CN114524911B - 一种葡聚糖内切印迹模拟酶、制备方法及其应用 - Google Patents

一种葡聚糖内切印迹模拟酶、制备方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114524911B
CN114524911B CN202210066209.2A CN202210066209A CN114524911B CN 114524911 B CN114524911 B CN 114524911B CN 202210066209 A CN202210066209 A CN 202210066209A CN 114524911 B CN114524911 B CN 114524911B
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
preparation
mic
microspheres
drying
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210066209.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114524911A (zh
Inventor
李兆周
金久煜
于江晗
石婧怡
刘艳艳
牛华伟
陈秀金
王耀
高红丽
李芳�
侯志昀
于慧春
袁云霞
殷勇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henan University of Science and Technology
Original Assignee
Henan University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henan University of Science and Technology filed Critical Henan University of Science and Technology
Priority to CN202210066209.2A priority Critical patent/CN114524911B/zh
Publication of CN114524911A publication Critical patent/CN114524911A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114524911B publication Critical patent/CN114524911B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F292/00—Macromolecular compounds obtained by polymerising monomers on to inorganic materials
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J31/00—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds
    • B01J31/02—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds containing organic compounds or metal hydrides
    • B01J31/06—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds containing organic compounds or metal hydrides containing polymers
    • B01J31/069—Hybrid organic-inorganic polymers, e.g. silica derivatized with organic groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J9/00—Working-up of macromolecular substances to porous or cellular articles or materials; After-treatment thereof
    • C08J9/26—Working-up of macromolecular substances to porous or cellular articles or materials; After-treatment thereof by elimination of a solid phase from a macromolecular composition or article, e.g. leaching out
