CN113957101A - 一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法 - Google Patents

一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法，属于生物发酵工程和酶工程技术领域。本发明公开的一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法，以重组大肠杆菌为出发菌株，建立OUR、RQ反馈调控发酵机制，具体为：对发酵前期的菌体指数生长阶段以及发酵后期菌体生存阶段的OUR变化趋势，调节流加补料速率；根据RQ数值的变化，能够快速调节流加葡萄糖的速率，减少发酵液中乙酸的产生以及累积，降低乙酸对大肠杆菌产酶的影响以及提高肌醇的转化率。本发明已达到发酵液中产肌醇浓度110‑130g/L，葡萄糖转化成肌醇，转化率达到70％，结晶出肌醇成品，收率70％。

Description

一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法
技术领域
本发明涉及生物发酵工程和酶工程技术领域，更具体的说是涉及一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法。
背景技术
肌醇又称环己六醇、六羟基环己烷、环己糖醇、肉肌糖、不旋肌醇，属于B族维生素之一，因羟基相对环平面的取向不同，共有9种异构体，其中7种为非旋光体，2种为旋光体(左旋体和右旋体)。肌醇广泛分布在动物和植物体内，是动物、微生物的生长因子。主要用于治疗肝硬变、肝炎、脂肪肝、血中胆固醇过高等症。由于肌醇是人、动物与微生物生长的必需物质，使其在饲料、医药、食品等领域有重要的应用。
肌醇的生产方法主要有传统生产方法、植酸钠水解法、常压催化法、化学合成法。
传统生产方法为加压水解法。由于加压水解法具有多年的工业化生产实践经验，是国内生产厂家采用的主要工艺技术。加压水解法一般流程：菲汀(水解)→水解液(中和、过滤)→肌醇液(除杂浓缩、结晶离心)→粗肌醇(溶解除杂、结晶离心)→精品。操作繁琐，收率低，不适合工业大规模生产。
植酸钠水解法是吉林化工学院开发了以玉米浸渍水为原料，用离子交换树脂吸附法生产植酸钠，再进行加压水解反应生产肌醇的新工艺。新工艺生产肌醇的同时，联产磷酸氢二钠(磷酸氢二钠产量为肌醇产量的12倍左右)，有效地回收了谷物中的有机磷，为农副产品中有机磷的回收开辟了新的途径。生产工艺简述：玉米浸渍水经离子交换树脂吸附法得到一定浓度的植酸钠溶液，进行加压水解反应，生成肌醇和磷酸氢二钠。反应一定时间后，出料、过滤、冷却、结晶，析出磷酸氢二钠晶体。将析出磷酸氢二钠晶体的水解反应液依次通过阴、阳离子交换树脂，反复进行精制，直到水解反应液中阴、阳离子浓度达到规定的标准为止。精制后的水解反应液经浓缩、结晶，即可得成品肌醇。此方法肌醇收率低，成本高，不适合进行工业化生产。
常压催化法是近几年我国新近研制并投入工业化生产的一种生产肌醇的新方法，其水解和精制有独特之处。生产工艺：在一定浓度的菲汀溶液中常压下加入一定比例的催化剂(由甘油与尿素、碳酸钙复合配制而成)，加热水解，经水解、过滤、结晶、烘干等工序，即可得到肌醇。因催化剂自身特性，肌醇可一次性结晶，而获得较高质量的成品，从而简化了工序。催化剂可循环使用。此方法水解温度高，带有一定危险性。
化学合成法以葡萄糖为原料生产肌醇的方法：用葡萄糖作原料，在反应釜中加入乙醇和硼酸进行络合反应，络合反应结束时将乙醇回收再用；络合的原液送入已加有亚硝酸钠和冰醋酸的反应釜中氧化、再经开环和关环处理、水解中和，然后加入硫酸铜沉淀、酸化中和；送入过滤机过滤(滤渣做肥料)后的滤液进入结晶釜中浓缩结晶；最后经蒸馏水解除杂、加入活性炭脱色、二次浓缩结晶、脱水分离(母液回收)、烘干粉碎得成品。此方法收率低、操作过程中添加乙醇以及硼酸，带有一定的危险性。
因此，提供一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法，具体步骤如下：
(1)一级种子培养：将重组大肠杆菌(购买于北京化工大学，在BW25113菌株中敲除了pgi、zwf、pyka、pykF4个基因，同时过表达了INO1和suhB基因)按1％的接种量接种在一级种子培养基中，35℃摇瓶培养，转速为220rpm/min；
