CN117778371B - 苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的共固定化酶、制备及应用 - Google Patents
苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的共固定化酶、制备及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的共固定化酶、制备及应用,涉及酶工程技术领域,所述共固定化酶的制备方法为将硅藻土@ZIF‑8微球先用氨丙基三乙氧基硅烷进行氨基化修饰,再用乙烯亚胺聚合物进一步修饰,之后加入京尼平交联,交联后载体与含有苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的磷酸缓冲液混合,搅拌反应15h,离心收集固体,得苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶共固定化酶。本发明固定化方法获得的固定化酶酶活回收率高。
Description
技术领域
本发明涉及酶工程技术领域,具体的涉及一种苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的共固定化酶、制备及应用。
背景技术
β-苯乙醇又称2-苯乙醇,是L-苯丙氨酸的衍生物,具有持久柔和玫瑰香气的高级芳香伯醇,常温下为无色至淡黄色粘稠液体,分子式为C8H10O。β-苯乙醇是广泛应用的香料之一,全球年产量在1万吨左右。β-苯乙醇及其衍生物的应用价值很高,如在食品领域,β-苯乙醇可用于调制蜂蜜、面包、黄酒、葡萄酒等食品的食用香精,起到增效作用;在日用化工领域,可用于调配皂用香精、化妆品香精和防腐剂;在医药领域,β-苯乙醇可作为中间体合成高附加值药物,如苯乙醇苷,用于抗菌、抗炎、抗病毒等。目前苯乙醇的合成方法主要有化学合成法、物理提取法和生物转化法。其中化学合成的β-苯乙醇有副产物难以被去除,导致其味不良,品质不高,无法达到食品和化妆品的香料添加剂的标准;物理提取法植物生长周期长、萃取工艺复杂、收率低导致成本极高难以大规模生产。
近年来,利用生物酶将L-苯丙氨酸转化为β-苯乙醇的体外多酶体系引起了广泛关注,这种多酶体系由三种酶(转氨酶、苯丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶)组成。首先由转氨酶将L-苯丙氨酸转氨为苯丙酮酸,然后由苯丙酮酸脱羧酶将苯丙酮酸脱羧成苯乙醛,最后由醇脱氢酶还原成β-苯乙醇。与传统β-苯乙醇生产相比,这种体外多酶体系生产β-苯乙醇原料成本低、绿色环保、生产效率高,具有很强的竞争力。
虽然酶催化转化效率高、绿色环保,但由于大多数游离酶价格昂贵、稳定性差、不能回收利用,使游离酶的使用成本居高不下。在利用游离酶多酶体系转化生产β-苯乙醇过程中,需要大量使用的苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶同样存在稳定性差、难以回收和使用成本高等问题,因此,如果能提高苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的稳定性,使其能够回收重复使用,将对于降低β-苯乙醇生产成本有重要现实意义。
固定化酶技术不仅能显著提高酶的稳定性,而且固定化酶与产物易分离,可以实现酶的回收循环利用以及反应的连续进行。不仅可以降低生产成本,而且能简化生产工艺。随着固定化酶技术的不断发展,固定化酶在工业上的应用越来越广泛。
金属有机骨架材料(MOFs)是一类由金属离子或金属簇与有机配体配位自组装形成的具有高结晶度和孔隙率多孔晶体材料。各种结构的金属阳离子或金属簇以及丰富的有机配体选择赋予MOFs更高的设计性和多功能性。由于其出色的结构设计性,多样性,结晶性,极大的比表面积和孔隙率,以及可进行修饰的金属骨架等优点,MOFs作为固载酶的优良载体受到广大科研工作者的关注。然而目前报到大多数MOFs材料都是微孔纳米材料,回收利用难度大;同时由于MOFs固定化酶容易发生团聚造成酶泄露,从而影响其重复使用性。
发明内容
发明要解决的技术问题在于提供一种本丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的共固定化酶、制备及应用,所属共固定化酶重复利用率高。
本发明是通过如下技术方案实现的:
一种苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的共固定化酶的制备方法,将硅藻土@ZIF-8微球先用氨丙基三乙氧基硅烷进行氨基化修饰,再用乙烯亚胺聚合物(PEI)进一步活化,之后加入京尼平交联,交联后载体与含有苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的磷酸缓冲液混合,搅拌反应15h,离心收集固体,得苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶共固定化酶。