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2351/00—Characterised by the use of graft polymers in which the grafted component is obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds; Derivatives of such polymers
    • C08J2351/10—Characterised by the use of graft polymers in which the grafted component is obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds; Derivatives of such polymers grafted on to inorganic materials
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/54—Improvements relating to the production of bulk chemicals using solvents, e.g. supercritical solvents or ionic liquids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种葡聚糖内切印迹模拟酶、制备方法及其应用，属于新材料技术领域，本发明采用分子印迹技术，借鉴生物酶的催化过程和机理，基于生物源交联功能单体和可聚合离子液体，应用表面接枝共聚合法，在芳香硼酸化纳米硅胶微球表面仿生设计和构建高活性印迹模拟酶，通过高通量筛选，研制葡聚糖内切印迹酶。本发明的成果具有重要的理论价值和广阔的应用前景，所得仿生模拟酶可用于纤维素类物质的高效降解与回收利用，将产生显著的经济和生态效益，并为贯彻循环经济理念，推进资源节约型和环境友好型社会建设提供技术支撑。

Description

一种葡聚糖内切印迹模拟酶、制备方法及其应用
技术领域
本发明属于新材料技术领域，具体涉及一种葡聚糖内切印迹酶制备方法及其在纤维多糖类物质降解转化中的应用。
背景技术
随着现代工业的快速发展，对能源的需求日益增加。以不可再生的化石能源为主导的消费结构难以为继，生物质能的开发和大规模应用是解决人类未来能源需求的可行途径。植物每年储存的能量相当于全球主要燃料能耗的10倍，而生物质能的利用率还不到其总量的1%。纤维素的降解是纤维素生物质有效利用的关键环节。利用纤维素酶降解纤维素具有催化效率高、专一性强、反应条件温和及反应过程无污染等优点。但大多数天然纤维素酶的提纯困难、生产成本高、耐受性差、不易储存、难以回收和重复利用。通过对产酶菌株进行遗传改良虽然能在一定程度上提高酶的活性和产量，但幅度有限，难以彻底解决上述问题。
分子印迹技术（Molecular Imprinting Technology，MIT）的出现及其在抗体模拟方面取得的突破性进展为高效模拟酶的研究和开发提供了新的思路。MIT是从仿生学的角度，采用人工方法制备对模板分子具有专一性识别作用的聚合物制备技术。它的显著特点是具有构效的预定性、识别的特异性和制备的便捷性。应用MIT可以简便地获得特异性强、稳定性好和催化效率高的生物模拟物，即分子印迹模拟酶（Molecularly ImprintedCatalyst，MIC）。MIC内可以形成一个与模板分子在空间结构上完全匹配的三维空穴，具有可同生物酶相媲美的选择性识别能力，能够催化手性及区域选择性的反应。结合生物酶的催化过程和机理，基于MIT的特性，高保真设计和构建高活性模拟酶，已成为破解生物质能开发和应用难题最具前景的技术途径。目前，MIC在酯类水解、肽链水解、Diels-Alder环加成、消除、氧化和还原等反应中均显示了良好的催化作用。
在纤维素酶系中，葡聚糖内切酶是纤维素水解中的关键酶类，许多产酶菌株的产量较高，在纤维素降解和利用过程中起着重要作用，其活性区域结构和催化机制也较为明确。
发明内容
为了构建耐受性好、特异性强和催化效率高人工模拟酶，本发明通过对里氏木霉纤维素内切酶Ⅰ的活性中心进行分析，结合生物信息学手段，筛选出该酶的活性位点，设计相应生物源性交联功能单体，构建高活性MIC，并用于纤维素底物的生物转化与利用。
本发明采用的具体方案如下：
本发明的目的一在于提供一种葡聚糖内切印迹模拟酶的制备方法，包括以下步骤：
（1）生物源性交联功能单体的制备：
所述生物源性交联功能单体为甲基丙烯酸基氨基酸甲酯；
所述甲基丙烯酸基氨基酸甲酯的制备：在四口瓶中加入氨基醇、二氯甲烷和三乙胺，0 ℃下缓慢滴加甲基丙烯酰氯，搅拌后升温至25 ℃，采用薄层色谱法监测至反应完全，产物用乙酸乙酯、饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠水溶液萃取，所得有机相加入无水硫酸钠脱水干燥12 h，产物真空抽滤后，经旋转蒸发仪浓缩，置真空干燥箱40 ℃干燥至恒重，采用柱层析方法进行产物的分离和纯化；