(2)二级种子培养：一级种子生长5-8h以后(OD600＝3.0)，按1％的接种量接入装有二级种子培养基的二级种子罐中，控制反应温度35℃，溶氧(DO)70-80％，转速为200rpm/min，pH 7.0(15％氨水调节)，通风比为1VVM，发酵罐罐压为0.025Mpa，进行菌种培养；
(3)发酵罐营养液制备：
①称取、灭菌：将氯化铵30g、磷酸二氢钾100g、氯化钠50g和水9L混合并加入发酵罐中，115-121℃，灭菌20-30min；
②冷却：将灭菌后的发酵罐置于常温下冷却至35℃；
③葡萄糖300g和七水硫酸镁2.47g混合用水定容0.9L、氯化钙0.11g、微量元素150mL、浓度为50mg/mL的卡那霉素10mL单独灭菌，并于接种前一同放入发酵罐中；
④微量元素成分包括：七水硫酸亚铁10g/L、氯化钙2g/L、七水硫酸锌2.2g/L、四水硫酸锰0.5g/L、五水硫酸铜1g/L、四水锰酸铵0.1g/L、十水硼酸钠0.23g/L、盐酸18.23g/L。
(4)步骤(2)二级种子罐的菌种生长12h(OD600＝6.0)接入步骤(3)提前灭菌的发酵罐营养液中，接种量为1％，接种后，温度控制在35℃，用氨水(15％)调节控制pH7.0，通风比为1VVM，发酵罐罐压0.02-0.025Mpa，DO维持在70-80％，转速为400rpm/min；发酵至OD600＝15-15.5，一次性无菌加入IPTG进行诱导；
(5)建立OUR、RQ反馈调控发酵机制：
①发酵初始，菌体进入延滞期生长缓慢，调节转速控制大肠杆菌耗氧速率为2.7-7.56mol O2/L/h，经过6-8h，大肠杆菌进入对数生长期，OUR数值呈抛物线的形式上升至37-40mol O2/L/h，调节流加补料速率13.56-14.26g/h，发酵后期OUR数值降低至25-30mol O2/L/h，调节补料速率13.0-13.26g/h；
②发酵过程中，大肠杆菌对数生长期后的稳定期，RQ的数值在0.85-0.9，调节流加补料速率13.26-13.50g/h，RQ数值大于0.9，补料速率降低，调至13.0-13.26g/h；RQ值小于0.85，增加补料速率，调至13.50-14.26g/h；发酵90-110h，肌醇浓度达到110-130g/L，结束发酵，得到发酵液；
葡萄糖1200g用纯水定容至3L，灭菌，发酵过程中作为补料流加；
(6)发酵液离心分离出上清液；
(7)脱色：升温80℃灭酶30min，活性炭脱色；
(8)过滤：板框过滤除杂质；
(9)离交：离交去除阴阳离子；
(10)分离：模拟移动床分离肌醇和葡萄糖；
(11)浓缩、结晶：将分离出的肌醇80-100℃浓缩至75％以上含量，冷却结晶；
(12)分离、干燥：分离机将肌醇晶体与液体分离，然后流化床干燥，得肌醇成品；
(13)肌醇包装。
进一步，步骤(1)所述一级种子培养基为LB液体培养基(酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L，水定容至1L)。
进一步，步骤(2)所述二级种子培养基的具体组成为：葡萄糖30g/L、磷酸二氢钾10g/L、氯化铵3g/L、氯化钠5g/L、七水硫酸镁0.247g/L、氯化钙0.011g/L，水定容至1L。
进一步，所述耗氧速率OUR计算采用舜宇恒平尾气质谱仪对进气和尾气进行实时在线采集分析以及对呼吸商RQ的计算数据分析趋势。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法，基于OUR、RQ为控制参数，利用重组大肠杆菌发酵生产肌醇；根据OUR的变化，调节补料速率；如果OUR值需要上升，说明大肠杆菌的营养物质减少，则需要增加补料的流加速度，此时溶解氧就会下降；如果OUR值需要下降，说明大肠杆菌的营养物质过量，则需要降低补料的流加速度，此时溶解氧上升。大肠杆菌对数生长期后的稳定期，RQ的数值在0.85-0.9，RQ数值大于0.9，补料速率降低，RQ值小于0.85，增加补料速率。根据OUR、RQ趋势的变化，能够快速调节补料的速率，减少发酵液中乙酸的产生以及累积，降低乙酸对大肠杆菌产酶的影响以及提高肌醇的转化率，葡萄糖转化为肌醇，转化率达到70％。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法，具体步骤如下：
(1)150mL摇瓶种子制备
配制一级种子培养基(一级种子培养基配方：蛋白胨1.5g、酵母粉0.75g、氯化钠1.5g)，50μg/ml卡那霉素(终浓度)，pH7.0，121℃，灭菌30min。
按1％接种量接种重组大肠杆菌，35℃，220rpm，摇床培养5h，得到一级种子液。
