CN112280772A - 一种(+)γ-内酰胺酶生产工艺 - Google Patents

一种(+)γ-内酰胺酶生产工艺 Download PDF

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王丹
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路锐
张跃敏
蒋程博
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Abstract

本发明公开一种(+)γ‑内酰胺酶生产工艺，包括：种子摇瓶培养：冻管取出菌种接入母瓶培养；种子罐培养：配制种子罐培养基，火焰接种，控制温度40‑42℃，通气量1.5‑1.8vvm，转速为600‑1000rpm；发酵：配制发酵培养基，接种前加入硫酸镁灭菌，降温，通过无菌管道移种后，设置初始溶氧为100%，控制温度40‑42℃，通气量1.5‑1.8vvm，氨水调节pH值6.8‑7.0，调节转速，菌浓达到30‑35g/L时，加诱导剂，控制溶氧10%‑60%，当溶氧迅速反升时，补加甘油；放罐及酶活检测，纯化及固定化：发酵第18‑20h放罐，湿重菌浓大于200g/L，细胞破壁率大于95%，酶活对映体过量值ee%（40min）＞95%，最终批次反应>200批，反应时间<3.5h，ee%>99.0%。本发明(+)γ‑内酰胺酶生产工艺，灭菌难度降低，步骤简化，高效率、高产率生产高纯度(+)γ‑内酰胺酶。

