CN111560364B - 一种埃洛石基印迹固载酶的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及功能材料技术领域，为解决环境污染物PAEs治理的日益紧迫，本发明提出了一种埃洛石基印迹固载酶的制备方法及其应用，所述埃洛石纳米管通过两步法合成新型绿色纳米管基印迹固载酶，以埃洛石纳米管为载体，选用乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，表面经过硅烷偶联剂改性的纳米管为基底，以甲基丙烯酸甲酯为功能单体在载体表面接枝PAEs分子的印迹聚合物层。洗去模板分子获得印迹载体制备的固定化酶固定更加稳定，固定量增大，同时具有专一、无毒、储量丰富、价格低廉、易分离回收、可重复使用、稳定性强等特点，在制备过程中具有节约成本、对环境无害等优点。

Description

一种埃洛石基印迹固载酶的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及功能材料技术领域，特别涉及一种埃洛石基印迹固载酶的制备方法及其应用。
背景技术
酶作为一类高效的生物催化剂，具有温和的反应条件、环境友好、经济可行性、优秀的区域选择性和立体选择性等优点，因而被广泛应用，尤其是生物技术领域。但是，游离酶在大规模的实际应用中存在着一些显著的缺点，例如：酶不易回收、高成本、低稳定性等，使游离酶的使用广受限制。
酶的固定化是酶工程的一种手段，因固定化酶技术提高了酶的稳定性，实现了酶的重复使用，并且降低了成本，使其成为当前的研究热点，具有高效降解效能的生物酶以其专一、无毒的特点吸引了众多专家的关注。固定化酶成为了近年污染物降解技术的前沿，也在食品、生物技术等领域有大量应用。固定化酶技术的出现为克服游离酶的缺点和为酶的大规模应用提供了有效途径，使其成为酶工程研究与应用的热点之一。固载基质是固定化酶高效、稳定的关键，已有文献和专刊报道：已发现了诸多不同基质固定化酶的研究应用，例如用纤维素衍生物、双醛淀粉-SiO2杂化材料等为基质，通过固定化酶技术制备了固载酶，但是还是存在不能重复使用等不足，因此寻找合适的基质并开发固定化酶是该领域的方向和热点。
邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAEs，是邻苯二甲酸形成的酯的统称。 (简言之就是塑化剂的一种)当被用作塑料增塑剂时，一般指的是邻苯二甲酸与 4～15个碳的醇形成的酯。其中邻苯二甲酸二辛酯是最重要的品种。邻苯二甲酸酯是一类能起到软化作用的化学品还可干扰内分泌系统。邻苯二甲酸酯主要用于聚氯乙烯材料，令聚氯乙烯由硬塑胶变为有弹性的塑胶，起到增塑剂的作用。它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品(如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液)等数百种产品中，但是近年来，这类化合物引起的环境健康危害，受到了环境科学，公共卫生领域，媒体甚至普通大众的广泛关注。2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考，二(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯在2B类致癌物清单中。
近年，随着典型环境污染物PAEs治理的日益紧迫，利用生物活性酯酶催化降解PAEs的高效、专一性能，并开发其在PAEs污染物治理方面的应用成为目前研究的重点。
发明内容
为解决环境污染物PAEs治理的日益紧迫，本发明提出了一种埃洛石基印迹固载酶的制备方法及其应用，制备的固定化酶固定更加稳定，固定量增大，同时具有专一、无毒、储量丰富、价格低廉、易分离回收、可重复使用、稳定性强等特点，在制备过程中具有节约成本、对环境无害等优点。
