CN103923866B - 韩国假单胞菌及其制备内消旋酒石酸或其盐的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种韩国假单胞菌BK-9，具有如SEQ？ID？NO:1所示的16S？rDNA序列，命名为韩国假单胞菌<i>Pseudomonas？koreensis</i>，已保藏于CGMCC，保藏登记号为CGMCC？No.8395。本发明提供的一种韩国假单胞菌通过水解将反式环氧琥珀酸或其盐转化为内消旋酒石酸或其盐，且获得较高的产量，充分满足市场需求，具有实用性。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种韩国假单胞菌及其生产内消旋酒石酸或其盐的方法。
背景技术
内消旋酒石酸是一种有机酸，主要用于制备防盐结块剂,也可用于制备药物、果子精油、焙粉以及媒染剂、鞣剂等，其需求量正在逐年递增。目前已报道的生产内消旋酒石酸的方法主要有3种，一是以顺丁烯二酸为原料，以钼酸盐或钨酸盐为催化剂，使顺丁烯二酸和过氧化氢反应生成中间产物顺式环氧琥珀酸，进而合成内消旋酒石酸；二是L(+)-酒石酸在强碱条件下加热，发生分子内部空间结构上的转变，生成内消旋酒石酸；三是生物合成法，采用具有反式环氧琥珀酸水解酶的微生物来生产内消旋酒石酸或其盐：即以反丁烯二酸酐为原料加水得到反丁烯二酸，再以钨酸或钨酸盐为催化剂，使反丁烯二酸与过氧化氢反应制得反式环氧琥珀酸，最后利用具有反式环氧琥珀酸水解酶的微生物将反式环氧琥珀酸或其盐水解为内消旋酒石酸或其盐。
目前报道的具有反式环氧琥珀酸水解酶的微生物只有恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、黄杆菌(flavobacterium)属。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的韩国假单胞菌菌株(PseudomonaskoreensisBK-9)，具有如SEQIDNO:1所示的16SrDNA序列，该韩国假单胞菌命名为韩国假单胞菌Pseudomonaskoreensis，已于2013年10月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)，保藏登记号为CGMCCNo.8395，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所(邮编：100101)。
本发明的另一个目的是提供韩国假单胞菌菌株在制备内消旋酒石酸或其盐中应用，通过以下步骤实现：先在种子培养基中培养所述韩国假单胞菌的种子液；然后将所述韩国假单胞菌的种子液转接入产酶培养基中，培养获得韩国假单胞菌细胞；最后利用所述韩国假单胞菌细胞对反式环氧琥珀酸或其盐进行水解生成内消旋酒石酸或其盐。
本发明制备内消旋酒石酸或其盐的优选具体步骤是：将保存于斜面培养基上的韩国假单胞菌BK-9(CGMCCNo.8395)接种于装有50ml种子培养基的250ml三角瓶中,30℃、200rpm振荡培养24h，得到所述韩国假单胞菌的种子液；然后取3ml上述韩国假单胞菌的种子液接种于装有300ml产酶培养基的1000ml三角瓶中，30℃、200rpm振荡培养48h，获得相应的韩国假单胞菌细胞；接着7000rpm、15min离心收集韩国假单胞菌细胞，将该韩国假单胞菌细胞加入到300ml的浓度为0.8M的反式环氧琥珀酸或其盐中，37℃振荡培养，反应48h，得到转化液；最后向转化液中加入过量的CaCl2，形成内消旋酒石酸钙沉淀，过滤得到沉淀并水洗，再对内消旋酒石酸钙依次进行硫酸酸解、阴、阳离子交换柱精制、减压浓缩、结晶、分离和烘干得到内消旋酒石酸或其盐的成品。
其中反式环氧琥珀酸盐为反式环氧琥珀酸与各种阳离子所形成的盐，阳离子选自钠、钾、铵、钙。
斜面培养基：葡萄糖5g，牛肉膏5g，氯化铵1g，硫酸镁0.1g,磷酸二氢钾0.6g,琼脂粉15g，加水至1000ml，pH7.0。
种子培养基：葡萄糖5g，牛肉膏5g，氯化铵1g，硫酸镁0.1g,磷酸二氢钾0.6g,加水至1000ml，pH7.0。
产酶培养基组成为：葡萄糖10g，牛肉膏5g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.1g，氯化铵1g,反式环氧琥珀酸钠10g，加水至1000ml，pH7.0。
本发明的发明人经过长期和深入的研究，从田园土中分离获得了一种新的微生物菌株，它能将反式环氧琥珀酸或其盐转化为内消旋酒石酸或其盐。该新的菌株经鉴定为韩国假单胞菌(Pseudomonaskoreensis)。本发明的韩国假单胞菌菌株可用于对反式环氧琥珀酸或其盐进行水解生成内消旋酒石酸或其盐，获得的内消旋酒石酸经过了详细的鉴定。
本发明提供了一种新的可用于内消旋酒石酸或其盐生产的韩国假单胞菌菌株(Pseudomonaskoreensis)，且使用本发明韩国假单胞菌BK-9通过对反式环氧琥珀酸或其盐进行水解生成内消旋酒石酸或其盐，并可达到较高的产量，充分满足市场需求，具有实用性。