优选地,氨丙基三乙氧基硅烷的质量百分比为3%-15%,进一步优选质量百分比5%-10%,京尼平的质量百分比为0.01%-0.5%,进一步优选质量百分比0.05%-0.2%,PEI的质量百分比为0.1%-5%,苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的浓度分别为10mg/ml、5mg/ml。
优选地,修饰反应的转速在200-300rpm,修饰反应时间2-6h,修饰反应温度20-40℃。
优选地,交联反应的转速在200-300rpm,交联反应时间0.5-1h,交联反应温度20-30℃。
优选地,氨丙基三乙氧基硅烷修饰后分别用无水乙醇和去离子水洗涤3次。
优选地,经PEI修饰后、京尼平交联和酶固定化后分别用去离子水洗涤3次。
优选地, PEI修饰pH为7.0-9.0,酶固定化pH为7.0-7.5,酶固定化温度10-30℃。
优选的,硅藻土@ZIF-8微球采用如下方法制备而成:
将200目的硅藻土微球放入去离子水中,加入终浓度质量百分比为8%的氨丙基三乙氧基硅烷的无水乙醇溶液,在pH6.0,80℃条件下,搅拌回流1h,冷却至50℃,加入终浓度质量百分比为1%的柠檬酸水溶液,搅拌,转移至带有聚四氟内衬的反应釜中,120℃,水热反应60min,抽滤、去离子水洗涤3次,70℃烘干得氨基/羧基缩合修饰硅藻土;
取修饰后硅藻土加入Zn(NO3)3•6H2O、2-甲基咪唑、甲醇,70℃,反应2h,反应结束后离心收集固体,分别用甲醇和去离子水洗涤3次,80℃干燥15h得到硅藻土@ZIF-8微球。
作为优选的实施方式之一,修饰后硅藻土、Zn(NO3)3•6H2O、2-甲基咪唑的质量比为3:2:3、加入甲醇与硅藻土的体积质量比25:3(ml:g)。
本发明还提供所述方法制备的苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的共固定化酶。
本发明还提供所述的苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶共固定化酶在催化苯丙氨酸合成2-苯乙醇的应用。
本发明与现有技术相比的有益效果:
1、硅藻土@ZIF-8载体经PEI修饰后再通过京尼平活化,增加了硅藻土@ZIF-8载体空间臂长,形成网状包裹结构,减少空间抑制增加酶负荷,结合金属有机骨架大比表面积的优点,通过这种固定化方法获得的固定化酶酶活回收率高。
2、该固定化酶引入硅藻土作为载体核解决了单用金属有机骨架作为载体制作固定化酶难回收的问题,同时硅藻土本身为富含羟基多孔性材质,易于后修饰操作,多次循环后结构稳定,更适用于工业化生产。
3、本发明固定化酶,催化周期短、稳定性好、转化率高、循环次数多,利用本发明固定化酶使生产成本低。
附图说明
图1为催化3h后的气相图谱,2-苯乙醇的保留时间为18.434min;
图2为催化3h后的液相图谱,2-苯乙醇的保留时间为9.98min;
图3为共固定化酶循环稳定性试验;
图4为pMV-KDC重组质粒物理图谱;
图5为pET Duet-KDC重组质粒物理图谱;
图6为pMV-Adh重组质粒物理图谱;
图7为pET-21b+Adh重组质粒物理图谱。
具体实施方式
实施例1苯丙酮酸脱羧酶基因工程菌的构建
(1)根据基因序列SEQ ID NO.1设计引物1(ATGGCAGATCTATGCGTACCCCATACTGC)、引物2(CCAGACTCGAGTCAGGCGCTATTGCGCG),并分别在引物1和引物2中引入了Bgl II和XhoI限制性酶切位点(下划线标记)。在引物1和引物2的引发下,利用高保真PfuDNA聚合酶进行扩增,以重组质粒pMV-KDC(图4)为模板,获苯丙酮酸脱羧酶基因KDC基因序列,测序后利用BglII和Xho I限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理,并利用T4DNA连接酶(TaKaRa)将该片段同用相同的限制性内切酶处理的商业化载体pETDuet(addgene)进行连接,构建表达载体pETDuet-KDC(图5)。将构建的表达载体pETDuet-KDC转化至大肠杆菌BL21(DE3)(品牌tansgen)中(42℃,45s),涂布于含有50μg/ml氨苄青霉素抗性的LB平板,37℃下培养8-12h,随机挑取克隆抽提质粒进行测序鉴定,筛选获得含有表达重组质粒pETDuet-KDC的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pETDuet-KDC。
(2)将苯丙酮酸脱羧酶基因工程菌BL21(DE3)/ pETDuet-KDC接种至含有终浓度50ug/mL氨苄青霉素抗性的LB液体培养基,37℃,200rpm下培养8h,再以体积浓度10%接种量接种至新鲜的含有终浓度50ug/mL氨苄青霉素的发酵培养基中,于37℃,500rpm下培养至菌体OD600达6~8,加入终浓度为0.1mM的IPTG,28℃下诱导培养11h,发酵液4℃、8000rpm离心10min,弃去上清液,收集沉淀,即获得苯丙酮酸脱羧酶基因工程菌湿菌体。该菌体可直接作为生物催化剂或者用于固定化。