Description

一种(+)γ-内酰胺酶生产工艺
技术领域
本发明涉及一种γ-内酰胺酶的生产工艺，属于生物工程技术领域。
背景技术
（1R,4S）-1-氨基-4-羟甲基-2-环戊烯盐酸盐（下简称为该中间体）是合成抗病毒药物阿巴卡韦的中间体之一，其结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
(1R, 4S)-1-氨基-4-羟甲基-2-环戊烯盐酸盐
目前，阿巴卡韦是治疗艾滋病和疱疹病毒感染的药物，也是“鸡尾酒疗法”中的关键药物组成成分，因此阿巴卡韦具有非常广阔的市场前景，且其销量也正在逐年递增。生产该中间体需要进行手性拆分，目前主要通过化学法和生物酶法实现手性拆分。化学法主要缺点是副产物多、产率低、制备成本高、步骤繁琐等，使得制备的最终产品很难满足制药企业的需求；生物酶法主要是采用立体选择性酶进行选择性拆分，该方法具有副反应少、产物的分离提纯简单、严格的立体选择性、产物的对映体过量值(e .e .值)很高、拆分效果好、反应温度、pH值、压力温和、生产安全性较高、且绿色环保等优点，有利于生物医药企业较大规模的生产，广泛应用于制备手性药物。
生物酶法制备该中间体的高立体选择性酶是(+)γ-内酰胺酶，目前，(+)γ-内酰胺酶生产工艺存在发酵单位低、纯化后酶液的纯度低、固定化效率低、以及固定化酶使用批次较少等问题。因此，生产高纯度、高产率的(+)γ-内酰胺酶且高效、低能耗、低成本的生产工艺则是制备该中间体的至关重要环节。
发明内容
为了克服现有γ-内酰胺酶生产工艺存在的上述的技术问题，本发明提供一种(+)γ-内酰胺酶生产工艺。
本发明是通过下述技术方案来解决上述技术问题：
一种 (+)γ-内酰胺酶生产工艺，包括以下步骤：
S1、种子摇瓶培养：配制种子培养基，从冻管中直接取出菌液接入母瓶进行培养，设定培养温度、转速，恒温震荡时间进行培养；所述菌液为冻管使用前在室温下解冻的大肠杆菌基因工程菌；
S2、种子罐培养：按照母瓶的培养配制种子罐的培养基，通过火焰接种，设定温度、通气量、转速进行培养，当菌种培养至OD为2-4之间时，进行移种发酵；
S3、发酵：配制发酵培养基，在接种前加入硫酸镁单独灭菌，灭菌后降温，移种，设置发酵全程温度、通气量、pH值，发酵初始，设置溶氧为100%，接着调节搅拌转速控制溶氧在10%-60%，当溶氧迅速反升时，开始补加甘油，甘油补加速率与pH值调节联控，溶氧低于10%时，提高搅拌转速，溶氧继续维持在10%-60%，菌浓达到30-35g/L时，一次性加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，继续培养；
S4、放罐及酶活检测：发酵、放罐，通过离心方式检测湿重，放罐后菌体湿重浓度大于200g/L，检测酶活对映体过量值ee%（40min）>60%；
S5、纯化及固定化：离心发酵液收集菌体，将菌体进行重悬，搅拌均匀，均质破壁机设置均质压力、均质次数、控制进出口温度低于15℃，镜检细胞破壁率达到95%以上，搅拌升温至70-80℃，保温1-2h，降温至常温，离心收集上清液，按照上清液重量：载体重量=10～13:1比例配制、搅拌、25-30℃固化24h；
S6、检测固定化后酶活：(+)γ-内酰胺酶固化后酶活对映体过量值ee%（40min）＞95%；
优选地，所述工艺还包括固定化酶反应验证步骤，
S7、固定化酶反应验证：固定化酶浓度30%，氮杂（
Figure DEST_PATH_IMAGE004
，(±)-2-氮杂双环［2.2.1］庚-5-烯-3-酮）浓度为15%，反应温度为50℃，搅拌转速为600rpm，反应完毕后用筛网出料，将固定化酶截留在反应罐中，料液进入后续反应，批次反应>200批，反应时间<3.5h，对映体过量值ee%>99.0%。
优选地，所述S1中配制种子培养基：酵母粉2-12g/L，蛋白胨8-20g/L，氯化钠8-20g/L，，用氢氧化钠稀溶液调节pH值至弱酸，灭菌20min。
优选地，所述S1中培养温度为35℃-42℃、转速为120-150rpm，恒温震荡4-5h。
优选地，所述S2中温度为40-42℃，通气量为1.5-1.8vvm，转为速600- 1000rpm。
优选地，所述S3中发酵培养基为甘油13g/L，鱼蛋白胨30g/L，酵母膏14g/ L，硫酸铵4g/L，三水磷酸氢二钾18g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁1.2g/L，消泡剂1g/L，pH调节至中性，且在培养过程中需要补加诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷使其终浓度为0.5mmol/L，流加浓氨水控制pH值在弱酸性。
优选地，所述S3中灭菌条件为125℃中25min，灭菌完毕后降温至40℃待用，所述发酵全程温度为40-42℃，通气量为1.5-1.8vvm，通过氨水控制pH值为6.8-7.0之间。
优选地，所述S3中当溶氧迅速反升时，甘油补加量与pH值调节联控，当pH高于控制范围时增加甘油补加量，当pH低于控制范围时，补加氨水。
优选地， S4中所述酶活检测方法为取0.16g菌体于离心管中，加入2mL氮杂溶液，振荡均匀，反应温度50℃，转速200rpm，时间1h，反应完毕后加入1mL乙酸乙酯，上下颠倒10次后，离心分相，离心条件为转速10000rpm，时间1min，取上层液体，进行HPLC检测。
优选地，所述S5中均质压力为600-900bar、均质次数为大于3次。
优选地，所述S6酶活检测方法为取1g固定化(+)γ-内酰胺酶、2.5mL纯化水、0.5g氮杂置于离心管中，竖直放置于摇床，温度50℃，转速200rpm，时间40min，吸取上清液，加入1mL乙酸乙酯，上下颠倒5次待分层，取上层清液进行HPLC检测。