(2)用吸光光度计测定一级种子液的OD600＝3.0时，按1％接种量转接至装有二级种子培养基(葡萄糖30g/L、磷酸二氢钾10g/L、氯化铵3g/L、氯化钠5g/L、七水硫酸镁0.247g/L、氯化钙0.011g/L)的5L二级种子罐中；二级种子罐控制反应温度35℃，溶氧(DO)70-80％，转速为200rpm/min，pH 7.0(15％氨水调节)，通风比为1VVM，发酵罐罐压为0.025Mpa，进行菌种培养。
(3)15L发酵罐(使用量为10L)分别称量：氯化铵30g、磷酸二氢钾100g、氯化钠50g，用水溶解后加入发酵罐中体积9L，115℃灭菌30min；将灭菌后的发酵罐置于常温下冷却至35℃。葡萄糖300g和七水硫酸镁2.47g混合用水定容0.9L、氯化钙0.11g、微量元素(七水硫酸亚铁10g/L、氯化钙2g/L、七水硫酸锌2.2g/L、四水硫酸锰0.5g/L、五水硫酸铜1g/L、四水锰酸铵0.1g/L、十水硼酸钠0.23g/L、盐酸18.23g/L)150mL、浓度为50mg/mL的卡那霉素10mL单独灭菌，接种前加入发酵罐。
(4)二级种子罐菌种生长12h，OD600＝6.0，接入步骤(3)提前灭菌的发酵罐，接种量为1％，接种后发酵罐用氨水(15％)调节控制pH 7.0，通风比为1VVM，发酵罐罐压0.022Mpa，DO维持在75％，转速为400rpm/min。
(5)建立OUR、RQ反馈调控发酵机制：
①发酵初始，菌体进入延滞期生长缓慢，调节转速控制大肠杆菌耗氧速率为2.75mol O2/L/h，经过6.5h，大肠杆菌耗氧速率为7.5mol O2/L/h，大肠杆菌进入对数生长期，OUR数值呈抛物线的形式上升，发酵35h，OUR数值达到39.5mol O2/L/h，调节流加补料速率14.00g/h，发酵77h，OUR数值降低至30molO2/L/h，调节补料速率13.26g/h。发酵22h，OD600＝15.5，一次性无菌加入灭菌的10mL浓度0.12g/mL的IPTG进行诱导。
②发酵过程中，大肠杆菌对数生长期后的稳定期35-77h，发酵47h，RQ的数值在0.9，调节流加补料速率13.26g/h，发酵59h，RQ数值为0.86，补料速率调至13.45g/h；发酵71h，RQ数值为0.87，补料速率调至13.40g/h；发酵100h，肌醇浓度达到125g/L，结束发酵得发酵液。计算得转化率70.5％。
葡萄糖1200g用纯水定容至3L，灭菌，发酵过程中作为补料流加。
(6)发酵液离心分离出上清液；
(7)脱色：升温80℃灭酶30min，活性炭脱色；
(8)过滤：板框过滤除杂质；
(9)离交：离交去除阴阳离子；
(10)分离：模拟移动床分离肌醇和葡萄糖；
(11)浓缩、结晶：将分离出的肌醇80-100℃浓缩至75％以上含量，冷却结晶；
(12)分离、干燥：分离机将肌醇晶体与液体分离，然后流化床干燥，得肌醇成品；
(13)肌醇包装。
计算肌醇的收率到达70％。
实施例2
一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法，具体步骤如下：
(1)150mL摇瓶种子制备
配制一级种子培养基(一级种子培养基配方：蛋白胨1.5g、酵母粉0.75g、氯化钠1.5g)，50μg/ml卡那霉素(终浓度)，pH 7.0，121℃，灭菌30min。
按1％接种量接种重组大肠杆菌，35℃，220rpm，摇床培养5h，得到一级种子液。
(2)用吸光光度计测定一级种子液的OD600＝3.0时，按1％接种量转接至装有二级种子培养基(葡萄糖30g/L、磷酸二氢钾10g/L、氯化铵3g/L、氯化钠5g/L、七水硫酸镁0.247g/L、氯化钙0.011g/L)的5L二级种子罐中；二级种子罐控制反应温度35℃，溶氧(DO)70-80％，转速为200rpm/min，pH 7.0(15％氨水调节)，通风比为1VVM，发酵罐罐压为0.025Mpa，进行菌种培养。
(3)15L发酵罐(使用量为10L)分别称量：氯化铵30g、磷酸二氢钾100g、氯化钠50g，用水溶解后加入发酵罐中体积9L，115℃灭菌30min；将灭菌后的发酵罐置于常温下冷却至35℃。葡萄糖300g和七水硫酸镁2.47g混合用水定容0.9L、氯化钙0.11g、微量元素(七水硫酸亚铁10g/L、氯化钙2g/L、七水硫酸锌2.2g/L、四水硫酸锰0.5g/L、五水硫酸铜1g/L、四水锰酸铵0.1g/L、十水硼酸钠0.23g/L、盐酸18.23g/L)150mL、浓度为50mg/mL的卡那霉素10mL单独灭菌，接种前加入发酵罐。