（2）芳香硼酸化纳米硅胶微球的制备：
将10 g-20 g纳米级二氧化硅微球用50 mL-100 mL 浓度为20%的盐酸溶液回流反应6 h，8000 rpm离心分离，倾去上清，固体用去离子水洗涤至中性，150 ℃真空干燥至恒重，制备活化二氧化硅纳米微球；将所述活化二氧化硅微球1 g、3-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷750 µL、氨基苯硼酸0.5 g和三乙胺250 µL加入25 mL的无水乙醇中，90 ℃搅拌反应4 h，产物依次经1 mol/L碳酸氢钠和1 mol/L盐酸水溶液离心洗脱，最后用去离子水洗脱至上清液pH为中性，再用乙醇洗脱3次，将产物置真空干燥箱60 oC干燥至恒重，最后获得芳香硼酸化纳米硅胶微球；
（3）MIC微球的高通量制备：
在96孔板上进行MIC的高通量制备，将1 mmol的模板分子和交联功能单体、可聚合离子液体和N，N-亚甲基双丙烯酰胺溶于20 mL-100 mL pH 7的磷酸盐缓冲液中，超声混匀，与步骤（2）所得芳香硼酸化纳米硅胶微球的乙醇溶液混合，震荡混匀，在氮气的保护下加入10%过硫酸铵溶液和5% N，N，N'，N'-四甲基乙二胺溶液，将混合溶液取150 µL-200 µL置于96孔板的微孔中，密封后，25 ℃下引发聚合24 h，制得MIC微球；
所述交联功能单体的加入量为模板分子摩尔量的2-5倍，离子液体的加入量为模板分子摩尔量的2-5倍，N，N-亚甲基双丙烯酰胺的添加量为模板分子摩尔量的8-20倍；10%过硫酸铵溶液和5% N，N，N'，N'-四甲基乙二胺溶液的加入量分别为200 µL-300 µL和200 µL-500 µL；芳香硼酸化纳米硅胶微球的添加量为溶液总质量的5%-15%；
（4）MIC微球的洗脱：
将步骤（3）所得MIC微球经去离子水离心洗脱后除去未反应的组分，再用0.5 molL-1的氯化钠溶液反复洗脱，除去模板分子，直至洗脱液中无模板分子出现为止，制得葡聚糖内切印迹模拟酶。
作为对上述制备方法的进一步优化，步骤（1）中，所述氨基醇采用如下方法进行制备：在四口烧瓶中加入无水四氢呋喃，搅拌冷却至0 ℃，缓慢加入四氢铝锂，搅拌0.5 h-1 h后加入氨基酸，25 ℃下搅拌，采用薄层色谱法监控至反应完全后停止反应，将反应产物抽滤，滤液经旋转蒸发仪浓缩后，置真空干燥箱40 oC干燥至恒重，得氨基醇。
优选地，在氨基醇的制备中，所述氨基酸的种类为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸中的一种，且构型为L型。
优选地，在氨基醇的制备中，所述四氢呋喃的添加量为100 mL-200 mL，氨基酸的添加量为30 mmol-50 mmol，四氢铝锂的添加量为200 mmol-250 mmol。
作为对上述制备方法的进一步优化，步骤（1），在甲基丙烯酸基氨基酸甲酯的制备中，氨基醇的添加量为10 mmol-50 mmol，二氯甲烷的添加量为10 mL-50 mL，三乙胺的添加量为10 mL-50 mL，甲基丙烯酰氯的添加量为3 mL-10 mL；其中，乙酸乙酯萃取液的用量为每次15 mL-50 mL，连续萃取3次，合并有机层，有机层依次用10 mL-50 mL饱和碳酸氢钠和10 mL-50 mL饱和氯化钠水溶液液液萃取1次，最后用10 g-50 g无水硫酸钠脱水干燥12 h，所得产物干燥后，过3 cm*300 cm的硅胶层析柱，用v/v为3-8︰1的石油醚-乙酸乙混合溶剂进行淋洗，柱后液每5 min后收集1管，经薄层色谱检测后合并不同的样品管，浓缩后40 ℃真空干燥至恒重。
作为对上述制备方法的进一步优化，步骤（3）中，所用离子液体为1-乙烯基-3-乙基咪唑四氟硼酸盐、1-乙烯基-3-丁基咪唑四氟硼酸盐、1-乙烯基-3-乙基咪唑溴盐、1-乙烯基-3-丁基咪唑溴盐、1-烯丙基-3-乙烯基咪唑氯盐、1，6-己基-3，3’-二-1-乙烯基咪唑溴盐、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、1-乙烯基-3-乙基咪唑、3-（3-氨丙基）-1-乙烯基咪唑四氟硼酸盐、1-乙烯基-3-乙酸乙酯基咪唑氯盐、1-乙烯基-3-丁基咪唑氯盐、1-烯丙基-3-乙烯基咪唑氯盐和1-乙烯基-3-丁基咪唑六氟磷酸盐中的一种。
作为对上述制备方法的进一步优化，步骤（3）中，所述模板分子为麦芽糖、纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖和纤维五糖中的一种。
本发明的目的二在于提供采用上述制备方法制得的葡聚糖内切印迹模拟酶。
本发明的目的三在于提供所述葡聚糖内切印迹模拟酶在纤维素底物的生物转化与利用方面的应用。