本发明的有益效果体现在：本发明提供的(+) γ-内酰胺酶生产工艺可高效生产出适合工业化的高纯度的(+)γ-内酰胺酶，提高产品的生产效率，改善产品质量，操作简单、方便快捷，大大缩短加工时间，降低生产成本。
具体实施方式：
下面结合本发明的具体实施方式详细说明如下：
实施例1：
种子摇瓶培养
配制种子培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，pH调节至6.8-7.0之间。从菌种冻管中接种，接种量为0.1%。培养温度为37℃、转速为150rpm，恒温震荡培养5h。
种子放大培养
根据最终发酵的体积，按照5%的接种量进行逐级放大，直至达到发酵体积，逐级种子放大，配方同种子培养基。培养条件：控制温度为40℃，通气量为1.8vvm，pH不控制，转速为1000rpm，（也可以采用变频电机进行控制，达到相同溶氧的搅拌效果即可）。
当菌种培养至OD600约为3.0时，进行下一级移种，或者进行发酵移种。
发酵初始培养基组成为：甘油13g/L，鱼蛋白胨30g/L，酵母膏14g/L，硫酸铵4g/L，三水磷酸氢二钾18g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁1.2g/L，消泡剂1g/L，pH调节至7.0-7.4。
在培养过程中，补加诱导剂，通过流加氨水控制pH值为6.8-7.0。发酵过程中，全程控制温度为40℃，通气量为1.8vvm，通过氨水控制pH为6.8-7.0之间。相较于其他酸碱同时控制，或是使用氢氧化钠控制成本更低，本发明采用氨水控制所需设备更为简单。
发酵初始，设置溶氧为100%。随着培养的进行溶氧会逐步下降，在下降后通过调节搅拌转速控制溶氧在20%-30%之间。在培养菌浓达到30-35g/L时，一次性加入诱导剂。加入诱导剂后，搅拌转速保持不变。本实施例中所述诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，主要是由于在该菌种发酵过程中，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的用量较少，而且在发酵过程中不易被降解消耗。
当溶氧迅速反升时，开始补加甘油，并且转速调节为800rpm。通过甘油的流加速度控制溶氧在20%-30%之间。发酵周期约为20h，放罐结束后用离心的方式检测湿重，湿菌体浓度为213g/L。菌体酶活ee%（40min）=87%。补料中使用甘油作为碳源。减少了物料的配制过程，纯甘油不需要配制溶液而直接进行消毒工作；相对于现有技术中采用葡萄糖作为碳源，在灭菌过程中，葡萄糖由于受到高温易破坏的情况使其在灭菌过程对于条件的控制要求更高，而甘油灭菌相对要求更低，更容易操作。
根据湿菌体的重量，配制0.1M磷酸缓冲液，并将菌体重悬，使得重悬后的菌浓达到200g/L，搅拌均匀。
设置均质破壁机的压力为800bar，均质三次。均质过程中保持进料口温度低于15℃。将均质后的料液升温，并持续搅拌使料液受热均匀，当温度升至70℃时开始计时，并将温度维持在70～72℃之间，保持2h。结束后，开启冷却水将料液温度降至30℃以下，并离心收集上清液。该阶段在升温后采用离心的方式分离菌渣和上清液，回收上清液为固定化酶液，使得固定化结束后的固定化酶与料液更好分离，无需再一步将固定化酶与菌渣分离；提高了酶液的纯度，也提高了固定化酶的效果。
离心完毕后，测量收集上清液的重量，并根据上清液重量：载体重量=10:1来计算使用的载体重量；载体使用型号为LX-1000EP；将需要使用的载体加入到罐中，并加入纯化水清洗三次后抽干。所述载体不需要对载体进行活化，可以直接使用。减少了载体在活化过程中使用醛类对人体造成的危害。
上清液加入到已清洗完毕的载体中，开始固定化；固定化条件为，温度：30±1℃，时间：24h，搅拌：可以将全部载体搅起来即可。
固定化结束后，将上清液抽干，并用纯化水将酶洗净抽干冷藏保存即可。
固定化酶的酶活为ee%（40min）=100%。
固定化酶验证反应，固定化酶浓度30%，氮杂浓度为15%，反应温度为50℃，搅拌转速为600rpm；反应完毕后用筛网出料，将固定化酶截留在反应罐中，料液进入下一步骤进行后续反应。
固定化酶可以使用210批，最终反应时间为3.5h，单批反应结果ee%（对映体过量值）>99.0%。
实施例2：发酵阶段
前期准备菌种培养阶段同实施例1
当pH控制在7.0～7.5时，发酵菌体会发生自溶，发酵时间缩短。最终放罐菌种为80g/L，酶活ee%=52.5%；离心分离菌体时难度增大，酶损失多。
实施例3：发酵阶段
前期准备菌种培养阶段同实施例1，补料阶段采用葡萄糖与乳糖比为1:2的混合溶液进行补料。其他保持不变。发酵在10h后出现菌种衰退，12h发酵结束，酶活开始下降。最高酶活ee%=70.2%。
实施例4：纯化固定化阶段
取符合生产要求的发酵液，以250g/L的要求重悬菌体，并搅拌均匀，升温至80℃，保温2h。离心收集上清液后，按照13:1的重量投入载体，固定化。固定化结束后检测酶活ee%（40min）=52.6%。
实施例5：酶催化反应阶段
取酶活为ee%（40min）=62%的固定化酶。按照实施例1的反应要求进行试验。最终酶反应的批次为68批，单批反应时间<3.5h，单批反应结果对映体过量值ee%>99.0%。
本发明提供(+)γ-内酰胺酶生产工艺，不仅提高了产品的纯度和质量、而且提高了产品的生产效率，适合批量(+)γ-内酰胺酶的产业化生产。
本发明尚有多种具体的实施方式，上述的实施例仅仅是对本发明的解释说明，因此本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的启示，在本发明的基础上所做出不脱离本发明范畴的修改或改进，等同替换或者等效变换而形成的所有技术方案，均应该在本发明的要求保护范围之内。