(4)二级种子罐菌种生长12h，OD600＝6.0，接入步骤(3)提前灭菌的发酵罐，接种量为1％，接种后发酵罐用氨水(15％)调节控制pH 7.0，通风比为1VVM，发酵罐罐压0.02Mpa，DO维持在70％，转速为400rpm/min。
(5)建立OUR、RQ反馈调控发酵机制：
①发酵初始，菌体进入延滞期生长缓慢，调节转速控制大肠杆菌耗氧速率为2.7mol O2/L/h，经过6h，大肠杆菌耗氧速率为7.56mol O2/L/h，大肠杆菌进入对数生长期，OUR数值呈抛物线的形式上升，发酵35h，OUR数值达到40mol O2/L/h，调节流加补料速率14.26g/h，发酵77h，OUR数值降低至25mol O2/L/h，调节补料速率13.00g/h。发酵22h，OD600＝15.3，一次性无菌加入灭菌的10mL浓度0.12g/mL的IPTG进行诱导。
②发酵过程中，大肠杆菌对数生长期后的稳定期35-77h，发酵47h，RQ的数值在0.88，调节流加补料速率13.30g/h，发酵59h，RQ数值为0.93，补料速率调至13.20g/h；发酵71h，RQ数值为0.83，补料速率调至13.85g/h；发酵95h，肌醇浓度达到128g/L，结束发酵得发酵液。计算得转化率71％。
葡萄糖1200g用纯水定容至3L，灭菌，发酵过程中作为补料流加。
(6)发酵液离心分离出上清液；
(7)脱色：升温80℃灭酶30min，活性炭脱色；
(8)过滤：板框过滤除杂质；
(9)离交：离交去除阴阳离子；
(10)分离：模拟移动床分离肌醇和葡萄糖；
(11)浓缩、结晶：将分离出的肌醇80-100℃浓缩至75％以上含量，冷却结晶；
(12)分离、干燥：分离机将肌醇晶体与液体分离，然后流化床干燥，得肌醇成品；
(13)肌醇包装。
计算肌醇的收率到达71.5％。
实施例3
一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法，具体步骤如下：
(1)150mL摇瓶种子制备
配制一级种子培养基(一级种子培养基配方：蛋白胨1.5g、酵母粉0.75g、氯化钠1.5g)，50μg/ml卡那霉素(终浓度)，pH7.0，121℃，灭菌30min。
按1％接种量接种重组大肠杆菌，35℃，220rpm，摇床培养5h，得到一级种子液。
(2)用吸光光度计测定一级种子液的OD600＝3.0时，按1％接种量转接至装有二级种子培养基(葡萄糖30g/L、磷酸二氢钾10g/L、氯化铵3g/L、氯化钠5g/L、七水硫酸镁0.247g/L、氯化钙0.011g/L)的5L二级种子罐中；二级种子罐控制反应温度35℃，溶氧(DO)70-80％，转速为200rpm/min，pH 7.0(15％氨水调节)，通风比为1VVM，发酵罐罐压为0.025Mpa，进行菌种培养。
(3)15L发酵罐(使用量为10L)分别称量：氯化铵30g、磷酸二氢钾100g、氯化钠50g，用水溶解后加入发酵罐中体积9L，115℃灭菌30min；将灭菌后的发酵罐置于常温下冷却至35℃。葡萄糖300g和七水硫酸镁2.47g混合用水定容0.9L、氯化钙0.11g、微量元素(七水硫酸亚铁10g/L、氯化钙2g/L、七水硫酸锌2.2g/L、四水硫酸锰0.5g/L、五水硫酸铜1g/L、四水锰酸铵0.1g/L、十水硼酸钠0.23g/L、盐酸18.23g/L)150mL、浓度为50mg/mL的卡那霉素10mL单独灭菌，接种前加入发酵罐。
(4)二级种子罐菌种生长12h，OD600＝6.0，接入步骤(3)提前灭菌的发酵罐，接种量为1％，接种后发酵罐用氨水(15％)调节控制pH 7.0，通风比为1VVM，发酵罐罐压0.025Mpa，DO维持在80％，转速为400rpm/min。
(5)建立OUR、RQ反馈调控发酵机制：
①发酵初始，菌体进入延滞期生长缓慢，调节转速控制大肠杆菌耗氧速率为2.7mol O2/L/h，经过6h，大肠杆菌耗氧速率为7.45mol O2/L/h，大肠杆菌进入对数生长期，OUR数值呈抛物线的形式上升，发酵35h，OUR数值达到37mol O2/L/h，调节流加补料速率13.56g/h，发酵77h，OUR数值降低至25mol O2/L/h，调节补料速率13.0g/h。发酵22h，OD600＝15.3，一次性无菌加入10mL浓度0.12g/mL的IPTG进行诱导。
②发酵过程中，大肠杆菌对数生长期后的稳定期35-77h，发酵47h，RQ的数值在0.85，调节流加补料速率13.50g/h，发酵59h，RQ数值为0.91，补料速率调至13.24g/h；发酵71h，RQ数值为0.81，补料速率调至14.20g/h；发酵90h，肌醇浓度达到115g/L，结束发酵得发酵液，计算得转化率70.43％。