本发明的目的四在于提供利用上述葡聚糖内切印迹模拟酶催化分解羧甲基纤维素的方法，所述方法的具体操作如下：以羧甲基纤维素为底物，将葡聚糖内切印迹模拟酶的MIC微球加入羧甲基纤维素溶液中，在pH值为4.5、反应温度为35 ℃条件下孵育0.5 h-24h；所述MIC微球的添加量为羧甲基纤维素溶液总质量的5%-15%；羧甲基纤维素溶液的浓度为5%-15%，体积为10 mL-50 mL。
本发明相比于现有技术，具有以下技术效果：
1. 与常规生物源性葡聚糖内切印迹酶相比，本发明的MIC能够在短时间内实现底物的温和、绿色和高效催化，具有操作简便、耐受性好和经济实用等特点。
2. 基于多种新型功能单体和离子液体的MIC能够实现多重识别，实现不同识别模式共存与协同，对底物及其类似物的识别效果更好，催化效率更高。
3. 本发明采用表面接枝共聚法制备MIC 微球，具有聚合效率高，分散性好，形态和规格均一，反应可控性强，模板分子易洗脱，结合容量高，识别效果好等优点。
4. 本发明与常规生物源性葡聚糖内切印迹酶相比，MIC具有稳定的理化性质，对极端环境耐受能力强，能够在常规条件下保存较长时间。
附图说明
图1是本发明中分子印迹模拟酶的制备技术流程图；
图2是利用本发明所述葡聚糖内切印迹模拟酶以纤维素为底物的催化分解示意图。
具体实施方式
本发明通过分析生物源葡聚糖内切酶的结构和活性机理，结合化学仿生学方法，构建高活性MIC，探索和推动生物质能的开发和应用新途径。本发明的成果具有重要的理论价值和广阔的应用前景，所得MIC作为一种高保真的仿生模拟酶，可用于纤维素及其结构类似物的降解与回收利用，将产生显著的经济和生态效益，并为贯彻循环经济理念，构建资源节约型和环境友好型社会提供有效支撑。
本发明采用分子印迹技术，借鉴生物酶的催化过程和机理，基于生物源交联功能单体和可聚合离子液体，应用表面接枝共聚合法，在芳香硼酸化纳米硅胶微球表面仿生设计和构建高活性印迹模拟酶，通过高通量筛选，研制葡聚糖内切印迹酶。
本发明采用接枝共聚法在硅胶微球表面进行印迹模拟酶的构建与识别。具体的制备步骤如下。
（1）生物源性交联功能单体的制备：
氨基醇的制备：在四口烧瓶中加入无水四氢呋喃，搅拌冷却至0 ℃，缓慢加入四氢铝锂，搅拌0.5 h-1 h后加入氨基酸，25 ℃下搅拌，采用薄层色谱法监控至反应完全后停止反应，将反应产物抽滤，滤液经旋转蒸发仪浓缩后，置真空干燥箱40 ℃干燥至恒重，得氨基醇。
甲基丙烯酸基氨基酸甲酯的制备：在四口瓶中加入氨基醇、二氯甲烷和三乙胺，0℃下缓慢滴加甲基丙烯酰氯，搅拌后升温至25℃，采用薄层色谱法监测至反应完全，产物用乙酸乙酯、饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠水溶液萃取，所得有机相加入无水硫酸钠脱水干燥12 h，产物真空抽滤后，经旋转蒸发仪浓缩，置真空干燥箱40 ℃干燥至恒重，采用柱层析方法进行产物的分离和纯化。
（2）芳香硼酸化纳米硅胶微球的制备：将10 g-20 g纳米级二氧化硅微球用50 mL-100 mL 浓度为20%的盐酸溶液回流反应6 h，8000 rpm离心分离，倾去上清，固体用去离子水洗涤至中性，150 ℃真空干燥至恒重，制备活化二氧化硅纳米微球。将活化二氧化硅微球（1 g）、3-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷（750 µL）、氨基苯硼酸（0.5 g）和三乙胺（250 µL）加入25 mL的无水乙醇中，90 ℃搅拌反应4 h，产物依次经1 mol/L碳酸氢钠和1 mol/L盐酸水溶液离心洗脱，最后用去离子水洗脱至上清液pH为中性，再用乙醇洗脱3次，将产物置真空干燥箱60 ℃干燥至恒重，最后获得芳香硼酸化纳米硅胶微球。
（3）MIC微球的高通量制备：在96孔板上进行MIC的高通量制备，将1 mmol的模板分子和一定比例的交联功能单体、可聚合离子液体和N，N-亚甲基双丙烯酰胺溶于20 mL-100mL pH 7的磷酸盐缓冲液中，超声混匀，与纳米硅胶微球的乙醇溶液混合，震荡混匀，在氮气的保护下加入10%过硫酸铵溶液和5% N，N，N'，N'-四甲基乙二胺溶液，将混合溶液取150 µL-200 µL置于96孔板的微孔中，密封后，25 ℃下引发聚合24 h。
（4）MIC微球的洗脱：所得MIC微球经去离子水离心洗脱后除去未反应的组分，再用0.5 mol L-1的氯化钠溶液反复洗脱，除去模板分子，直至洗脱液中无模板分子出现为止。空白微球的制备除不加模板分子外，方法同上。
（5）MIC微球催化活性分析
以羧甲基纤维素为底物，将MIC微球加入羧甲基纤维素溶液中，孵育0.5 h-24 h，分析不同反应温度、pH值和金属离子等条件下MIC的催化活性，计算米氏常数，了解催化动力学过程和特征。
所述步骤（1）中氨基酸的种类为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸中的一种，且构型为L型。
所述步骤（1）氨基醇的制备中四氢呋喃的添加量为100 mL-200 mL，氨基酸的添加量为30 mmol-50 mmol，四氢铝锂的添加量为200 mmol-250 mmol。
