结果表明得到阳性克隆E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-AcNIT，该菌落即为含腈水解酶突变体的工程菌。
实施例2含重组腈水解酶突变体的工程菌发酵培养
(1)斜面培养
将实施例1获得的含腈水解酶突变体的工程菌接种至斜面培养基，30℃培养24h，获得菌体斜面；斜面培养基终浓度组成为：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，琼脂30g/L，溶剂为去离子水，pH值自然；
(2)种子培养
从菌体斜面挑取一接种环菌体接种至种子培养基，37℃培养10h，获得种子液；种子培养基终浓度组成为：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，卡纳霉素50mg/L，溶剂为去离子水，pH值自然；
(3)发酵培养
将步骤(2)获得的种子液以体积浓度2％的接种量接种至5L发酵罐(装液量60％)，37℃发酵培养4h后，降温至30℃，添加终浓度10g/L乳糖进行诱导，诱导培养至OD值达到25-40时，停止发酵，发酵过程中pH维持在6.5，取发酵液经离心机9000rpm，离心10min，得到85.6g湿菌体。发酵培养基每3L组成为：蛋白胨45g、酵母粉36g、NaCl30g、甘油36g、磷酸二氢钾4.08g、磷酸氢二钾6.84g、硫酸镁1.125g、硫酸铵15g，溶剂为去离子水，pH值为6.5。
实施例3：1-氰基环己基乙酸的制备
(1)转化反应：取实施例2制备的湿菌体50g，加入1L的去离子水 制成菌悬液，向菌悬液中加入1-氰基环己基乙腈148.2g，35℃搅拌反应6个小时，转化反应结束后，获得转化液1L。取转化液样品通过高效液相色谱检测产物含量，可知底物转化率为92％。
(2)分离纯化
取步骤(1)转化反应液50ml，用NaOH调整pH值至7.3，9000rpm离心10min，得上清液和沉淀；向上清液中加入终浓度3g/L聚合硫酸铁([Fe2(OH)n(SO4)3-n/2]m(n＜2，m＞10)，硫酸铁质量含量20-21％)，30℃、200rpm条件下搅拌1分钟，再在50rpm条件下搅拌5分钟，抽滤，得滤液a和滤饼a。将滤饼a用蒸馏水洗涤，抽滤，获得滤饼b和滤液b；合并滤液a和滤液b并加入终浓度0.001g/ml活性炭(HC-767针剂用活性炭)，60℃搅拌30min，抽滤，得滤液c和滤饼c。滤饼c用蒸馏水洗涤，抽滤，获得滤饼d和滤液d。合并滤液c和滤液d，检测滤液中蛋白质的残留，为81PPM。用浓盐酸(质量浓度36～38％)调整pH至2.0，20-30℃静置30min，抽滤，获得滤饼e和滤液e，滤饼e即为1-氰基环己基乙酸晶体，将晶体在50℃烘干，得1-氰基环己基乙酸成品，质量为6.727g，纯度为98.47％，收率为87.46％。
产物浓度的检测采用反相HPLC方法。色谱柱为C18柱，流动相为缓冲液(0.58g的磷酸二氢氨和1.83g过氯化钠溶解在1000ml水中，用高氯酸调节PH＝1.8，过滤)：乙腈＝76:24；流速1.0mL/min；检测波长215nm；柱温40℃；保留时间18-19min。
取步骤(2)的成品进行液相检测，其出峰时间在18.06min，峰面积为5089379，质量为6.727g，收率为87.46％。纯度检测：另外称取0.1672g产物标准品，用去离子水定容到10mL，检测其峰面积，然后与标准品进行对比，得纯度98.47％。
实施例4
将实施例3步骤(2)中聚合硫酸铁的加入量改为5g/L，其它操作同实施例3，得蛋白残留62PPM，1-氰基环己基乙酸成品6.583g，纯度为99.46％，收率为85.58％。
实施例5