葡萄糖1200g用纯水定容至3L，灭菌，发酵过程中作为补料流加。
(6)发酵液离心分离出上清液；
(7)脱色：升温80℃灭酶30min，活性炭脱色；
(8)过滤：板框过滤除杂质；
(9)离交：离交去除阴阳离子；
(10)分离：模拟移动床分离肌醇和葡萄糖；
(11)浓缩、结晶：将分离出的肌醇80-100℃浓缩至75％以上含量，冷却结晶；
(12)分离、干燥：分离机将肌醇晶体与液体分离，然后流化床干燥，得肌醇成品；
(13)肌醇包装。
计算肌醇的收率到达71％。
实施例4
一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法，具体步骤如下：
(1)150mL摇瓶种子制备
配制一级种子培养基(一级种子培养基配方：蛋白胨1.5g、酵母粉0.75g、氯化钠1.5g)，50μg/ml卡那霉素(终浓度)，pH7.0，121℃，灭菌30min。
按1％接种量接种重组大肠杆菌，35℃，220rpm，摇床培养5h，得到一级种子液。
(2)用吸光光度计测定一级种子液的OD600＝3.0时，按1％接种量转接至装有二级种子培养基(葡萄糖30g/L、磷酸二氢钾10g/L、氯化铵3g/L、氯化钠5g/L、七水硫酸镁0.247g/L、氯化钙0.011g/L)的5L二级种子罐中；二级种子罐控制反应温度35℃，溶氧(DO)70-80％，转速为200rpm/min，pH 7.0(15％氨水调节)，通风比为1VVM，发酵罐罐压为0.025Mpa，进行菌种培养。
(3)15L发酵罐(使用量为10L)分别称量：氯化铵30g、磷酸二氢钾100g、氯化钠50g，用水溶解后加入发酵罐中体积9L，115℃灭菌30min；将灭菌后的发酵罐置于常温下冷却至35℃。葡萄糖300g和七水硫酸镁2.47g混合用水定容0.9L、氯化钙0.11g、微量元素(七水硫酸亚铁10g/L、氯化钙2g/L、七水硫酸锌2.2g/L、四水硫酸锰0.5g/L、五水硫酸铜1g/L、四水锰酸铵0.1g/L、十水硼酸钠0.23g/L、盐酸18.23g/L)150mL、浓度为50mg/mL的卡那霉素10mL单独灭菌，接种前加入发酵罐。
(4)二级种子罐菌种生长12h，OD600＝6.0，接入步骤(3)提前灭菌的发酵罐，接种量为1％，接种后发酵罐用氨水(15％)调节控制pH 7.0，通风比为1VVM，发酵罐罐压0.022Mpa，DO维持在74％，转速为400rpm/min。
(5)建立OUR、RQ反馈调控发酵机制：
①发酵初始，菌体进入延滞期生长缓慢，调节转速控制大肠杆菌耗氧速率为2.71mol O2/L/h，经过7.5h，大肠杆菌耗氧速率为7.32mol O2/L/h，大肠杆菌进入对数生长期，OUR数值呈抛物线的形式上升，发酵35h，OUR数值达到38mol O2/L/h，调节流加补料速率13.80g/h，发酵77h，OUR数值降低至28mol O2/L/h，调节补料速率13.15g/h。发酵22h，OD600＝15.4，一次性无菌加入10mL浓度0.12g/mL的IPTG进行诱导。
②发酵过程中，大肠杆菌对数生长期后的稳定期35-77h，发酵47h，RQ的数值在0.87，调节流加补料速率13.40g/h，发酵59h，RQ数值为0.82，补料速率调至14.00g/h；发酵71h，RQ数值为0.91，补料速率调至13.24g/h；发酵110h，肌醇浓度达到128g/L，结束发酵得发酵液。计算得转化率70.85％。
葡萄糖1200g用纯水定容至3L，灭菌，发酵过程中作为补料流加。
(6)发酵液离心分离出上清液；
(7)脱色：升温80℃灭酶30min，活性炭脱色；
(8)过滤：板框过滤除杂质；
(9)离交：离交去除阴阳离子；
(10)分离：模拟移动床分离肌醇和葡萄糖；
(11)浓缩、结晶：将分离出的肌醇80-100℃浓缩至75％以上含量，冷却结晶；
(12)分离、干燥：分离机将肌醇晶体与液体分离，然后流化床干燥，得肌醇成品；
(13)肌醇包装。
计算肌醇的收率到达70.5％。
实施例5
一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法，具体步骤如下：
(1)150mL摇瓶种子制备
配制一级种子培养基(一级种子培养基配方：蛋白胨1.5g、酵母粉0.75g、氯化钠1.5g)，50μg/ml卡那霉素(终浓度)，pH7.0，121℃，灭菌30min。
按1％接种量接种重组大肠杆菌，35℃，220rpm，摇床培养5h，得到一级种子液。