本发明是通过以下技术方案实现的：所述埃洛石纳米管(HNTs)通过两步法合成新型绿色纳米管基印迹固载酶，以埃洛石纳米管(Halloysite Nanotubes， HNTs)为载体，选用乙二醇二甲基丙烯酸酯(Ethylene Glycol Dimethacrylate， EGDMA)为交联剂，表面经过硅烷偶联剂改性的纳米管为基底，以甲基丙烯酸甲酯(Methyl Methacrylate，MMA)为功能单体在载体表面接枝PAEs分子(邻苯二甲酸二甲酯(Dimethyl Phthalate，DMP)为例)的印迹聚合物层。洗去模板分子获得印迹载体。具体制备方法为以下步骤：
(1)HNTs的纯化：将HNTs、HCl混合后，在室温下搅拌反应，洗涤后在恒温条件下烘干，将烘干后产物与二甲基甲酰胺(N，N-Dimethylformamide，DMF)、硅烷偶联剂混合后，在通入保护气的条件下回流，回流后的产物进行洗涤，并干燥，研磨过筛得产物1；
HCl用于使埃洛石扩孔，增加比表面，提高吸附量。作为优选，HCl的质量浓度为35％-37％，HNTs与HCl的质量体积比为0.5-3g∶10mL。
作为优选，所述HNTs和HCl混合后，搅拌的时间为24h以上，目的是使之混合均匀；所述混合物充分反应后，选用蒸馏水多次洗涤，洗涤次数应大于等于3次，直至pH稳定为止；所述恒温条件优选为55-65℃；所述烘干时间优选为24h以上。
作为优选，烘干后产物、DMF、硅烷偶联剂的优选使用量0.5-3g∶4mL∶ 1mL，烘干后产物、DMF和硅烷偶联剂全部混合后超声混匀。作为优选，先通入保护气N220-30min，然后升温至55-65℃，再持续通入N2的同时搅拌，反应时间为8-12h。所述回流产物的洗涤试剂优选为甲醇、乙醇、乙醚中的一种；所述洗涤次数应大于等于3次；所述干燥时间优选4-12h。
硅烷偶联剂优选为KH550、KH560、KH570中的一种。
埃洛石纳米管(Halloysite Nanotubes，HNTs)是一种天然的中空多壁纳米管，储量丰富，价格低廉，具有较高长径比，较大比表面积、高机械强度、高分散性和热稳定性等，是一种绿色的纳米材料，本发明充分利用HNTs的结构特征和纳米尺度特点，结合生物活性酯酶催化降解PAEs的高效、专一性能，开展新型 HNTs纳米管基固载酶材料的研究，并开发其在PAEs污染物治理方面的应用。
(2)将邻苯二甲酸二甲酯、MMA、EDGMA全部溶于二甲基甲酰胺中，持续通入保护气后升温并在保护气中搅拌反应，完全溶解后，加入产物1，超声混匀后加入偶氮二异丁腈(Azodiisobutyronitrile，AIBN)，反应后得到印迹聚合物；
所述的邻苯二甲酸二甲酯、MMA、EDGMA的摩尔比为1-5∶4∶20，产物 1与偶氮二异丁腈、邻苯二甲酸二甲酯的使用量为0.5g-8g∶20mg∶1mmol，所述二甲基甲酰胺的用量为使溶质溶解的量，优选邻苯二甲酸二甲酯与二甲基甲酰胺的摩尔体积比为1mmol∶80mL。
所述持续通入保护气后升温并在保护气中搅拌反应是指预先通保护气20-30min，然后升温至55-65℃，在持续通入保护气体的同时搅拌反应时间为0.5-1h。
所述超声混匀是指将反应物放入频率为80-120HZ的超声箱中，超声时间优选为0.5-1h。
作为优选，加入AIBN后反应温度为55-65℃，机械搅拌反应时间大于等于 1h。
本步骤以埃洛石纳米管(Halloysite Nanotubes，HNTs)为载体，以乙二醇二甲基丙烯酸酯(Ethylene Glycol Dimethacrylate，EGDMA)作为交联剂，以甲基丙烯酸甲酯(Methyl Methacrylate，MMA)为功能单体，在载体表面接枝PAEs分子(邻苯二甲酸二甲酯(Dimethyl Phthalate，DMP)的印迹聚合物层。
埃洛石基分子印迹聚合物反应结构式如图5所示。
(3)将印迹聚合物采用甲醛与乙酸的混合液进行提取，除去模板和杂质后，干燥后即得印迹HNTs；
