CN102304485B - 克雷伯氏菌及其用于生产l(+)-酒石酸或其盐的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新的克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)及其用于生产L(+)-酒石酸或其盐的方法。本发明克雷伯氏菌菌株具有如SEQIDNO:1所示的16SrDNA序列。使用本发明克雷伯氏菌菌株可对顺式环氧琥珀酸或其盐进行水解生成L(+)-酒石酸或其盐，且具有较高的产量。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种克雷伯氏菌及其在L(+)-酒石酸或其盐生产中的用途。
背景技术
L(+)-酒石酸[(2R，3R)-2，3-二羟丁烷-1，4 二羟酸]是一种天然结构的有机酸，在某些植物果实如葡萄、罗望子果实中有较高的含量，广泛应用于食品、医药、化工、纺织、电镀等行业，其需求量正在逐年递增。过去，生产L(+)-酒石酸的主要方法是从葡萄酒的副产物酒石中提取得到，或者以葡萄糖为主要原料通过一步发酵法获得。目前主要采用具有顺式环氧琥珀酸水解酶的微生物来生产L(+)-酒石酸或其盐：先以顺丁烯二酸酐为原料加水得到顺丁烯二酸，再以钨酸或钨酸盐为催化剂使顺丁烯二酸与过氧化氢反应制得顺式环氧琥珀酸，最后利用具有顺式环氧琥珀酸水解酶的微生物将顺式环氧琥珀酸或其盐水解为L(+)-酒石酸或其盐。
目前报道的具有L(+)-酒石酸合成酶的微生物主要有：无色杆菌属(Achromobacter)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、不动杆菌属(Acinetobacter)、诺卡氏菌属(Nocardia)、根瘤菌属(Rhizobium)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和棒杆菌属(Coryncbacterium)。但未见利用克雷伯氏菌(Klebsiella)生产L(+)-酒石酸的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的克雷伯氏菌及其用于生产L(+)-酒石酸或其盐的方法。
本发明的发明人经过长期和深入的研究，从田园土中分离获得了一种新的微生物菌株，它能将顺式环氧琥珀酸或其盐转化为L(+)-酒石酸或其盐。该新的菌株经鉴定为克雷伯氏菌(Klebsiella)。
为实现上述目的，本发明的克雷伯氏菌菌株(Klebsiella sp.)具有如SEQ IDNO：1所示的16S rDNA序列。
本发明的克雷伯氏菌菌株可用于对顺式环氧琥珀酸或其盐进行水解生成L(+)-酒石酸或其盐。
本发明的克雷伯氏菌菌株生产L(+)-酒石酸或其盐的方法是：先在种子培养基中培养所述克雷伯氏菌的种子液；然后将所述克雷伯氏菌的种子液转接于含有顺式环氧琥珀酸盐的产酶培养基中，培养获得相应的克雷伯氏菌细胞；最后利用所述克雷伯氏菌细胞对顺式环氧琥珀酸或其盐进行水解生成L(+)-酒石酸或其盐。
本发明的克雷伯氏菌株(Klebsiella sp.)命名为克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)BK-58，已于2011年6月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)，保藏登记号为CGMCC No.4949。
与现有技术相比，本发明的优点是：提供了一种新的可用于L(+)-酒石酸或其盐生产的克雷伯氏菌菌株；且使用本发明克雷伯氏菌BK-58生产L(+)-酒石酸可达到较高的产量。
生物材料样品的保藏信息
保藏的生物材料样品：克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)BK-58；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究
所(邮编：100101)；
保藏日期：2011年6月12日；
保藏登记号：CGMCC No.4949。
具体实施方式
在本发明的以下实施例中，所用的斜面培养基和种子培养基的组成如下：
(1)斜面培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂粉15g，加水至1000ml，pH7.5。
(2)种子培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，加水至1000ml，pH7.5。