取实施例3步骤(1)方法获得的转化液50mL，用NaOH调整pH为7.3，9000rpm离心10min，得上清液49.3ml和沉淀。向上清液中加入200mL无水乙醇，200rpm搅拌1h，抽滤，滤液50ml在35℃旋转蒸发至无液体流出，回收乙醇，获得浓缩液使用去离子水定容至50ml。向定容后的浓缩液中加入终浓度0.001g/ml活性炭，60℃搅拌30min，抽滤，得滤液A和滤饼A，将滤饼A用蒸馏水洗涤，抽滤，获得滤液B和滤饼B，合并滤液A和滤液B，用浓盐酸(质量浓度36～38％)调整pH至2.0，20-30℃静置30min，抽滤，获得滤液C和滤饼C，滤饼C即为1-氰基环己基乙酸晶体，50℃烘干，得蛋白残留23PPM，1-氰基环己基乙酸成品6.493g，纯度为98.34％，收率为84.42％。
实施例6
将实施例5中无水乙醇用量改为75mL，其它操作同实施例5，得蛋白残留116PPM，1-氰基环己基乙酸成品6.589g，纯度为99.72％，收率为85.67％。
实施例7
将实施例5中转化液pH调整为8.0，其它操作同实施例5，得蛋白残留45PPM，1-氰基环己基乙酸成品6.309g，纯度为98.01％，收率为82.03％。
实施例8
将实施例5中活性炭用量改为0.01g/ml，其它操作同实施例5，得蛋白残留25PPM，1-氰基环己基乙酸成品6.256g，纯度为99.53％，收率为81.34％。
实施例9
将实施例5中浓盐酸调节pH值改为2.5，其它操作同实施例5，得蛋白残留36PPM，1-氰基环己基乙酸成品6.34g，纯度为98.35％，收率为82.43％。
实施例10
将实施例3中活性炭用量改为0.005g/ml，其它操作同实施例3，得蛋白残留34PPM，1-氰基环己基乙酸成品6.727g，纯度为99.01％，收率为87.46％。
实施例11
转化反应将实施例3步骤(1)中去离子水改成1L pH7.0的PBS缓冲液，其他操作同实施例3步骤(1)。分离纯化同实施例5。得转化反应转化率93％，蛋白残留34PPM，1-氰基环己基乙酸成品6.528g，纯度为98.55％，收率为84.87％。
Claims (9)
1.一种1-氰基环己基乙酸的制备方法，其特征在于所述方法为：(1)生物转化：以腈水解酶为催化剂，以1-氰基环己基乙腈为底物，以pH值为7.0的缓冲液或去离子水为反应介质，在35℃进行转化反应，反应结束后，获得转化液；所述腈水解酶为含腈水解酶突变体的工程菌经发酵培养获得的湿菌体，所述含腈水解酶突变体的工程菌按如下方法获得：(a)以敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)ZJB09122基因组DNA为模板，以序列1和序列2为引物，通过PCR方法获得含重组腈水解酶基因的克隆载体；然后再以含重组腈水解酶基因的克隆载体为模板，以序列3和序列4为引物，使用高保真的DNA聚合酶扩增目标腈水解酶基因，运用酶切连接的方法，构建了含重组腈水解酶基因的表达载体；序列1：5’-ATGGTTTCGTATAACAGCAAG-3’，序列2：5’-CTACTTTGCTGGGACCGG-3’，
序列3：5’-AATGGATCCATGGTTTCGTATAACAGCAAG-3’，序列4：5’-AGGGTCGACCTACTTTGCTGGGACCGG-3’；
(b)以步骤(a)构建的含重组腈水解酶基因的表达载体为模版，以序列5和序列6为引物，根据Quikchange定点突变方法，扩增得到含重组腈水解酶突变体的表达载体，并将突变表达载体转化至宿主菌，得到含腈水解酶突变体的工程菌；
序列5：5’-GAGCACGTTCAGCCGCTGTCCAAAT-3’；
序列6：5’-CGGCTGAACGTGCTCCCAGCAGTTC-3’；
