CN111733200A - 调节ptm1添加方式提高重组胶原蛋白生产水平的发酵工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种调节PTM1添加方式提高重组胶原蛋白生产水平的发酵工艺。所述工艺先将毕赤酵母菌种液接种到灭菌的发酵培养基中,发酵培养14~18小时后,开始补加甲醇进行诱导表达,同时向发酵培养基中流加PTM1,PTM1流加速度控制在30‑300ml/h。本发明在发酵过程中,选取在甲醇诱导表达阶段将PTM1与甲醇分开添加至发酵培养基中,提高重组胶原蛋白的生物合成速率,并且采用连续流加的方式,能够进一步提高重组胶原蛋白的生物合成速率,同时重组胶原蛋白的表达量增加,发酵水平提高20%以上,节约生产成本,特别适用于重组胶原蛋白的工业化大规模生产。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域,涉及一种调节PTM1添加方式提高重组胶原蛋白生产水平的发酵工艺。
背景技术
胶原蛋白是动物体内一类重要的蛋白质,广泛分布于皮肤、软骨、血管等组织,参与细胞的迁移、分化和繁殖,对维护细胞、组织、器官的正常生理功能起着重要的作用,在食品、饲料、美容、化妆品、医药等领域应用普遍。目前,胶原蛋白原料主要通过酸、碱、加热等物理化学方法处理如猪、牛等动物皮肤、骨骼等组织后分离纯化获得。但是,上述方法得到的胶原蛋白成分复杂,水溶性差,并且由于来自动物组织,存在病毒隐患,限制了胶原蛋白在医药方面的应用。
随着DNA重组技术的迅速发展,各种宿主细胞被选为基因工程菌用于表达胶原蛋白。与传统工艺相比,胶原蛋白的基因工程菌发酵工艺具有生产原料易得、环保、产品质量稳定等优点,但是也存在着发酵周期较长,生产效率较低等问题。中国专利20181004890.8公开了一种毕赤酵母表达重组胶原蛋白的甲醇流加发酵工艺,胶原蛋白产量超过20g/L,产量提高5%以上,重组胶原蛋白的回收率达到75%以上。重组胶原蛋白表达量虽有所提高,但提升幅度不大。因此,需要进一步地提高蛋白表达量,进而提高发酵水平,有利于胶原蛋白的工业化大规模生产,为产业化生产带来实际应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种调节PTM1添加方式提高重组胶原蛋白生产水平的发酵工艺,通过在发酵过程中将甲醇和PTM1分开添加,调节毕赤酵母菌的生长代谢速度,提高重组胶原蛋白的表达量,进一步提升重组胶原蛋白的生产水平。
实现本发明目的的技术方案如下:
调节PTM1添加方式提高重组胶原蛋白生产水平的发酵工艺,包括以下步骤:将毕赤酵母菌种液接种到灭菌的发酵培养基中,发酵培养14~18小时后,开始流加甲醇进行诱导表达,同时向发酵培养基中流加PTM1溶液,其中PTM1流加速度为30~300ml/h。
优选地,所述的PTM1流加速度为100~200ml/h。
本发明所述的毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris,已于2011年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.5021,并在中国专利201110327865.5中充分公开。
本发明所述的毕赤酵母发酵培养基采用现有配方,可以是:85%H3PO46.6~26.7mL/L,CaSO4·2H2O 0.3~1.175g/L,K2SO4 4.5~18.2g/L,MgSO4·7H2O 3.7~14.9g/L,KOH 1.0~4.13g/L,甘油10.0~40.0g/L,PTM1溶液0.435~4.35mL/L。
本发明所述的PTM1溶液采用现有配方,可以是:CuSO4·5H2O 6.0g/L;NaI 0.08g/L;MnSO4·H2O 3.0g/L;NaMoO4·2H2O 0.2g/L;H3BO3 0.02g/L;CoCl2 0.5g/L;ZnCl220.0g/L;FeSO4·7H2O 65.0g/L;生物素0.2g/L;H2SO4 5.0mL/L。
本发明的发酵工艺中,毕赤酵母菌种液的接种量为8~12%,发酵温度为28~30℃,氨水调节pH为5.0~5.2,溶氧不低于20%,甲醇诱导时间为90~120小时。
与现有技术相比,本发明的显著效果如下:本发明在发酵过程中,通过在甲醇诱导表达阶段,添加PTM1溶液,提高了重组胶原蛋白的生物合成速率,并且采用连续流加的方式,提高表达量,发酵水平最高提升了20%,大大节约了生产成本,特别适用于重组胶原蛋白的工业化大规模生产。
具体实施方式
在本发明的具体实施例中,采用的菌株为表达重组胶原蛋白的毕赤酵母,为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris,保藏编号为CGMCC NO.5021,保藏日期为2011年6月29日,保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