发酵培养基配方(g/L):蛋白胨20,酵母粉15,NaCl 10,(NH4)2SO4 3,甘油20,KH2PO41.36,K2HP04·3H2O 2.28,MgSO4·7H2O 0.7,pH 7.0。
实施例2醇脱氢酶基因工程菌的构建
(1)根据基因序列SEQ ID NO.5设计引物3(AGTGCGGCCGCTCAGAGCGTAAATACCGTACGG)、引物4(TCCGTCGACATGAAAGCAGCAATAGTTTCCG),并分别在引物3和引物4中引入了NotI和SalI限制性酶切位点(下划线标记)。在引物3和引物4的引发下,利用高保真PfuDNA聚合酶进行扩增,以重组质粒pMV-Adh(图6)为模板,获醇脱氢酶基因Adh基因序列,测序后利用NotI和SalI限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理,并利用T4DNA连接酶(TaKaRa)将该片段同用相同的限制性内切酶处理的商业化载体pET-21b(addgene)进行连接,构建表达载体pET21b-Adh(图7)。将构建的表达载体pET21b-Adh转化至大肠杆菌BL21(DE3)(品牌tansgen)中(42℃,45s),涂布于含有50μg/ml卡那霉素抗性的LB平板,37℃下培养8-12h,随机挑取克隆抽提质粒进行测序鉴定,筛选获得含有表达重组质粒pET21b-Adh的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET21b-Adh。
(2)将醇脱氢酶基因工程菌BL21(DE3)/ pET21b-Adh接种至含有终浓度50ug/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基,37℃,200rpm下培养8h,再以体积浓度10%接种量接种至新鲜的含有终浓度50ug/mL卡那霉素的发酵培养基中,于37℃,500rpm下培养至菌体OD600达6~8,加入终浓度为0.1mM的IPTG,28℃下诱导培养11h,发酵液4℃、8000rpm离心10min,弃去上清液,收集沉淀,即获得醇脱氢酶基因工程菌湿菌体。该菌体可直接作为生物催化剂或者用于固定化。
发酵培养基配方(g/L):蛋白胨20,酵母粉15,NaCl 10,(NH4)2SO4 3,甘油20,KH2PO41.36,K2HP04·3H2O 2.28,MgSO4·7H2O 0.7,pH 7.0。
实施例3
一种苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的共固定化酶的制备方法,将硅藻土@ZIF-8微球先用氨丙基三乙氧基硅烷进行氨基化修饰,再用乙烯亚胺聚合物(PEI)进一步活化,之后加入京尼平交联,交联后载体与含有苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的磷酸缓冲液混合,搅拌反应15h,离心收集固体,得苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶共固定化酶。
在优选的实施方案中,氨丙基三甲氧基硅烷的浓度为3%-15%(质量比)中的任一数值,更为优选的浓度是5%-10%(质量比),京尼平的浓度为0.01%-0.5%(质量比),进一步优选0.05%-0.2%(质量比),PEI浓度为0.1%-5%(质量比),苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的浓度分别为10mg/ml、5mg/ml。
在优选实施方案中,修饰反应的转速在200-300rpm,修饰反应时间2-6h,修饰反应温度20-40℃。
在优选实施方案中,交联反应的转速在200-300rpm,交联反应时间0.5-1h,修饰反应温度20-30℃。
在优选实施方案中,氨丙基三乙氧基硅烷修饰后用无水乙醇和去离子水分别洗涤3次。
在优选实施方案中,经PEI修饰后、京尼平交联和酶固定化后分别用去离子水洗涤3次。
在优选实施方案中, PEI修饰pH为7.0-9.0,酶固定化pH为7.0-7.5,酶固定化温度10-30℃。
其中的优选的实施例:取5g硅藻土@ZIF微球分散50ml于含有5%(质量比)的氨丙基三甲氧基硅烷无水乙醇溶液中,30℃,220rpm,震荡15h,过滤,无水乙醇洗涤滤渣三次后分散于1%的PEI溶液(pH8.0)中,25℃,220rpm,搅拌2h,去离子水洗涤3次,再放入0.1%(质量比)的京尼平水溶液中,20℃,200rpm震荡30min,过滤,去离子水洗涤滤渣三次后加入到50ml含有苯丙酮酸脱羧酶(10mg/ml)和醇脱氢酶(5mg/ml)磷酸缓冲液(pH7.4)中,25℃,200rpm,震荡13h,过滤,去离子水洗涤滤渣三次得苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶共固定化酶。