(2)分离纯化：①将步骤(1)获得的转化液调pH值至7.3～8.0，离心，获得上清液和沉淀；②取上清液加入聚合硫酸铁，搅拌絮凝，抽滤，获得滤液a和滤饼a；③向滤液a中加入活性炭，搅拌除色，抽滤，获得滤液c和滤饼c；④将滤液c调节pH值为2.0～2.5，静置沉淀，抽滤，获得滤饼e和滤液e，将滤饼e干燥，获得1-氰基环己基乙酸。
2.如权利要求1所述1-氰基环己基乙酸的制备方法，其特征在于所述催化剂的质量浓度为2.5～50g/L反应介质，底物的初始浓度为1mol/L反应介质。
3.如权利要求1所述1-氰基环己基乙酸的制备方法，其特征在于所述步骤②具体为：取上清液加入终浓度3～5g/L聚合硫酸铁，在20～30℃、200rpm条件下搅拌1-10min，然后再在30℃、50rpm条件下搅拌5-30min，4℃下静置沉降20-60min，抽滤，获得滤液a和滤饼a。
4.如权利要求1所述1-氰基环己基乙酸的制备方法，其特征在于所述聚合硫酸铁的加入量为3～5g/L。
5.如权利要求1所述1-氰基环己基乙酸的制备方法，其特征在于所述③中将滤饼a用蒸馏水洗涤，抽滤，获得滤饼b和滤液b，将滤液b和滤液a合并后加入活性炭；所述活性炭的质量加入量以滤液a和滤液b总体积计为0.001～0.01g/ml。
6.如权利要求1所述1-氰基环己基乙酸的制备方法，其特征在于所述④中将滤饼c用蒸馏水洗涤，抽滤，获得滤饼d和滤液d，合并滤液c和滤液d并调节pH值为2.0～2.5。
7.如权利要求1所述1-氰基环己基乙酸的制备方法，其特征在于所述湿菌体按如下步骤制备：
(1)斜面培养
将含腈水解酶的工程菌或含腈水解酶突变体的工程菌接种至斜面培养基，30℃培养24h，获得菌体斜面；斜面培养基终浓度组成为：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂30g/L，溶剂为去离子水，pH值自然；
(2)种子培养
从菌体斜面挑取一接种环菌体接种至种子培养基，37℃培养10h，获得种子液；种子培养基终浓度组成为：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，卡纳霉素50mg/L，溶剂为去离子水，pH值自然；
(3)发酵培养
将步骤(2)获得的种子液以体积浓度2％的接种量接种至发酵罐，37℃发酵培养4h后，降温至30℃，添加终浓度10g/L乳糖进行诱导，诱导培养至OD值达到25-40，停止发酵，发酵过程中pH维持在6.5，取发酵液离心，得到湿菌体；发酵培养基每3L组成为：蛋白胨45g、酵母粉36g、NaCl30g、甘油36g、磷酸二氢钾4.08g、磷酸氢二钾6.84g、硫酸镁1.125g、硫酸铵15g，溶剂为去离子水，pH值为6.5。
8.如权利要求1所述1-氰基环己基乙酸的制备方法，其特征在于步骤(2)分离纯化方法为：①将步骤(1)获得的转化液调pH值至7.3～8.0，离心，获得上清液和沉淀；②取上清液加入无水乙醇，在20～30℃、200rpm条件下搅拌1h，抽滤，获得滤液A和滤饼A；将滤液A在35℃减压浓缩至无液体流出，获得浓缩液；③使用去离子水将浓缩液定容至浓缩前体积，再加入活性炭，60℃搅拌30min，抽滤，获得滤液B和滤饼B，将滤饼B用蒸馏水洗涤，抽滤，获得滤饼C和滤液C；所述活性炭的质量加入量以定容后浓缩液体积计为0.001～0.01g/ml；④合并滤液B和滤液C并调节pH值为2.0～2.5，20～30℃静置沉淀，抽滤，获得滤饼D和滤液D，将滤饼D干燥，获得1-氰基环己基乙酸。
9.如权利要求8所述1-氰基环己基乙酸的制备方法，其特征在于无水乙醇体积加入量是上清液体积的1.5-4倍。
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