所述步骤（1）甲基丙烯酸基氨基酸甲酯的制备中氨基醇的添加量为10 mmol-50mmol，二氯甲烷的添加量为10 mL-50 mL，三乙胺的添加量为10 mL-50 mL，甲基丙烯酰氯的添加量为3 mL-10 mL。其中，乙酸乙酯萃取液的用量为每次15 mL-50 mL，连续萃取3次，合并有机层，有机层依次用10 mL-50 mL饱和碳酸氢钠和10 mL-50 mL饱和氯化钠水溶液液液萃取1次，最后用10 g-50 g无水硫酸钠脱水干燥12 h。所得产物干燥后，过硅胶层析柱（3cm*300 cm），用石油醚-乙酸乙混合溶剂（v/v，3-8︰1）进行淋洗，柱后液每5 min后收集1管，经薄层色谱检测后合并不同的样品管，浓缩后40 ℃真空干燥至恒重。
所述步骤（3）中所用离子液体为1-乙烯基-3-乙基咪唑四氟硼酸盐、1-乙烯基-3-丁基咪唑四氟硼酸盐、1-乙烯基-3-乙基咪唑溴盐、1-乙烯基-3-丁基咪唑溴盐、1-烯丙基-3-乙烯基咪唑氯盐、1，6-己基-3，3’-二-1-乙烯基咪唑溴盐、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、1-乙烯基-3-乙基咪唑、3-（3-氨丙基）-1-乙烯基咪唑四氟硼酸盐、1-乙烯基-3-乙酸乙酯基咪唑氯盐、1-乙烯基-3-丁基咪唑氯盐、1-烯丙基-3-乙烯基咪唑氯盐和1-乙烯基-3-丁基咪唑六氟磷酸盐中的一种。
所述步骤（3）中模板分子为麦芽糖、纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖和纤维五糖中的一种。交联功能单体的加入量为模板分子摩尔量的2-5倍，离子液体的加入量为模板分子摩尔量的2-5倍，N，N-亚甲基双丙烯酰胺的添加量为模板分子摩尔量的8-20倍。10%过硫酸铵溶液和5% N，N，N'，N'-四甲基乙二胺溶液的加入量分别为200 µL-300 µL和200 µL-500µL，纳米硅胶微球的添加量为溶液总质量的5%-15%。
所述步骤（5）中MIC微球的添加量为底物溶液总质量的5%-15%，羧甲基纤维素溶液的浓度为5%-15%，体积为10 mL-50 mL。
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
（1）生物源性交联功能单体的制备
缬氨醇的制备：在四口烧瓶中加入120 mL无水四氢呋喃，搅拌冷却至0 ℃，缓慢加入220 mmol四氢铝锂，搅拌0.5 h后加入30 mmol缬氨酸，25 ℃下搅拌，采用薄层色谱法监控至反应完全后停止反应，展开剂为甲醇-二氯甲烷混合溶剂（v/v，1︰2），将反应产物抽滤，滤液经旋转蒸发仪浓缩后，置真空干燥箱40 ℃干燥至恒重，得缬氨醇。
甲基丙烯酸基氨基酸甲酯的制备：在四口瓶中加入20 mmol缬氨醇、25 mL二氯甲烷和20 mL三乙胺，0 ℃下缓慢滴加4 mL甲基丙烯酰氯，搅拌后升温至25℃，采用薄层色谱法监测至反应完全，展开剂为石油醚-乙酸乙酯混合溶剂（v/v，10︰1），产物用20 mL乙酸乙酯连续萃取3次，合并有机相，依次用20 mL饱和碳酸氢钠和20 mL饱和氯化钠水溶液萃取1次，最后用20 g无水硫酸钠脱水干燥12 h。所得产物干燥后，过硅胶层析柱（3 cm*300 cm），用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂（v/v，4︰1）进行淋洗，柱后液每5 min后收集1管，经薄层色谱检测后合并不同的样品管，浓缩后40℃真空干燥至恒重。
（2）芳香硼酸化纳米硅胶微球的制备：将10 g纳米级二氧化硅微球用50 mL浓度为20%的盐酸溶液回流反应6 h，8000 rpm离心分离，倾去上清，固体用去离子水洗涤至中性，150 ℃真空干燥至恒重，制备活化二氧化硅纳米微球。将活化二氧化硅微球（1 g）、3-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷（750 µL）、氨基苯硼酸（0.5 g）和三乙胺（250 µL）加入25 mL的无水乙醇中，90 ℃搅拌反应4 h，产物依次经1 mol/L碳酸氢钠和1 mol/L盐酸水溶液离心洗脱，最后用去离子水洗脱至上清液pH为中性，再用乙醇洗脱3次，将产物置真空干燥箱60℃干燥至恒重，最后获得芳香硼酸化纳米硅胶微球。
（3）MIC微球的高通量制备：在96孔板上进行MIC的高通量制备，将1 mmol模板分子麦芽糖和2 mmol交联功能单体、2 mmol可聚合离子液体1-乙烯基-3-乙基咪唑四氟硼酸盐和10 mmol N，N-亚甲基双丙烯酰胺溶于30 mL pH 7的磷酸盐缓冲液中，超声混匀，加入纳米硅胶微球的乙醇溶液，加入量为溶液总质量的5%，震荡混匀后，在氮气的保护下加入200µL 10%过硫酸铵溶液和250 µL 5% N，N，N'，N'-四甲基乙二胺溶液，将混合溶液取150 µL置于96孔板的微孔中，密封后，25℃下引发聚合24 h。
（4）MIC微球的洗脱：所得MIC微球经去离子水离心洗脱后除去未反应的组分，再用0.5 mol L-1的氯化钠溶液反复洗脱，除去模板分子，直至洗脱液中无模板分子出现为止。空白微球的制备除不加模板分子外，方法同上。