所述提取混合液中甲醛与乙酸的体积比为3.5-4.5∶1。
作为优选，所述提取方法为常规的索氏提取，提取时间应大于等于24h；
作为优选，干燥为真空干燥，真空度为-0.05MPa～-0.07MPa，温度恒定 55-65℃，充分干燥12h以上，烘干至质量不再有明显变化为止。
(4)对印迹HNTs进行改性，然后进行若干次恒温洗涤后得到产物2；
作为优选，采用N，N′-羰基二咪唑活化法(CDI法)对印迹HNTs进行改性。具体步骤为：将印迹HNTs置于微型离心管中，依次使用水，水∶丙酮体积比＝3∶ 7，水∶丙酮体积比＝5∶5，水∶丙酮体积比＝7∶3，丙酮，进行超声震荡洗涤，高速离心机进行离心，以进一步除去印迹HNTs上残留的杂质，提高固定效率。在常温下，加入N，N′-羰基二咪唑(CDI)在丙酮中，恒温超声震荡处理印迹HNTs 表面2.5-5h，离心分离液体，其中，印迹HNTs与CDI优选质量比为1∶0.2-2；超声洗涤次数应大于3次；离心转速应大于5000r；超声频率在80-120Hz；超声时间应在2.5-5h之间；处理过程应恒温在2-28℃之间，以保证载体稳定性。
N，N′-羰基二咪唑，作为一种试剂，用于活化印迹HNTs上的羟基，使酶更容易固载上去。印迹HNTs上的羟基不够活泼，很难与生物酶上的氨基反应，所以使用活化剂使印迹HNTs具有活性羰基，易于后面的固定化酶。
然后用磷酸缓冲溶液(50mmol·L-1，pH＝8.5)，对改性后的印迹物进行多次恒温超声洗涤，温度在20℃左右，洗涤3次以上，得产物2，以去除表面残留的丙酮，这是固定化前的洗涤。优选，超声洗涤频率在80-120Hz。
(5)将磷酸盐缓冲溶液加入pH值＝5.5-9.0的酯酶溶液中，混合搅匀后，加入产物2，再加入CoCl2，将所得悬浮液在2-10℃，超声震荡20-30h后，分离出生物轭合物，洗涤后添加猝化剂，再洗涤若干次后得到终产物，即埃洛石基印迹固载酶。
作为优选，CoCl2是固体，溶于磷酸溶液中，形成溶剂，保持酶的活性，CoCl2的摩尔体积为1mol·m-3。
作为优选，磷酸缓冲溶液(50mmol·L-1，pH＝8.5)与酯酶溶液的体积比为 5∶1，作为产物2的溶剂。
作为优选，酯酶溶液的活性为0.1u·mL-1-0.4u·mL-1。
分离出生物轭合物后用含0.05％Tween20(v/v)的磷酸盐缓冲溶液洗涤若干次，分离出游离的酶和固定不牢固的酶。
作为优选，所述猝化剂选用乙醇胺，作为阻断过量的反应基因，乙醇胺作为猝化剂阻断过量的反应基因，最后彻底洗涤即得到具有特异性识别能力且能重复多次使用的固定化酶。
作为优选，用含0.05％Tween20(v/v)的磷酸盐缓冲溶液进行彻底超声震荡洗涤0.5h，制得最终产物，所述彻底洗涤的次数应大于等于3次。
上述制备方法过程中，所述的保护气体优选为N2。超声频率为80-120Hz。
埃洛石基分子印迹固载酶制备结构式如图6所示。
所述的一种埃洛石基印迹固载酶的制备方法得到的埃洛石基印迹固载酶在 PAEs污染物治理方面的应用。本发明将生物酶与兼具稳定性和分散性的纳米管基底结合，制备集定向识别和高效降解于一体的新型功能材料，不但保持了酶的高效、专一等催化特性，且使其具备易分离回收、可重复使用、稳定性强等优点。
本发明提供了一种固定化酶，其以HNTs为载体，选用乙二醇二甲基丙烯酸酯(Ethylene Glycol Dimethacrylate，EGDMA)为交联剂，表面经过硅烷偶联剂改性的纳米管为基底，以甲基丙烯酸甲酯(Methyl methacrylate，MMA)为功能单体在载体表面接枝PAEs分子的印迹聚合物层。洗去模板分子获得印迹载体。方法切实可行，并对PAEs有显著的降解效果。本发明制备的固定化酶具有专一、无毒、储量丰富、价格低廉、易分离回收、可重复使用、稳定性强等优点。在处理过程中具有节约成本、对环境无害等意义。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)实现了酶的重复使用，降低了成本利用生物酶材料降解环境污染物，具有高效降解效能；