(2)用吸光光度计测定一级种子液的OD600＝3.0时，按1％接种量转接至装有二级种子培养基(葡萄糖30g/L、磷酸二氢钾10g/L、氯化铵3g/L、氯化钠5g/L、七水硫酸镁0.247g/L、氯化钙0.011g/L)的5L二级种子罐中；二级种子罐控制反应温度35℃，溶氧(DO)70-80％，转速为200rpm/min，pH 7.0(15％氨水调节)，通风比为1VVM，发酵罐罐压为0.025Mpa，进行菌种培养。
(3)15L发酵罐(使用量为10L)分别称量：氯化铵30g、磷酸二氢钾100g、氯化钠50g，用水溶解后加入发酵罐中体积9L，115℃灭菌30min；将灭菌后的发酵罐置于常温下冷却至35℃。葡萄糖300g和七水硫酸镁2.47g混合用水定容0.9L、氯化钙0.11g、微量元素(七水硫酸亚铁10g/L、氯化钙2g/L、七水硫酸锌2.2g/L、四水硫酸锰0.5g/L、五水硫酸铜1g/L、四水锰酸铵0.1g/L、十水硼酸钠0.23g/L、盐酸18.23g/L)150mL、浓度为50mg/mL的卡那霉素10mL单独灭菌，接种前加入发酵罐。
(4)二级种子罐菌种生长12h，OD600＝5.8，接入步骤(3)提前灭菌的发酵罐，接种量为1％，接种后发酵罐用氨水(15％)调节控制pH 7.0，通风比为1VVM，发酵罐罐压0.022Mpa，DO维持在75％，转速为400rpm/min。
(5)建立OUR、RQ反馈调控发酵机制：
①发酵初始，菌体进入延滞期生长缓慢，调节转速控制大肠杆菌耗氧速率为2.72mol O2/L/h，经过8h，大肠杆菌耗氧速率为7.55mol O2/L/h，大肠杆菌进入对数生长期，OUR数值呈抛物线的形式上升，发酵35h，OUR数值达到38.5mol O2/L/h，调节流加补料速率13.90g/h，发酵77h，OUR数值降低至27mol O2/L/h，调节补料速率13.10g/h。发酵22h，OD600＝15，一次性无菌加入10mL浓度0.12g/mL的IPTG进行诱导。
②发酵过程中，大肠杆菌对数生长期后的稳定期35-77h，发酵47h，RQ的数值在0.84，调节流加补料速率13.70g/h，发酵59h，RQ数值为0.87，补料速率调至13.40g/h；发酵71h，RQ数值为0.85，补料速率调至13.50g/h；发酵105h，肌醇浓度达到120g/L，结束发酵得发酵液。计算得转化率70.68％。
葡萄糖1200g用纯水定容至3L，灭菌，发酵过程中作为补料流加。
(6)发酵液离心分离出上清液；
(7)脱色：升温80℃灭酶30min，活性炭脱色；
(8)过滤：板框过滤除杂质；
(9)离交：离交去除阴阳离子；
(10)分离：模拟移动床分离肌醇和葡萄糖；
(11)浓缩、结晶：将分离出的肌醇80-100℃浓缩至75％以上含量，冷却结晶；
(12)分离、干燥：分离机将肌醇晶体与液体分离，然后流化床干燥，得肌醇成品；
(13)肌醇包装。
计算肌醇的收率到达71％。
实施例6
一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法，具体步骤如下：
(1)150mL摇瓶种子制备
配制一级种子培养基(一级种子培养基配方：蛋白胨1.5g、酵母粉0.75g、氯化钠1.5g)，50μg/ml卡那霉素(终浓度)，pH7.0，121℃，灭菌30min。
按1％接种量接种重组大肠杆菌，35℃，220rpm，摇床培养5h，得到一级种子液。
(2)用吸光光度计测定一级种子液的OD600＝3.0时，按1％接种量转接至装有二级种子培养基(葡萄糖30g/L、磷酸二氢钾10g/L、氯化铵3g/L、氯化钠5g/L、七水硫酸镁0.247g/L、氯化钙0.011g/L)的5L二级种子罐中；二级种子罐控制反应温度35℃，溶氧(DO)70-80％，转速为200rpm/min，pH 7.0(15％氨水调节)，通风比为1VVM，发酵罐罐压为0.025Mpa，进行菌种培养。
(3)15L发酵罐(使用量为10L)分别称量：氯化铵30g、磷酸二氢钾100g、氯化钠50g，用水溶解后加入发酵罐中体积9L，115℃灭菌30min；将灭菌后的发酵罐置于常温下冷却至35℃。葡萄糖300g和七水硫酸镁2.47g混合用水定容0.9L、氯化钙0.11g、微量元素(七水硫酸亚铁10g/L、氯化钙2g/L、七水硫酸锌2.2g/L、四水硫酸锰0.5g/L、五水硫酸铜1g/L、四水锰酸铵0.1g/L、十水硼酸钠0.23g/L、盐酸18.23g/L)150mL、浓度为50mg/mL的卡那霉素10mL单独灭菌，接种前加入发酵罐。