实施例4
取10g/L硅藻土@ZIF微球分散于100ml含有8%(质量比)的氨丙基三甲氧基硅烷无水乙醇溶液中,30℃,220rpm,震荡15h,过滤,无水乙醇洗涤滤渣三次后分散于1%(质量比)的PEI溶液(pH9.0)中,25℃,220rpm,搅拌3h,去离子水洗涤滤渣3次,0.06%(质量比)的京尼平水溶液中,25℃,200rpm震荡30min,过滤,去离子水洗涤三次后加入到100ml含有苯丙酮酸脱羧酶(10mg/ml)和醇脱氢酶(5mg/ml)磷酸缓冲液(pH7.0)中,20℃,200rpm,震荡16h,过滤,去离子水洗涤滤渣三次得苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶共固定化酶。
实施例5
取10g/L硅藻土@ZIF微球分散于100ml含有10%(质量比)的氨丙基三甲氧基硅烷无水乙醇溶液中,30℃,220rpm,震荡15h,过滤,无水乙醇洗涤滤渣三次后分散于0.5%(质量比)的PEI溶液(pH8.5)中,25℃,220rpm,搅拌2h,去离子水洗涤滤渣3次,0.15%(质量比)的京尼平水溶液中,25℃,200rpm震荡30min,过滤,去离子水洗涤滤渣三次后加入到100ml含有苯丙酮酸脱羧酶(10mg/ml)和醇脱氢酶(5mg/ml)磷酸缓冲液(pH7.0)中,15℃,200rpm,震荡12h,过滤,去离子水洗涤三次得苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶共固定化酶。
上述实施例3-5中硅藻土@ZIF-8微球采用如下方法制备而成:
将10g硅藻土微球(200目)、100ml去离子水置于500ml圆底烧瓶中,搅拌10min,加入8%(质量比)的氨丙基三乙氧基硅烷的无水乙醇溶液,在pH6.0,80℃条件下,搅拌回流1h,冷却至50℃,加入1%(质量比)的柠檬酸水溶液,搅拌20min,转移至带有聚四氟内衬的反应釜中,120℃,水热反应60min,抽滤、去离子水洗涤3次,70℃烘干得氨基/羧基缩合修饰硅藻土;
取15g修饰后硅藻土、10gZn(NO3)3•6H2O、15g2-甲基咪唑、100ml甲醇加入500ml圆底烧瓶中,70℃,搅拌回流反应2h,反应结束后离心收集固体,分别用甲醇和去离子水洗涤3次,80℃干燥15h得到硅藻土@ZIF-8微球。
实施例6
在100ml三角瓶中加入7ml去离子水,0.3gL-苯丙氨酸,0.3ml异丙醇,取40%的氢氧化钠调节pH至7.0,再加入终浓度2mM(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)NAD,10mg转氨酶,及实施例1中1g共固定化酶,置于37℃摇床,转速设为200rpm反应3h,12000rpm离心5min,得到含有β-苯乙醇的催化液,分别采用高效液相色谱和气相色谱仪测定β-苯乙醇的浓度和杂质含量。
采用气相色谱检测本实验例催化液中苯乙醛的残留量,气相图谱如图1。
采用反相高效液相色谱测试本实验例得到的β-苯乙醇的浓度,液相图谱如图2。
液相检测方法:实验例得到的催化液按照高效液相色谱要求进行稀释,并进样检测。
气相检测方法:将实验例得到的催化液经乙酸乙酯萃取,取有机相经无水硫酸镁干燥后,进行气相检测。
上述实验例中气相分析采用气相色谱仪为福立GC9790Plus气相色谱仪,分析条件为:进样T:260℃;检测器T:260℃;进样量:1uL;分流比:30:1;色谱柱N2恒流:1ml/min;程序升温:80℃保持3min后以8℃/min速度升温到210℃,保持10min。
本发明的各实验例中液相分析采用的液相色谱仪为岛津LC-20AT,分析条件为:检测器:紫外检测器,检测柱:C18色谱柱(4.6*250mm,5um);检测波长:210nm;检测温度:25℃;进样量:10ul;流动相:0.1mol/LNaH2PO4:甲醇=50:50(v/v);流速:1ml/min。
酶活定义为:每分钟催化产1μmolβ-苯乙醇所需固定化酶的量,以U/mg表示,酶活回收率=固定化后酶活/固定化前酶活×100%。
测定结果为在苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的粗酶浓度分别为10mg/ml、5mg/ml的合成条件下共固定化酶的酶活回收率为91%。
实施例7
在100ml三角瓶中加入7ml去离子水,0.3gL-苯丙氨酸,0.3ml异丙醇,取40%的氢氧化钠调节pH至7.0,再加入终浓度2mM NAD,10mg转氨酶,及实施例2中1g共固定化酶,置于37℃摇床,转速设为200rpm反应3h,12000rpm离心5min,得到含有β-苯乙醇的催化液,分别采用高效液相色谱和气相色谱仪测定β-苯乙醇的浓度和杂质含量。再将反应体系固液分离,回收固定化酶,再在相同条件下进行催化反应,重复试验30次,每次循环后测定固定化酶的残留活性,β-苯乙醇的测定方法和实验例1相同,固定化酶残留活性=每次循环催化产β-苯乙醇的量/第一次循环催化产β-苯乙醇的量×100%。固定化酶残余酶活检测结果如图3。