(2)生物酶具有专一性且无毒的特点，并具有易分离回收、可重复使用、稳定性强的特点；
(3)所用到的HNTs是一种天然的中空多壁纳米管，储量丰富，价格低廉，得到的埃洛石基印迹固载酶具有较高的性价比。
附图说明
图1为HNTs、扩孔HNTs、AHNTs、MHNTs和EHNT的红外表征图；
图2为印迹固载酶功能区示意图；
图3不同温度下的固载酶的热力学稳性曲线；
图4不同温度下的游离酶的热力学稳性曲线；
图5为埃洛石基分子印迹聚合物反应结构式；
图6为埃洛石基分子印迹固载酶制备结构式。
具体实施方式
下面通过实施例和附图对本发明作进一步详细说明，实施例中所用原料均可市购或采用常规方法制备。
以下实施例中缩写的含义：埃洛石纳米管(HNTs)，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)，硅烷偶联剂(KH570)，邻苯二甲酸酯(DMP)，偶氮二异丁腈 (AIBN)，二甲基甲酰胺(DMF)，甲基丙烯酸(MAA)。
实施例1：
(1)HNTs的纯化：将5g HNTs、100mL 36％的HCl超声混匀后，水浴中机械搅拌反应24h。然后用蒸馏水超声离心洗涤3次，至pH恒定为止，然后在真空度为-0.06Mpa的真空烘箱60℃恒温条件下烘干24h，然后将5g烘干产物、20mL DMF和5mL KH550超声混合后，先通入保护气N225min，在N2保护的条件下 60℃回流8小时；回流后的产物分别用甲醇、乙醇、乙醚超声离心洗涤三次，真空度为-0.06Mpa的真空烘箱中60℃干燥12h，研磨过筛得产物1。
(2)将1mmol邻苯二甲酸二甲酯、4mmol MMA和20mmol EDGMA溶于80 mL DMF，持续通入N2后升温至60℃，并在保护气中搅拌反应，完全溶解后，加入5g产物1，水浴中机械混合搅拌30min。混匀后，加入20mg AIBN，在60℃条件下机械搅拌，充分反应24小时，得到印迹聚合物。
(3)将印迹聚合物用甲醛与乙酸的体积比为4∶1的混合溶剂索氏提取24小时，待除去模板和杂质后，60℃真空度为-0.06Mpa的真空烘箱干燥12小时，即得印迹HNTs。
(4)采用CDI法对印迹HNTs进行改性：将0.1g印迹HNTs置于5mL微型离心管中，依次使用水，水∶丙酮体积比＝7∶3，水∶丙酮体积比＝5∶5，水∶丙酮体积比＝3∶7，丙酮，分别配置溶液2mL，进行超声震荡洗涤，5000r/min 高速离心机进行离心，进一步去除印迹HNTS上残留的杂质，提高固定效率，在23℃下，加入0.1g CDI在干丙酮中恒温超声震荡处理印迹HNTs表面2.5h，在5000r/min下离心分离液体。然后用磷酸缓冲溶液(50mmol·L-1，pH＝8.5)，对表面处理过的印迹物进行3次恒温超声洗涤，温度在20℃，得产物2，上述超声频率为100Hz。
(5)将2.5mL 50mL·m-3磷酸盐缓冲溶液加入pH值＝8.5的0.5mL酯酶溶液中，混合搅匀后，加入0.1g产物2，此时酶的活性为0.2u·mL-1，加入1mol·m-3 CoCl21mL，所得悬浮液在4℃下，超声震荡24h。然后从混合物中分离出生物轭合物，并用含0.05(v/v)％Tween20的磷酸盐缓冲溶液频繁洗涤，分离出游离的酶和固定不牢固的酶后，再用乙醇胺作为猝化剂阻断过量的反应基因。最后，用含0.05(v/v)％Tween20的磷酸盐缓冲溶液对所得样品进行彻底超声震荡洗涤 0.5h，制得最终产品，一种埃洛石基印迹固载酶1。
实施例2
(1)HNTs的纯化：将10g HNTs、100mL 35％的HCl超声混匀后，水浴中机械搅拌反应24h。然后用蒸馏水超声离心洗涤3次，至pH恒定为止，然后在真空度为-0.07Mpa的真空烘箱55℃恒温条件下烘干30h，然后将10g烘干产物、20mL DMF和5mL KH560超声混合后，先通入保护气N2 30min，在N2保护的条件下 55℃回流12小时；回流后的产物分别用甲醇、乙醇、乙醚超声离心洗涤三次，真空度为-0.07Mpa的真空烘箱中55℃干燥12h，然后研磨得到产物1。