（5）MIC微球催化活性分析：以羧甲基纤维素为底物，将MIC微球加入15 mL 5%的羧甲基纤维素溶液中，孵育1 h，MIC的添加量为底物溶液总质量10%，催化反应的pH值为4.5，反应温度为35 ℃，采用DNS法，测定反应前后还原糖的生成量，据此筛选测定模拟酶微球的催化性能，对还原糖生成量比较高的样本应用高效液相色谱-串联质谱方法进行确证分析，详细分析产物种类和反应体系的变化。结果显示酶活力为8.41 U mL-1，米氏常数为2.7 mgmL-1，对空白微球催化性能测定和分析结果显示，催化活性仅为印迹模拟酶的5%。
实施例2
（1）生物源性交联功能单体的制备：
酪氨醇的制备：在四口烧瓶中加入150 mL无水四氢呋喃，搅拌冷却至0 ℃，缓慢加入230 mmol四氢铝锂，搅拌40 min后加入40 mmol酪氨酸，25 ℃下搅拌，采用薄层色谱法监控至反应完全后停止反应，展开剂为甲醇-二氯甲烷混合溶剂（v/v，2︰1），将反应产物抽滤，滤液经旋转蒸发仪浓缩后，置真空干燥箱40 ℃干燥至恒重，得酪氨醇。
甲基丙烯酸基氨基酸甲酯的制备：在四口瓶中加入30 mmol酪氨醇、35 mL二氯甲烷和30 mL三乙胺，0 ℃下缓慢滴加6 mL甲基丙烯酰氯，搅拌后升温至25 ℃，采用薄层色谱法监测至反应完全，展开剂为石油醚-乙酸乙酯混合溶剂（v/v，7︰3），产物用30 mL乙酸乙酯连续萃取3次，合并有机相，依次用30 mL饱和碳酸氢钠和30 mL饱和氯化钠水溶液萃取1次，最后用35 g无水硫酸钠脱水干燥12 h。所得产物干燥后，过硅胶层析柱（3 cm*300 cm），用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂（v/v，6︰1）进行淋洗，柱后液每5 min后收集1管，经薄层色谱检测后合并不同的样品管，浓缩后40 ℃真空干燥至恒重。
（2）芳香硼酸化纳米硅胶微球的制备：将15 g纳米级二氧化硅微球用70 mL浓度为20%的盐酸溶液回流反应6 h，8000 rpm离心分离，倾去上清，固体用去离子水洗涤至中性，150 ℃真空干燥至恒重，制备活化二氧化硅纳米微球。其余步骤同实施例1，最后获得芳香硼酸化纳米硅胶微球。
（3）MIC微球的高通量制备：在96孔板上进行MIC的高通量制备，将1 mmol模板分子纤维二糖和3 mmol交联功能单体、3 mmol可聚合离子液体1-乙烯基-3-乙基咪唑溴盐和15mmol N，N-亚甲基双丙烯酰胺溶于50 mL pH 7的磷酸盐缓冲液中，超声混匀，加入纳米硅胶微球的乙醇溶液，加入量为溶液总质量的10%，震荡混匀后，在氮气的保护下加入250 µL10%过硫酸铵溶液和350 µL 5% N，N，N'，N'-四甲基乙二胺溶液，将混合溶液取150 µL置于96孔板的微孔中，密封后，25 ℃下引发聚合24 h。
（4）MIC微球的洗脱：方法同实施例1。
（5）MIC微球催化活性分析：以羧甲基纤维素为底物，将MIC微球加入15 mL 10%的羧甲基纤维素溶液中，孵育5 h，MIC的添加量为底物溶液总质量12%，催化反应的pH值为4.5，反应温度为35 ℃，采用DNS法，测定反应前后还原糖的生成量，据此筛选测定模拟酶微球的催化性能，对还原糖生成量比较高的样本应用高效液相色谱-串联质谱方法进行确证分析，详细分析产物种类和反应体系的变化。结果显示酶活力为11.23 U mL-1，米氏常数为3.8 mg mL-1，对空白微球催化性能测定和分析结果显示，催化活性仅为印迹模拟酶的7%。
实施例3
（1）生物源性交联功能单体的制备：
组氨醇的制备：在四口烧瓶中加入200 mL无水四氢呋喃，搅拌冷却至0 ℃，缓慢加入250 mmol四氢铝锂，搅拌50 min后加入50 mmol组氨酸，25 ℃下搅拌，采用薄层色谱法监控至反应完全后停止反应，展开剂为甲醇-二氯甲烷混合溶剂（v/v，4︰1），将反应产物抽滤，滤液经旋转蒸发仪浓缩后，置真空干燥箱40 ℃干燥至恒重，得组氨醇。
甲基丙烯酸基氨基酸甲酯的制备：在四口瓶中加入50 mmol组氨醇、45 mL二氯甲烷和40 mL三乙胺，0 ℃下缓慢滴加9 mL甲基丙烯酰氯，搅拌后升温至25 ℃，采用薄层色谱法监测至反应完全，展开剂为石油醚-乙酸乙酯混合溶剂（v/v，6︰4），产物用45 mL乙酸乙酯连续萃取3次，合并有机相，依次用45 mL饱和碳酸氢钠和45 mL饱和氯化钠水溶液萃取1次，最后用45 g无水硫酸钠脱水干燥12 h。所得产物干燥后，过硅胶层析柱（3 cm*300 cm），用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂（v/v，4︰1）进行淋洗，柱后液每5 min后收集1管，经薄层色谱检测后合并不同的样品管，浓缩后40 ℃真空干燥至恒重。
（2）芳香硼酸化纳米硅胶微球的制备：将20 g纳米级二氧化硅微球用90 mL浓度为20%的盐酸溶液回流反应6 h，8000 rpm离心分离，倾去上清，固体用去离子水洗涤至中性，150 ℃真空干燥至恒重，制备活化二氧化硅纳米微球。其余步骤同实施例1，最后获得芳香硼酸化纳米硅胶微球。