(4)二级种子罐菌种生长12h，OD600＝5.53，接入步骤(3)提前灭菌的发酵罐，接种量为1％，接种后发酵罐用氨水(15％)调节控制pH 7.0，通风比为1VVM，发酵罐罐压0.022Mpa，DO维持在75％，转速为400rpm/min。
(5)建立OUR、RQ反馈调控发酵机制：
①发酵初始，菌体进入延滞期生长缓慢，调节转速控制大肠杆菌耗氧速率为2.74mol O2/L/h，经过7.7h，大肠杆菌耗氧速率为7.4mol O2/L/h，大肠杆菌进入对数生长期，OUR数值呈抛物线的形式上升，发酵35h，OUR数值达到39mol O2/L/h，调节流加补料速率13.95g/h，发酵77h，OUR数值降低至26.5mol O2/L/h，调节补料速率13.05g/h。发酵22h，OD600＝15.25，一次性无菌加入10mL浓度0.12g/mL的IPTG进行诱导。
②发酵过程中，大肠杆菌对数生长期后的稳定期35-77h，发酵47h，RQ的数值在0.84，调节流加补料速率13.70g/h，发酵59h，RQ数值为0.94，补料速率调至13.10g/h；发酵71h，RQ数值为0.80，补料速率调至14.26g/h；发酵98h，肌醇浓度达到126.5g/L，结束发酵得发酵液。计算得转化率71.25％。
葡萄糖1200g用纯水定容至3L，灭菌，发酵过程中作为补料流加。
(6)发酵液离心分离出上清液；
(7)脱色：升温80℃灭酶30min，活性炭脱色；
(8)过滤：板框过滤除杂质；
(9)离交：离交去除阴阳离子；
(10)分离：模拟移动床分离肌醇和葡萄糖；
(11)浓缩、结晶：将分离出的肌醇80-100℃浓缩至75％以上含量，冷却结晶；
(12)分离、干燥：分离机将肌醇晶体与液体分离，然后流化床干燥，得肌醇成品；
(13)肌醇包装。
计算肌醇的收率到达72.30％。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (6)

1.一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法，第一步，培养重组大肠杆菌，获得种子液；第二步，将第一步获得的种子液接种到发酵罐营养液中；第三步，建立OUR、RQ反馈调控发酵机制，得到发酵液；第四步，将第三步所得的发酵液进行离心、脱色、过滤、离交、分离、浓缩、结晶，得肌醇成品；其特征在于，第三步，建立OUR、RQ反馈调控发酵机制：
①发酵初始，菌体进入延滞期生长缓慢，调节转速控制大肠杆菌耗氧速率为2.7-7.56mol O2/L/h，经过6-8h，大肠杆菌进入对数生长期，OUR数值呈抛物线的形式上升至37-40mol O2/L/h，调节流加补料速率13.56-14.26g/h，发酵后期OUR数值降低至25-30mol O2/L/h，调节补料速率13.0-13.26g/h；
②发酵过程中，大肠杆菌对数生长期后的稳定期，RQ的数值在0.85-0.9，调节流加补料速率13.26-13.50g/h，RQ数值大于0.9，补料速率降低，调至13.0-13.26g/h；RQ值小于0.85，增加补料速率，调至13.50-14.26g/h；发酵90-110h，肌醇浓度达到110-130g/L，结束发酵，得到发酵液；
葡萄糖1200g用纯水定容至3L，灭菌，发酵过程中作为补料流加。
2.根据权利要求1所述的一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法，其特征在于，第一步，培养重组大肠杆菌，包括：
A、一级种子培养：将重组大肠杆菌按1％的接种量接种在一级种子培养基中，35℃摇瓶培养，转速为220rpm/min；
B、二级种子培养：一级种子生长5-8h，OD600＝3.0后，按1％的接种量接入装有二级种子培养基的二级种子罐中，控制反应温度35℃，溶氧70-80％，转速为200rpm/min，pH 7.0，通风比为1VVM，发酵罐罐压为0.025Mpa，进行菌种培养。
3.根据权利要求2所述的一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法，其特征在于，所述一级种子培养基的具体组成为：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L，水定容至1L。
4.根据权利要求2所述的一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法，其特征在于，所述二级种子培养基的具体组成为：葡萄糖30g/L、磷酸二氢钾10g/L、氯化铵3g/L、氯化钠5g/L、七水硫酸镁0.247g/L、氯化钙0.011g/L，水定容至1L。