(2)将3mmol邻苯二甲酸二甲酯、4mmol MMA和20mmol EDGMA溶于80 mL DMF，持续通入N2后升温并在保护气中搅拌反应，完全溶解后，加入1g产物1，水浴中机械混合搅拌30min。混匀后，加入20mg AIBN,在55℃条件下机械搅拌2，充分反应24小时，得到印迹聚合物。
(3)将印迹混合物用甲醛与乙酸的体积比为4∶1的混合溶剂索氏提取24小时，待除去模板和杂质后，55℃真空度为-0.07Mpa的真空烘箱干燥15小时，即得印迹HNTs。
(4)采用CDI法对印迹HNTs进行改性：将0.1g印迹HNTs置于5mL微型离心管中，依次使用水，体积比为水∶丙酮＝3∶7，水∶丙酮＝5∶5，水∶丙酮＝7∶ 3，丙酮，每种溶液2mL，进行超声震荡洗涤，5000r/min高速离心机进行离心。 (进一步去除印迹HNTS上残留的杂质，提高固定效率)在23℃下，加入0.15g CDI在干丙酮中恒温超声震荡处理印迹HNTs表面2.5h，在5000r/min下离心分离液体。然后用磷酸缓冲溶液(50mmol·L-1，pH＝8.5)，对表面处理过的印迹物进行3次恒温超声洗涤，温度在20℃，得产物2，上述超声频率为120Hz。
(5)将适量2.5mL 50mL·m-3磷酸盐缓冲溶液加入pH值为8.5的0.5mL酯酶溶液中，混合搅匀后，加入0.1g产物2，此时酶的活性为0.2u·mL-1，加入1mL 1mol·m-3CoCl2，所得悬浮液在4℃下，超声震荡24h。然后从混合物中分离出生物轭合物，并用含0.05(v/v)％Tween20的磷酸盐缓冲溶液频繁洗涤，分离出游离的酶和固定不牢固的酶后，再用乙醇胺作为猝化剂阻断过量的反应基因。最后，用含0.05(v/v)％Tween20的磷酸盐缓冲溶液对所得样品进行彻底超声震荡洗涤0.5h，制得最终样品，一种埃洛石基印迹固载酶2。
实施例3
(1)HNTs的纯化：将15g HNTs、100mL 37％的HCl超声混匀后，水浴中机械搅拌反应24h。然后用蒸馏水超声离心洗涤3次，至pH恒定为止，然后在真空度为-0.05Mpa的真空烘箱65℃恒温条件下烘干24h，然后将15g烘干产物、 20mL DMF和5mL KH570超声混合后，先通入保护气N2 20min，在N2保护的条件下65℃回流8小时；回流后的产物分别用甲醇、乙醇、乙醚超声离心洗涤三次，真空度为-0.05Mpa的真空烘箱中65℃干燥8h，然后研磨得到产物1。
(2)将5mmol邻苯二甲酸二甲酯、4mmol MMA和20mmol EDGMA溶于80 mL DMF，持续通入N2后升温并在保护气中搅拌反应，完全溶解后，加入8g 产物1，水浴中机械混合搅拌30min。混匀后，加入20mg AIBN，在65℃条件下机械搅拌2，充分反应24小时，得到印迹聚合物。
(3)将印迹混合物用甲醛与乙酸的体积比为4∶1的混合溶剂索氏提取24小时，待除去模板和杂质后，65℃真空度为-0.05Mpa的真空烘箱干燥12小时，即得印迹HNTs。
(4)采用CDI法对印迹HNTs进行改性：将0.1g印迹HNTs置于5mL微型离心管中，依次使用水，体积比为水∶丙酮＝7∶3，水∶丙酮＝5∶5，水∶丙酮＝3∶ 7，丙酮，每种溶液2mL，进行超声震荡洗涤，5000r高速离心机进行离心。(进一步去除印迹HNTS上残留的杂质，提高固定效率)在23℃下，加入0.2g CDI 在干丙酮中恒温超声震荡处理印迹HNTs表面2.5h，在5000r/min下离心分离液体。然后用磷酸缓冲溶液(50mmol·L-1，pH＝8.5)，对表面处理过的印迹物进行多次恒温超声洗涤，温度在20℃，洗涤3次。得产物2，上述超声频率为80Hz。