（3）MIC微球的高通量制备：在96孔板上进行MIC的高通量制备，将1 mmol模板分子纤维三糖和5 mmol交联功能单体、5 mmol可聚合离子液体1-乙烯基-3-丁基咪唑四氟硼酸盐和20 mmol N，N-亚甲基双丙烯酰胺溶于85 mL pH 7的磷酸盐缓冲液中，超声混匀，加入纳米硅胶微球的乙醇溶液，加入量为溶液总质量的15%，震荡混匀后，在氮气的保护下加入280 µL 10%过硫酸铵溶液和430 µL 5% N，N，N'，N'-四甲基乙二胺溶液，将混合溶液取150µL置于96孔板的微孔中，密封后，25 ℃下引发聚合24 h。
（4）MIC微球的洗脱：方法同实施例1。
（5）MIC微球催化活性分析：以羧甲基纤维素为底物，将MIC微球加入25 mL 15%的羧甲基纤维素溶液中，孵育3 h，MIC的添加量为底物溶液总质量15%，催化反应的pH值为4.5，反应温度为35 ℃，采用DNS法，测定反应前后还原糖的生成量，据此筛选测定模拟酶微球的催化性能，对还原糖生成量比较高的样本应用高效液相色谱-串联质谱方法进行确证分析，详细分析产物种类和反应体系的变化。结果显示酶活力为10.74 U mL-1，米氏常数为3.7 mg mL-1，对空白微球催化性能测定和分析结果显示，催化活性仅为印迹模拟酶的6%。
需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种葡聚糖内切印迹模拟酶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）生物源性交联功能单体的制备：
所述生物源性交联功能单体为甲基丙烯酸基氨基酸甲酯；
所述甲基丙烯酸基氨基酸甲酯的制备：在四口瓶中加入氨基醇、二氯甲烷和三乙胺，0℃下缓慢滴加甲基丙烯酰氯，搅拌后升温至25 ℃，采用薄层色谱法监测至反应完全，产物用乙酸乙酯、饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠水溶液萃取，所得有机相加入无水硫酸钠脱水干燥12 h，产物真空抽滤后，经旋转蒸发仪浓缩，置真空干燥箱40 ℃干燥至恒重，采用柱层析方法进行产物的分离和纯化；
（2）芳香硼酸化纳米硅胶微球的制备：
将10 g-20 g纳米级二氧化硅微球用50 mL-100 mL 浓度为20%的盐酸溶液回流反应6h，8000 rpm离心分离，倾去上清，固体用去离子水洗涤至中性，150 ℃真空干燥至恒重，制备活化二氧化硅纳米微球；将所述活化二氧化硅微球1 g、3-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷750 µL、氨基苯硼酸0.5 g和三乙胺250 µL加入25 mL的无水乙醇中，90 ℃搅拌反应4 h，产物依次经1 mol/L碳酸氢钠和1 mol/L盐酸水溶液离心洗脱，最后用去离子水洗脱至上清液pH为中性，再用乙醇洗脱3次，将产物置真空干燥箱60 oC干燥至恒重，最后获得芳香硼酸化纳米硅胶微球；
（3）MIC微球的高通量制备：
在96孔板上进行MIC的高通量制备，将1 mmol的模板分子和交联功能单体、可聚合离子液体和N，N-亚甲基双丙烯酰胺溶于20 mL-100 mL pH 7的磷酸盐缓冲液中，超声混匀，与步骤（2）所得芳香硼酸化纳米硅胶微球的乙醇溶液混合，震荡混匀，在氮气的保护下加入10%过硫酸铵溶液和5% N，N，N'，N'-四甲基乙二胺溶液，将混合溶液取150 µL-200 µL置于96孔板的微孔中，密封后，25 oC下引发聚合24 h，制得MIC微球；
所述模板分子为麦芽糖、纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖和纤维五糖中的任意一种，所述交联功能单体的加入量为模板分子摩尔量的2-5倍，离子液体的加入量为模板分子摩尔量的2-5倍，N，N-亚甲基双丙烯酰胺的添加量为模板分子摩尔量的8-20倍；10%过硫酸铵溶液和5% N，N，N'，N'-四甲基乙二胺溶液的加入量分别为200 µL-300 µL和200 µL-500 µL；芳香硼酸化纳米硅胶微球的添加量为溶液总质量的5%-15%；
（4）MIC微球的洗脱：
将步骤（3）所得MIC微球经去离子水离心洗脱后除去未反应的组分，再用0.5 mol L-1的氯化钠溶液反复洗脱，除去模板分子，直至洗脱液中无模板分子出现为止，制得葡聚糖内切印迹模拟酶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述氨基醇采用如下方法进行制备：在四口烧瓶中加入无水四氢呋喃，搅拌冷却至0 ℃，缓慢加入四氢铝锂，搅拌0.5h-1 h后加入氨基酸，25 oC下搅拌，采用薄层色谱法监控至反应完全后停止反应，将反应产物抽滤，滤液经旋转蒸发仪浓缩后，置真空干燥箱40 oC干燥至恒重，得氨基醇。