5.根据权利要求2所述的一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法，其特征在于，第二步，将第一步获得的种子液接种到发酵罐营养液中，具体操作如下：二级种子罐的菌种生长至OD600＝6.0，接入发酵罐营养液中，接种量为1％，接种后，温度控制在35℃，用15％氨水调节控制pH 7.0，通风比为1VVM，发酵罐罐压0.02-0.025Mpa，DO维持在70-80％，转速为400rpm/min，发酵至OD600＝15-15.5，一次性无菌加入IPTG进行诱导。
6.根据权利要求5所述的一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法，其特征在于，所述发酵罐营养液的制备方法如下：
a、称取、灭菌：将氯化铵30g、磷酸二氢钾100g、氯化钠50g和水9L混合并加入发酵罐中，115-121℃，灭菌20-30min；
b、冷却：将灭菌后的发酵罐置于常温下冷却至35℃；
c、葡萄糖300g和七水硫酸镁2.47g混合用水定容0.9L、氯化钙0.11g、微量元素150mL、浓度为50mg/mL的卡那霉素10mL单独灭菌，并于接种前一同放入发酵罐中。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116904527A (zh) * 2023-09-04 2023-10-20 山东福洋生物科技股份有限公司 一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5529912A (en) * 1991-03-20 1996-06-25 Carnegie Mellon University Inositol-excreting yeast
CN102869639A (zh) * 2010-02-15 2013-01-09 Abbvie公司 制备鲨肌醇的方法
WO2014116072A1 (ko) * 2013-01-28 2014-07-31 주식회사 디와이내츄럴 효소 반응법을 이용한 마이오-이노시톨로부터 d-카이로-이노시톨을 생산하는 방법
WO2014151645A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 Butamax Advanced Biofuels Llc Process for maximizing biomass growth and butanol yield by feedback control
CN106148425A (zh) * 2015-04-17 2016-11-23 张以恒 肌醇的制备方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5529912A (en) * 1991-03-20 1996-06-25 Carnegie Mellon University Inositol-excreting yeast
CN102869639A (zh) * 2010-02-15 2013-01-09 Abbvie公司 制备鲨肌醇的方法
WO2014116072A1 (ko) * 2013-01-28 2014-07-31 주식회사 디와이내츄럴 효소 반응법을 이용한 마이오-이노시톨로부터 d-카이로-이노시톨을 생산하는 방법
WO2014151645A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 Butamax Advanced Biofuels Llc Process for maximizing biomass growth and butanol yield by feedback control
CN106148425A (zh) * 2015-04-17 2016-11-23 张以恒 肌醇的制备方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116904527A (zh) * 2023-09-04 2023-10-20 山东福洋生物科技股份有限公司 一种重组大肠杆菌发酵生产肌醇的方法

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