(5)将适量2.5mL 50mL·m-3磷酸盐缓冲溶液加入pH值为8.5的0.5mL酯酶溶液中，混合搅匀后，加入0.1g产物2，此时酶的活性为0.2u·mL-1，加入1mL 1mol·m-3CoCl2，所得悬浮液在4℃下，超声震荡24h。然后从混合物中分离出生物轭合物，并用含0.05(v/v)％Tween20的磷酸盐缓冲溶液频繁洗涤，分离出游离的酶和固定不牢固的酶后，再用乙醇胺作为猝化剂阻断过量的反应基因。最后，用含0.05(v/v)％Tween20的磷酸盐缓冲溶液对所得样品进行彻底超声震荡洗涤0.5h，制得最终样品，一种埃洛石基印迹固载酶3。
测试例1
HNTs、扩孔HNTs、AHNTs、MHNTs和EHNTs的红外谱图如图1所示，由红外谱图可知通过本实验方法，成果能制得印迹固载酶材料。
埃洛石基分子印迹固载酶的功能区示意图如图2所示，说明该埃洛石基分子印迹固载酶具有印迹物，且有酶降解功能，同时结合后对PAEs的降解率更好。
测试例2
(1)实施例2制备的埃洛石基印迹固载酶2的重复使用性能如表1所示：
表1：
Figure BDA0002442336170000091
(2)实施例2制备的埃洛石基印迹固载酶2的固载率如表2所示.
表2：
Figure BDA0002442336170000092
(3)实施例2制备的埃洛石基印迹固载酶2在不同温度下的热力学稳性曲线如图3所示，说明随着温度的升高和时间的，埃洛石基印迹固载酶的相对酶活力不断下降，其最适温度为40℃。不同温度的固载酶活性如表3所示。
表3：(相对酶活力/％)
Figure BDA0002442336170000093
Figure BDA0002442336170000101
(4)不同温度下的游离酶的热力学稳性曲线如图4所示，通过与固载酶的相对酶活力曲线图进行对比，说明相比于游离酶来说，固载酶更易于储存，重复使用性更强，能更好地降低成本。不同温度的游离酶活性，如表4所示。
表4：(相对酶活力/％)
Figure BDA0002442336170000102
测试例3
(1)将实施例1-3制备所得的埃洛石基印迹固载酶进行酶活检测，结果如下表5 所示。
表5
Figure BDA0002442336170000103
(2)对实施例1-3所制备的埃洛石基印迹固载酶进行降解性能的检测。具体检测中，以获得分别对PAEs的降解效率来进行，选取的PAEs溶液1L，成分为：邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)，邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)，邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP)，埃洛石基印迹固载酶的添加量为20ug/L，固载酶降解效率如表6所示：
表6
Figure BDA0002442336170000104
经由上表的检测结果可以看出，通过本发明的制备方法所制备的埃洛石基印迹固载酶，其对PAEs有着较好的降解作用，酶利用率较高，可获得较好的降解效果，从而利于在污染水体中的应用。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种埃洛石基印迹固载酶的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：
（1）HNTs的纯化：将 HNTs、HCl混合后，在室温下搅拌反应，洗涤后在恒温条件下烘干，将烘干后产物与二甲基甲酰胺、硅烷偶联剂混合后，在通入保护气的条件下回流，回流后的产物进行洗涤若干次，并干燥，然后研磨得到产物1；
（2）将邻苯二甲酸二甲酯、MMA、EDGMA全部溶于二甲基甲酰胺中，持续通入保护气后升温并在保护气中搅拌反应，完全溶解后，加入产物1，超声混匀后加入偶氮二异丁腈,在真空条件下充入保护气体,反应后得到印迹聚合物；