生物材料样品的保藏信息
保藏的生物材料样品：韩国假单胞菌(Pseudomonaskoreensis)BK-9；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所(邮编：100101)；保藏日期：2013年10月25日；保藏登记号：CGMCCNo.8395。
具体实施方式
在本发明通过实施例作进一步的说明。
以下实施例中，所用的斜面培养基和种子培养基的组成如下：
(1)斜面培养基：葡萄糖5g，牛肉膏5g，氯化铵1g，硫酸镁0.1g,磷酸二氢钾0.6g,琼脂粉15g，加水至1000ml，pH7.0。
(2)种子培养基：葡萄糖5g，牛肉膏5g，氯化铵1g，硫酸镁0.1g,磷酸二氢钾0.6g,加水至1000ml，pH7.0。
(3)产酶培养基：葡萄糖10g，牛肉膏5g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.1g，氯化铵1g,反式环氧琥珀酸钠10g，加水至1000ml，pH7.0。
(4)筛选培养基：反式环氧琥珀酸钠10g，酵母提取物1g,磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.1g，氯化铵1g，加水至1000ml,PH7.0。
实施例1：韩国假单胞菌(Pseudomonaskoreensis)BK-9的筛选
称取5g田园土样品，置于装有50ml筛选培养基的250ml三角瓶中，30℃、200rpm振荡培养3天。取一环培养液，并在固体筛选培养基平板上划斜线，30℃倒置培养2天。挑取平板上的单菌落，接种于装有50ml产酶培养基的250ml三角瓶中，30℃、200rpm下振荡培养48h。7000rpm下离心15min，收集细胞，于4℃放置备用。将离心收集的细胞用10ml0.8MpH7.0反式环氧琥珀酸钠悬浮，30℃振荡反应1天后，用高效液相色谱法鉴定反应液中有无内消旋酒石酸产生。本发明田园土样品来源于杭州市。
本发明总共对535个菌株进行了筛选，得到了一株具有将反式环氧琥珀酸或其盐水解为内消旋酒石酸或其盐特性的菌株，经CGMCC证明存活。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏登记号为CGMCCNo.8395，命名为：韩国假单胞菌(Pseudomonaskoreensis)BK-9，保藏日：2013年10月25日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所(邮编：100101)。
实施例2：韩国假单胞菌BK-9(PseudomonaskoreensisBK-9)的鉴定
步骤1：变性
在斜面培养基中挑取韩国假单胞菌BK-9CGMCC8395于10ul无菌水中，变性后离心取上清作为模板。变性条件为：99℃,10min。
步骤2：PCR扩增
使用细菌16SrDNAPCR鉴定试剂盒(购于TaKaRa公司，货号D310)，进行PCR扩增韩国假单胞菌BK-9CGMCC8395的16SrDNA片段。
其中，PCR反应体系为：步骤1所得的变性反应液1μl，PCRPremix25μl，Forwardprimer(20pmol/μl)0.5μl，Reverseprimer(20pmol/μl)0.5μl，16S-freeH2O23μl，总体积50μl。
PCR反应条件如下所示：
步骤3：PCR产物的回收和测序
取5μl步骤2所得的PCR产物进行3％琼脂糖凝胶电泳鉴定，然后使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购于TaKaRa公司，货号DV805A)切胶回收目的片段，并以16SForward、16SInternal和16SReverse为引物进行DNA测序(TaKaRa公司)。测序结果显示，韩国假单胞菌BK-9CGMCC8395的16SrDNA核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，即本发明的韩国假单胞菌具有如SEQIDNO:1所示的16SrDNA序列。
将上述实施例1中得到的具有如SEQIDNO:1所示的16SrDNA核苷酸序列，用BLAST程序在NCBI数据库中进行比对分析，其比对结果如表1所示。比对结果显示，所测试的菌株属于假单胞菌属(Pseudomonas)。
表1韩国假单胞菌BK-9CGMCC8395的16SrDNA序列的BLAST比对结果
实施例3：利用反式环氧琥珀酸钠和韩国假单胞菌BK-9CGMCC8395生产内消旋酒石酸
在本实施例中，所用的产酶培养基的组成为：葡萄糖10g，牛肉膏5g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.1g，氯化铵1g,反式环氧琥珀酸钠10g，加水至1000ml，pH7.0。