本发明所述的PTM1溶液参照Invitrogen公司的操作手册,具体配方为:CuSO4·5H2O 6.0g/L;NaI 0.08g/L;MnSO4·H2O 3.0g/L;NaMoO4·2H2O 0.2g/L;H3BO30.02g/L;CoCl2 0.5g/L;ZnCl2 20.0g/L;FeSO4·7H2O 65.0g/L;生物素0.2g/L;H2SO45.0mL/L,用0.22μm的滤膜过滤除菌,室温保存。
下面结合实施例对本发明作进一步详述。
实施例1
发酵培养基:85%H3PO4 26.7mL/L;CaSO4·2H2O 1.175g/L;K2SO4 18.2g/L;MgSO4·7H2O 14.9g/L;KOH 4.13g/L;甘油40.0g/L;PTM1 4.35mL/L。
将种子液按照10%的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中,初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa,调节空气流量和转速使溶氧(DO)>30%。当碳源耗尽后,溶氧陡然上升,开始流加50%甘油,补充碳源,至菌体湿重为212g/L,停止补加甘油,此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇,进入甲醇诱导培养阶段,同时开始流加PTM1,流加速度为30ml/h。调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)>20%,诱导发酵114h后,结束发酵,收集发酵液,离心获得发酵液上清,经HPLC检测,最终重组胶原蛋白浓度为25.5g/L,发酵周期130小时,发酵生产水平为0.196g/L·h,与对比例1相比提高22.5%。
实施例2
发酵培养基:85%H3PO4 26.7mL/L;CaSO4·2H2O 1.175g/L;K2SO4 18.2g/L;MgSO4·7H2O 14.9g/L;KOH 4.13g/L;甘油40.0g/L;PTM1 4.35mL/L。
将种子液按照10%的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中,初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa,调节空气流量和转速使溶氧(DO)>30%。当碳源耗尽后,溶氧陡然上升,开始流加50%甘油,补充碳源,至菌体湿重为212g/L,停止补加甘油,此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇,进入甲醇诱导培养阶段,同时开始流加PTM1,流加速度为100ml/h。调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)>20%,诱导发酵114h后,结束发酵,收集发酵液,离心获得发酵液上清,经HPLC检测,最终重组胶原蛋白浓度为26.8g/L,发酵周期130小时,发酵生产水平为0.206g/L·h,与对比例1相比提高28.8%。
实施例3
发酵培养基:85%H3PO4 26.7mL/L;CaSO4·2H2O 1.175g/L;K2SO4 18.2g/L;MgSO4·7H2O 14.9g/L;KOH 4.13g/L;甘油40.0g/L;PTM1 4.35mL/L。
将种子液按照10%的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中,初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa,调节空气流量和转速使溶氧(DO)>30%。当碳源耗尽后,溶氧陡然上升,开始流加50%甘油,补充碳源,至菌体湿重为212g/L,停止补加甘油,此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇,进入甲醇诱导培养阶段,同时开始流加PTM1,流加速度为200ml/h。调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)>20%,诱导发酵114h后,结束发酵,收集发酵液,离心获得发酵液上清,经HPLC检测,最终重组胶原蛋白浓度为26.0g/L,发酵周期130小时,发酵生产水平为0.200g/L·h。与对比例1相比提高25.0%。
实施例4
发酵培养基:85%H3PO4 26.7mL/L;CaSO4·2H2O 1.175g/L;K2SO4 18.2g/L;MgSO4·7H2O 14.9g/L;KOH 4.13g/L;甘油40.0g/L;PTM1 4.35mL/L。