实施例1：克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)BK-58的鉴定
步骤1：变性
在斜面培养基中挑取克雷伯氏菌BK-58 CGMCC4949于10ul无菌水中，变性后离心取上清作为模板。变性条件为：99℃，10min。
步骤2：PCR扩增
使用细菌16S rDNA PCR鉴定试剂盒(购于TaKaRa公司，货号D310)，进行PCR扩增克雷伯氏菌BK-58 CGMCC4949的16S rDNA片段。
其中，PCR反应体系为：步骤1所得的变性反应液1μl，PCR Premix 25μl，Forward primer(20pmol/μl)0.5μl，Reverse primer(20pmol/μl)0.5μl，16S-free H2O 23μl，总体积50μl。
PCR反应条件如下所示：
94℃ 5min 1个循环
72℃ 5min 1个循环
步骤3：PCR产物的回收和测序
取5μl步骤2所得的PCR产物进行3％琼脂糖凝胶电泳鉴定，然后使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购于TaKaRa公司，货号DV805A)切胶回收目的片段，并以16S Forward、16S Internal和16S Reverse为引物进行DNA测序(TaKaRa公司)。测序结果显示，克雷伯氏菌BK-58 CGMCC4949的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，即本发明的克雷伯氏菌具有如SEQ ID NO：1所示的16S rDNA序列。
将上述实施例1中得到的具有如SEQ ID NO：1所示的16S rDNA核苷酸序列，用BLAST程序在NCBI数据库中进行比对分析，其比对结果如表1所示。比对结果显示，所测试的菌株属于克雷伯氏菌属(Klebsiella)。
表1 克雷伯氏菌BK-58 CGMCC4949的16S rDNA序列的BLAST比对结果
(续上表)
(续上表)
实施例2：利用顺式环氧琥珀酸钠和克雷伯氏菌菌株BK-58 CGMCC4949生产L(+)-酒石酸
在本实施例中，所用的产酶培养基的组成为：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，顺式环氧琥珀酸钠17.6g，加水至1000ml，pH7.5。
在本实施例中，样品的红外光谱用Nicolet-Nexus670傅立叶转换式红外光谱仪检测；样品的核磁共振氢谱和碳谱用Bruker Avance DMX500核磁共振仪检测；样品的质谱用Bruker Esquire 3000plus质谱仪检测；样品的旋光度用WZZ-2B旋光仪检测。
先将克雷伯氏菌BK-58 CGMCC4949的菌株保藏在斜面培养基上；然后将斜面培养基上的克雷伯氏菌BK-58 CGMCC4949接种于装有30ml种子培养基的250ml三角瓶中，在30℃、200rpm的转速条件下振荡培养24h，得到克雷伯氏菌BK-58的种子液。吸取10ml上述克雷伯氏菌BK-58的种子液接种于装有200ml产酶培养基的1000ml三角瓶中，在30℃、200rpm的转速条件下振荡培养24h，以获得相应的克雷伯氏菌细胞。5000rpm、30min离心收集克雷伯氏菌细胞，将该克雷伯氏菌细胞加入到200ml的浓度为1M的顺式环氧琥珀酸钠中，30℃振荡培养，反应72h，得到转化液。向转化液中加入过量的CaCl2，对产物进行过滤，将过滤得到的沉淀进行水洗得到48g酒石酸钙，再对酒石酸钙依次进行硫酸酸解、阴和阳离子交换柱精制、浓缩、结晶、分离和烘干后，得到28g固体产物。经红外光谱、紫外光谱、核磁共振谱、质谱检测，确定该固体产物为酒石酸。经旋光度检测，该固体产物的比旋光度为
证明该固体产物为右旋型酒石酸，即L(+)-酒石酸，且纯度为99.9％。
实施例3：利用顺式环氧琥珀酸钾和克雷伯氏菌BK-58 CGMCC4949生产L(+)-酒石酸
在本实施例中，产酶培养基的组成为：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，顺式环氧琥珀酸钾20.8g，加水至1000ml，pH7.5。
在本实施例中，样品的红外光谱用Nicolet-Nexus670傅立叶转换式红外光谱仪检测；样品的核磁共振氢谱和碳谱用Bruker Avance DMX500核磁共振仪检测；样品的质谱用Bruker Esquire 3000plus质谱仪检测；样品的旋光度用WZZ-2B旋光仪检测。