本实施例中，样品的红外光谱用Nicolet-Nexus670傅立叶转换式红外光谱仪检测；样品的核磁共振氢谱和碳谱用BRUKERAVIII500M核磁共振仪检测；样品的质谱用LCDDecaxpmax离子阱质谱仪检测；样品的旋光度用WZZ-2B旋光仪检测。
先将韩国假单胞菌BK-9CGMCC8395的菌株保藏在斜面培养基上；然后将斜面培养基上的韩国假单胞菌BK-9CGMCC8395接种于装有50ml种子培养基的250ml三角瓶中，在30℃、200rpm的转速条件下振荡培养24h，得到韩国假单胞菌BK-9的种子液。吸取3ml上述韩国假单胞菌BK-9的种子液接种于装有300ml产酶培养基的1000ml三角瓶中，30℃、200rpm振荡培养48h，以获得相应的韩国假单胞菌细胞。7000rpm、15min离心收集韩国假单胞菌细胞，将该韩国假单胞菌细胞加入到300ml的浓度为0.8M的反式环氧琥珀酸钠中，37℃振荡培养，反应48h，得到转化液。向转化液中加入过量的CaCl2，对产物进行过滤，将过滤得到的沉淀进行水洗得到75g酒石酸钙，再对酒石酸钙依次进行硫酸酸解、阴和阳离子交换柱精制、减压浓缩、结晶、分离和烘干，得到8.4g固体产物。经红外光谱、核磁共振谱、质谱检测，确定该固体产物为酒石酸。经旋光度检测，该固体产物的比旋光度为0，证明该固体产物为内消旋酒石酸，且纯度为99.9％。
实施例4：利用反式环氧琥珀酸钾和韩国假单胞菌BK-9CGMCC8395生产内消旋酒石酸
在本实施例中，产酶培养基的组成为：葡萄糖10g，牛肉膏5g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.1g，氯化铵1g,反式环氧琥珀酸钠10g，加水至1000ml，pH7.0。
在本实施例中，样品的红外光谱用Nicolet-Nexus670傅立叶转换式红外光谱仪检测；样品的核磁共振氢谱和碳谱用BRUKERAVIII500M核磁共振仪检测；样品的质谱用LCDDecaxpmax离子阱质谱仪检测；样品的旋光度用WZZ-2B旋光仪检测。
先将韩国假单胞菌BK-9CGMCC8395的菌株保藏在斜面培养基上；然后将斜面培养基上的韩国假单胞菌BK-9CGMCC8395接种于装有50ml种子培养基的250ml三角瓶中，在30℃、200rpm的转速条件下振荡培养24h，得到韩国假单胞菌BK-9的种子液。吸取3ml上述韩国假单胞菌BK-9的种子液接种于装有300ml产酶培养基的1000ml三角瓶中，在30℃、200rpm的转速条件下振荡培养48h，以获得相应的韩国假单胞菌细胞。7000rpm、15min离心收集韩国假单胞菌细胞，将该韩国假单胞菌细胞加入到300ml的浓度为0.8M的反式环氧琥珀酸钾中，37℃振荡培养，反应48h，得到转化液。向转化液中加入过量的CaCl2，对产物进行过滤，将过滤得到的沉淀进行水洗得到68g酒石酸钙，再对酒石酸钙依次进行硫酸酸解、阴和阳离子交换柱精制、减压浓缩、结晶、分离和烘干后，得到7.8g固体产物。经红外光谱、核磁共振谱、质谱检测，确定该固体产物为酒石酸。经旋光度检测，该固体产物的比旋光度为0，证明该固体产物为内消旋酒石酸，且纯度为99.9％。
综上可知，本发明的韩国假单胞菌BK-9CGMCC8395具有将反式环氧琥珀酸或其盐水解为内消旋酒石酸或其盐的特性。
需要说明的是，本发明所述的反式环氧琥珀酸盐为反式环氧琥珀酸和各种金属离子形成的盐，可以是上述的反式环氧琥珀酸钠或反式环氧琥珀酸钾，还可以是反式环氧琥珀酸钙等其他反式环氧琥珀酸的盐。
<110>杭州宝晶生物股份有限公司
<120>韩国假单胞菌及其制备内消旋酒石酸或其盐的方法
<160>1
<170>PatentInversion3.1
<210>1
<211>1450
<212>DNA
<213>韩国假单胞菌(Pseudomonaskoreensis)
<400>1
ACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGATGAAAGGAGCTTGCTCCTGGAT60
TCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTC120
GAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTG180
CGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCG240
ACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGA300
CTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCAT360
GCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGTTG420
TAGATTAATACTCTGCAATTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGC480
CAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGC540
GCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCC600
AAAACTGGCAAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATG660
CGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTG720
AGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACG780
ATGTCAACTAGCCGTTGGGAGCCTTGAGCTCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGA840
CCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAA900
GCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATC960
CAATGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAGCATTGAGACAGGTGCTGCATGG1020
CTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGT1080
CCTTAGTTACCAGCACGTAATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAG1140
GAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTAC1200
AATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCG1260
TAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAA1320
TCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGG1380
AGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGAGGACGGTTACCACGGTGTGAT1440
CATGACTGGG1450
Claims (4)
1.一种韩国假单胞菌菌株，其特征在于，所述韩国假单胞菌命名为：韩国假单胞菌Pseudomonaskoreensis，2013年10月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCCNo.8395，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所，该韩国假单胞菌的16SrDNA的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
2.根据权利要求1所述的一种韩国假单胞菌菌株在制备内消旋酒石酸或其盐中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过以下步骤实现：
将保存于斜面培养基上的韩国假单胞菌BK-9接种于装有种子培养基的三角瓶中,30℃、200rpm振荡培养24h，得到所述韩国假单胞菌的种子液；然后取上述韩国假单胞菌的种子液接种于装有产酶培养基的三角瓶中，30℃、200rpm振荡培养48h，获得相应的韩国假单胞菌细胞；接着7000rpm、15min离心收集韩国假单胞菌细胞，将该韩国假单胞菌细胞加入到浓度为0.8M的反式环氧琥珀酸或其盐中，37℃振荡培养，反应48h，得到转化液；最后向转化液中加入过量的CaCl2，形成内消旋酒石酸钙沉淀，过滤得到沉淀并水洗，再对内消旋酒石酸钙依次进行硫酸酸解、阴、阳离子交换柱精制、减压浓缩、结晶、分离和烘干得到内消旋酒石酸或其盐的成品；其中斜面培养基为：葡萄糖5g，牛肉膏5g，氯化铵1g，硫酸镁0.1g,磷酸二氢钾0.6g,琼脂粉15g，加水至1000ml，pH7.0；种子培养基为：葡萄糖5g，牛肉膏5g，氯化铵1g，硫酸镁0.1g,磷酸二氢钾0.6g,加水至1000ml，pH7.0；产酶培养基为：葡萄糖10g，牛肉膏5g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.1g，氯化铵1g,反式环氧琥珀酸钠10g，加水至1000ml，pH7.0。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，反式环氧琥珀酸盐选用反式环氧琥珀酸钠或反式环氧琥珀酸钾。
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