将种子液按照10%的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中,初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa,调节空气流量和转速使溶氧(DO)>30%。当碳源耗尽后,溶氧陡然上升,开始流加50%甘油,补充碳源,至菌体湿重为212g/L,停止补加甘油,此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇,进入甲醇诱导培养阶段,同时开始流加PTM1,流加速度为300ml/h。调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)>20%,诱导发酵114h后,结束发酵,收集发酵液,离心获得发酵液上清,经HPLC检测,最终重组胶原蛋白浓度为25.1g/L,发酵周期130小时,发酵生产水平为0.193g/L·h,与对比例1相比提高20.6%。
对比例1
发酵培养基:85%H3PO4 26.7mL/L;CaSO4·2H2O 1.175g/L;K2SO4 18.2g/L;MgSO4·7H2O 14.9g/L;KOH 4.13g/L;甘油40.0g/L;PTM1 4.35mL/L。将种子液按照10%的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中,初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa,调节空气流量和转速使溶氧(DO)>30%。当碳源耗尽后,溶氧陡然上升,开始流加50%甘油,补充碳源,至菌体湿重为212g/L,停止补加甘油,此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇,进入甲醇诱导培养阶段,通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)>20%,诱导发酵114h后,结束发酵,收集发酵液,离心获得发酵液上清,经HPLC检测,最终重组胶原蛋白浓度为20.8g/L,发酵周期130小时,发酵生产水平为0.160g/L·h。
对比例2
发酵培养基:85%H3PO4 26.7mL/L;CaSO4·2H2O 1.175g/L;K2SO4 18.2g/L;MgSO4·7H2O 14.9g/L;KOH 4.13g/L;甘油40.0g/L;PTM1 4.35mL/L。
将种子液按照10%的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中,初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa,调节空气流量和转速使溶氧(DO)>30%。当碳源耗尽后,溶氧陡然上升,开始流加50%甘油,补充碳源,至菌体湿重为212g/L,停止补加甘油,此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇,进入甲醇诱导培养阶段,同时开始流加PTM1,流加速度为400ml/h。调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)>20%,诱导发酵114h后,结束发酵,收集发酵液,离心获得发酵液上清,经HPLC检测,最终重组胶原蛋白浓度为21.2g/L,发酵周期130小时,发酵生产水平为0.163g/L·h,与对比例1相比仅提高1.9%。
Claims (6)
1.调节PTM1添加方式提高重组胶原蛋白生产水平的发酵工艺,其特征在于,包括以下步骤:将毕赤酵母菌种液接种到灭菌的发酵培养基中,发酵培养14~18小时后,开始流加甲醇进行诱导表达,同时向发酵培养基中流加PTM1溶液,其中PTM1流加速度为30~300ml/h。
2.根据权利要求1所述的发酵工艺,其特征在于,所述的PTM1流加速度为100~200ml/h。
3.根据权利要求1所述的发酵工艺,其特征在于,所述的毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris,保藏编号为CGMCC No.5021。
4.根据权利要求1所述的发酵工艺,其特征在于,所述的发酵培养基配方为:85%H3PO46.6~26.7mL/L,CaSO4·2H2O 0.3~1.175g/L,K2SO4 4.5~18.2g/L,MgSO4·7H2O 3.7~14.9g/L,KOH 1.0~4.13g/L,甘油10.0~40.0g/L,PTM1溶液0.435~4.35mL/L。
5.根据权利要求1所述的发酵工艺,其特征在于,所述的PTM1溶液的配方为:CuSO4·5H2O 6.0g/L;NaI 0.08g/L;MnSO4·H2O 3.0g/L;NaMoO4·2H2O 0.2g/L;H3BO30.02g/L;CoCl2 0.5g/L;ZnCl2 20.0g/L;FeSO4·7H2O 65.0g/L;生物素0.2g/L;H2SO45.0mL/L。
6.根据权利要求1所述的发酵工艺,其特征在于,所述的毕赤酵母菌种液的接种量为8~12%,发酵温度为28~30℃,氨水调节pH为5.0~5.2,溶氧不低于20%,甲醇诱导时间为90~120小时。
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