（3）将印迹聚合物采用甲醛与乙酸的混合液进行提取，除去模板和杂质后，干燥后即得印迹HNTs；
（4）对印迹HNTs进行改性，然后进行若干次恒温洗涤后得到产物2；
具体步骤为：将印迹HNTs置于离心管中，依次使用水，水：丙酮体积比=3：7，水：丙酮体积比=5：5，水：丙酮体积比=7：3，丙酮，进行超声震荡洗涤，高速离心机进行离心，然后在常温下，加入N,N'-羰基二咪唑在印迹HNTs中，恒温超声震荡处理印迹HNTs表面2.5-5 h，离心分离液体；
（5）将磷酸盐缓冲溶液加入pH值=5.5-9.0的酯酶溶液中，混合搅匀后，加入产物2，再加入CoCl2,将所得悬浮液在2-10℃，超声震荡20-30h后，分离出生物轭合物，洗涤后添加猝化剂，再洗涤若干次后得到终产物，即埃洛石基印迹固载酶。
2.根据权利要求1所述的一种埃洛石基印迹固载酶的制备方法，其特征在于，步骤（1）中HNTs与HCl的质量体积比为0.5-3g：10mL。
3.根据权利要求1所述的一种埃洛石基印迹固载酶的制备方法，其特征在于，步骤（1）中烘干后产物、DMF、硅烷偶联剂的使用量0.5-3 g ：4mL：1mL。
4.根据权利要求1所述的一种埃洛石基印迹固载酶的制备方法，其特征在于，步骤（2）中邻苯二甲酸二甲酯、MMA、EDGMA的摩尔比为1-5 ：4：20，产物1与偶氮二异丁腈、邻苯二甲酸二甲酯的使用量为0.5g-8g ：20mg：1mmol。
5.根据权利要求1或4所述的一种埃洛石基印迹固载酶的制备方法，其特征在于，步骤（2）中升温至55-65℃搅拌。
6.根据权利要求1所述的一种埃洛石基印迹固载酶的制备方法，其特征在于，步骤（3）中甲醛与乙酸的体积比为3.5-4.5：1。
7.根据权利要求1所述的一种埃洛石基印迹固载酶的制备方法，其特征在于，步骤（4）采用N,N'-羰基二咪唑活化法对印迹HNTs进行改性。
8.根据权利要求1所述的一种埃洛石基印迹固载酶的制备方法，其特征在于，步骤（5）中CoCl2的摩尔体积为1 mol·m-3。
9.根据权利要求1或8所述的一种埃洛石基印迹固载酶的制备方法，其特征在于，酯酶的活性为0.1 u·mL-1-0.4 u·mL-1。
10.一种根据权利要求1-9中任一项所述的一种埃洛石基印迹固载酶的制备方法得到的埃洛石基印迹固载酶在环境污染物PAEs治理上的应用。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103613719A (zh) * 2013-10-25 2014-03-05 江苏大学 一种磁性埃洛石表面纳米印迹复合材料的可控制备方法
CN105080468A (zh) * 2015-08-19 2015-11-25 江苏大学 一种两步印迹法制备杂化的大孔分子印迹吸附剂的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103613719A (zh) * 2013-10-25 2014-03-05 江苏大学 一种磁性埃洛石表面纳米印迹复合材料的可控制备方法
CN105080468A (zh) * 2015-08-19 2015-11-25 江苏大学 一种两步印迹法制备杂化的大孔分子印迹吸附剂的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Properties and applications of halloysite nanotubes：recent research advances and future prospects;YUAN等;《Appl. Clay Sci》;20151231;全文 *
邻苯二甲酸二甲酯表面印迹微球的合成及吸附性能评价;张进等;《材料导报》;20130831;第27卷(第8期);第1.2节及图1 *

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