先将克雷伯氏菌BK-58 CGMCC4949的菌株保藏在斜面培养基上；然后将斜面培养基上的克雷伯氏菌BK-58 CGMCC4949接种于装有30ml种子培养基的250ml三角瓶中，在30℃、200rpm的转速条件下振荡培养24h，得到克雷伯氏菌BK-58的种子液。吸取10ml上述克雷伯氏菌BK-58的种子液接种于装有200ml产酶培养基的1000ml三角瓶中，在30℃、200rpm的转速条件下振荡培养24h，以获得相应的克雷伯氏菌细胞。5000rpm、30min离心收集克雷伯氏菌细胞，将该克雷伯氏菌细胞加入到200ml的浓度为1M的顺式环氧琥珀酸钾中，30℃振荡培养，反应72h，得到转化液。向转化液中加入过量的CaCl2，对产物进行过滤，将过滤得到的沉淀进行水洗得到47g酒石酸钙，再对酒石酸钙依次进行硫酸酸解、阴和阳离子交换柱精制、浓缩、结晶、分离和烘干后，得到27.5g固体产物。经红外光谱、紫外光谱、核磁共振谱、质谱检测，确定该固体产物为酒石酸。经旋光度检测，该固体产物的比旋光度为
证明该固体产物为右旋型酒石酸，即L(+)-酒石酸，且纯度为99.9％。
综上可知，本发明的克雷伯氏菌BK-58 CGMCC4949具有将顺式环氧琥珀酸或其盐水解为L(+)-酒石酸或其盐的特性。
需要说明的是，本发明所述的顺势环氧琥珀酸盐为顺式环氧琥珀酸和各种金属离子形成的盐，可以是上述的顺势环氧琥珀酸钠或顺式环氧琥珀酸钾，还可以是顺势环氧琥珀酸钙等其他顺式环氧琥珀酸的盐。
<110> 杭州宝晶生物化工有限公司
<120> 克雷伯氏菌及其用于生产L(+)-酒石酸或其盐的方法
<160> 1
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 1454
<212> DNA
<213> 克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)
<400> 1
acgctggcgg caggcctaac acatgcaagt cgaacggtag cacagagagc ttgctctcgg 60
gtgacgagtg gcggacgggt gagtaatgtc tgggaaactg cctgatggag ggggataact 120
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ggatcagaat gccacggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat 1380
gggagtgggt tgcaaaagaa gtaggtagct taaccttcgg gagggcgctt accactttgt 1440
gattcatgac tggg 1454
Claims (3)
1.一种克雷伯氏菌菌株(Klebsiella sp.)，其特征在于:所述克雷伯氏菌菌株的保藏登记号为CGMCC No.4949，其具有如SEQ ID NO:1所示的16S rDNA序列。
2.一种权利要求1的克雷伯氏菌菌株的用途，其特征在于：用于对顺式环氧琥珀酸或其盐进行水解生成L(+)-酒石酸或其盐。
3.一种使用权利要求1的克雷伯氏菌菌株生产L(+)-酒石酸或其盐的方法，其特征在于:先在种子培养基中培养所述克雷伯氏菌的种子液；然后将所述克雷伯氏菌的种子液转接于含有顺式环氧琥珀酸盐的产酶培养基中，培养获得相应的克雷伯氏菌细胞；最后利用所述克雷伯氏菌细胞对顺式环氧琥珀酸或其盐进行水解生成L(+)-酒石酸或其盐。
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| M.Rosenberg et al..Production of L-tartaric acid by immobilized bacterial cells Nocardia tartaricans.《Biotechnology letters》.1999,第21卷(第6期),第491-495页. |
| Production of L-tartaric acid by immobilized bacterial cells Nocardia tartaricans;M.Rosenberg et al.;《Biotechnology letters》;19990630;第21卷(第6期);第491-495页 * |
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