Claims (10)

1.一种 (+)γ-内酰胺酶生产工艺，其特征在于：包括以下步骤：
S1、种子摇瓶培养：配制种子培养基，从冻管中直接取出菌液接入母瓶进行培养，设定培养温度、转速，恒温震荡时间进行培养；所述菌液为冻管使用前在室温下解冻的大肠杆菌基因工程菌；
S2、种子罐培养：按照母瓶的培养配制种子罐的培养基，通过火焰接种，设定温度、通气量、转速进行培养，当菌种培养至OD为2-4之间时，进行移种发酵；
S3、发酵：配制发酵培养基，在接种前加入硫酸镁单独灭菌，灭菌后降温，移种，设置发酵全程温度、通气量、pH值，发酵初始，设置溶氧为100%，接着调节搅拌转速控制溶氧在10%-60%，当溶氧迅速反升时，开始补加甘油，甘油补加速率与pH值调节联控，溶氧低于10%时，提高搅拌转速，溶氧继续维持在10%-60%，菌浓达到30-35g/L时，一次性加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，继续培养；
S4、放罐及酶活检测：发酵、放罐，通过离心方式检测湿重，放罐后菌体湿重浓度大于200g/L，检测酶活对映体过量值ee%（40min）>60%；
S5、纯化及固定化：离心发酵液收集菌体，将菌体进行重悬，搅拌均匀，均质破壁机设置均质压力、均质次数、控制进出口温度低于15℃，镜检细胞破壁率达到95%以上，搅拌升温至70-80℃，保温1-2h，降温至常温，离心收集上清液，按照上清液重量：载体重量=10～13:1比例配制、搅拌、25-30℃固化24h；
S6、检测固定化后酶活：(+)γ-内酰胺酶固化后酶活对映体过量值ee%（40min）＞95%。
2.根据权利要求1所述一种 (+)γ-内酰胺酶生产工艺，其特征在于： 所述工艺还包括固定化酶反应验证步骤，
S7、固定化酶反应验证：固定化酶浓度30%，氮杂浓度为15%，反应温度为50℃，搅拌转速为600rpm，反应完毕后用筛网出料，将固定化酶截留在反应罐中，料液进入后续反应，批次反应>200批，反应时间<3.5h，对映体过量值ee%>99.0%。
3.根据权利要求1所述 一种 (+)γ-内酰胺酶生产工艺，其特征在于： 所述S1中配制种子培养基：酵母粉2-12g/L，蛋白胨8-20g/L，氯化钠8-20g/L，用氢氧化钠稀溶液调节pH值至弱酸，灭菌20min；培养温度为35℃-42℃、转速为120-150rpm，恒温震荡4-5h。
4.根据权利要求1所述一种 (+)γ-内酰胺酶生产工艺，其特征在于：所述S2中温度为40-42℃，通气量为1.5-1.8vvm，转为速600- 1000rpm。
5.根据权利要求1所述的所述一种 (+)γ-内酰胺酶生产工艺，其特征在于：所述S3中发酵培养基为甘油13g/L，鱼蛋白胨30g/L，酵母膏14g/ L，硫酸铵4g/L，三水磷酸氢二钾18g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁1.2g/L，消泡剂1g/L，pH调节至中性，且在培养过程中需要补加诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷使其终浓度为0.5mmol/L，流加浓氨水控制pH值在弱酸性。
6.根据权利要求1所述的所述一种 (+)γ-内酰胺酶生产工艺，其特征在于： 所述S3中灭菌条件为125℃中25min，灭菌完毕后降温至40℃待用，所述发酵全程温度为40-42℃，通气量为1.5-1.8vvm，通过氨水控制pH值为6.8-7.0之间。
7.根据权利要求1所述的所述一种 (+)γ-内酰胺酶生产工艺，其特征在于： 所述S3中的当溶氧迅速反升时，甘油补加量与pH值调节联控：当pH高于控制范围时增加甘油补加量，当pH低于控制范围时，补加氨水。
8.根据权利要求1所述的一种 (+)γ-内酰胺酶生产工艺，其特征在于： 所述S4中酶活检测方法为：取0.16g菌体于离心管中，加入2mL氮杂溶液，振荡均匀，反应温度50℃，转速200rpm，时间1h，反应完毕后加入1mL乙酸乙酯，上下颠倒10次后，离心分相，离心条件为转速10000rpm，时间1min，取上层液体，进行HPLC检测。
9.根据权利要求1所述的一种 (+)γ-内酰胺酶生产工艺，其特征在于： 所述S5中均质压力为600-900bar、均质次数为大于3次。
10.根据权利要求1所述的一种 (+)γ-内酰胺酶生产工艺，其特征在于： 所述S6酶活检测方法为：取1g固定化(+)γ-内酰胺酶、2.5mL纯化水、0.5g氮杂置于离心管中，竖直放置于摇床，温度50℃，转速200rpm，时间40min，吸取上清液，加入1mL乙酸乙酯，上下颠倒5次待分层，取上层清液进行HPLC检测。
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