本发明制备的共固定化苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶,可以实现良好的循环使用性能,在循环使用30次可以保留35%的残余酶活。
表1共固定化苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶生产β-苯乙醇的循环性能,
。
Claims (10)
1.一种苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的共固定化酶的制备方法,其特征在于,将硅藻土@ZIF-8微球先用氨丙基三乙氧基硅烷进行氨基化修饰,再用乙烯亚胺聚合物进一步修饰,之后加入京尼平交联,交联后载体与含有苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的磷酸缓冲液混合,搅拌反应15h,离心收集固体,得苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶共固定化酶。
2.根据权利要求1所述的一种苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的共固定化酶的制备方法,其特征在于,氨丙基三乙氧基硅烷的质量百分比为3%-15%,京尼平的质量百分比为0.01%-0.5%,乙烯亚胺聚合物的质量百分比为0.1%-5%,苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的浓度分别为10mg/ml、5mg/ml。
3.根据权利要求1所述的一种苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的共固定化酶的制备方法,其特征在于,氨丙基三乙氧基硅烷的质量百分比为5%-10%,京尼平的质量百分比为0.05%-0.2%。
4.根据权利要求1所述的一种苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的共固定化酶的制备方法,其特征在于,修饰反应的转速在200-300rpm,修饰反应时间2-6h,修饰反应温度20-40℃;交联反应的转速在200-300rpm,交联反应时间0.5-1h,交联反应温度20-30℃。
5.根据权利要求1所述的一种苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的共固定化酶的制备方法,其特征在于,氨丙基三乙氧基硅烷修饰后分别用无水乙醇和去离子水洗涤3次;经乙烯亚胺聚合物修饰后用去离子水洗涤3次,京尼平交联后用去离子水洗涤3次,酶固定化后用去离子水洗涤3次。
6.根据权利要求1所述的一种苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的共固定化酶的制备方法,其特征在于, 乙烯亚胺聚合物修饰pH为7.0-9.0,酶固定化pH为7.0-7.5,酶固定化温度10-30℃。
7.根据权利要求1所述的一种苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的共固定化酶的制备方法,其特征在于,硅藻土@ZIF-8微球采用如下方法制备而成:
将200目的硅藻土微球放入去离子水中,加入终浓度质量百分比为8%的氨丙基三乙氧基硅烷的无水乙醇溶液,在pH6.0,80℃条件下,搅拌回流1h,冷却至50℃,加入终浓度质量百分比为1%的柠檬酸水溶液,搅拌,转移至带有聚四氟内衬的反应釜中,120℃,水热反应60min,抽滤、去离子水洗涤3次,70℃烘干得氨基/羧基缩合修饰硅藻土;
取修饰后硅藻土加入Zn(NO3)3•6H2O、2-甲基咪唑、甲醇,70℃,反应2h,反应结束后离心收集固体,分别用甲醇和去离子水洗涤3次,80℃干燥15h得到硅藻土@ZIF-8微球。
8.根据权利要求7所述的一种苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的共固定化酶的制备方法,其特征在于,修饰后硅藻土、Zn(NO3)3•6H2O、2-甲基咪唑的质量比为3:2:3,加入甲醇与硅藻土的体积质量比25:3(ml:g)。
9.权利要求7或8所述方法制备的苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的共固定化酶。
10.权利要求9所述的苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶共固定化酶在催化苯丙氨酸合成2-苯乙醇中的应用。
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