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述氨基酸的种类为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸中的一种，且构型为L型。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述四氢呋喃的添加量为100 mL-200mL，氨基酸的添加量为30 mmol-50 mmol，四氢铝锂的添加量为200 mmol-250 mmol。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1），在甲基丙烯酸基氨基酸甲酯的制备中，氨基醇的添加量为10 mmol-50 mmol，二氯甲烷的添加量为10 mL-50 mL，三乙胺的添加量为10 mL-50 mL，甲基丙烯酰氯的添加量为3 mL-10 mL；其中，乙酸乙酯萃取液的用量为每次15 mL-50 mL，连续萃取3次，合并有机层，有机层依次用10 mL-50 mL饱和碳酸氢钠和10 mL-50 mL饱和氯化钠水溶液液液萃取1次，最后用10 g-50 g无水硫酸钠脱水干燥12 h，所得产物干燥后，过3 cm*300 cm的硅胶层析柱，用v/v为3-8︰1的石油醚-乙酸乙混合溶剂进行淋洗，柱后液每5 min后收集1管，经薄层色谱检测后合并不同的样品管，浓缩后40 oC真空干燥至恒重。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，所用离子液体为1-乙烯基-3-乙基咪唑四氟硼酸盐、1-乙烯基-3-丁基咪唑四氟硼酸盐、1-乙烯基-3-乙基咪唑溴盐、1-乙烯基-3-丁基咪唑溴盐、1-烯丙基-3-乙烯基咪唑氯盐、1，6-己基-3，3’-二-1-乙烯基咪唑溴盐、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、1-乙烯基-3-乙基咪唑、3-（3-氨丙基）-1-乙烯基咪唑四氟硼酸盐、1-乙烯基-3-乙酸乙酯基咪唑氯盐、1-乙烯基-3-丁基咪唑氯盐、1-烯丙基-3-乙烯基咪唑氯盐和1-乙烯基-3-丁基咪唑六氟磷酸盐中的一种。
7.采用权利要求1-6任意一种所述的制备方法制得的葡聚糖内切印迹模拟酶。
8.根据权利要求7所述的葡聚糖内切印迹模拟酶在纤维多糖类物质降解、转化及利用方面的应用。
9.利用权利要求7所述的葡聚糖内切印迹模拟酶催化分解羧甲基纤维素的方法，其特征在于：所述方法的具体操作如下：以羧甲基纤维素为底物，将葡聚糖内切印迹模拟酶的MIC微球加入羧甲基纤维素溶液中，在pH值为4.5、反应温度为35 ℃条件下孵育0.5 h-24h；所述MIC微球的添加量为羧甲基纤维素溶液总质量的5%-15%；羧甲基纤维素溶液的浓度为5%-15%，体积为10 mL-50 mL。
CN202210066209.2A 2022-01-20 2022-01-20 一种葡聚糖内切印迹模拟酶、制备方法及其应用 Active CN114524911B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210066209.2A CN114524911B (zh) 2022-01-20 2022-01-20 一种葡聚糖内切印迹模拟酶、制备方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210066209.2A CN114524911B (zh) 2022-01-20 2022-01-20 一种葡聚糖内切印迹模拟酶、制备方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114524911A CN114524911A (zh) 2022-05-24
CN114524911B true CN114524911B (zh) 2024-03-12

Family

ID=81620831

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210066209.2A Active CN114524911B (zh) 2022-01-20 2022-01-20 一种葡聚糖内切印迹模拟酶、制备方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114524911B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118005047B (zh) * 2024-04-09 2024-07-09 山东海天生物化工有限公司 一种降低小苏打总碱度的生产工艺

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101516448A (zh) * 2006-09-19 2009-08-26 巴斯夫欧洲公司 基于分子印迹聚合物的化妆品制剂
CN102439066A (zh) * 2009-03-25 2012-05-02 宾夕法尼亚大学董事会 用于纤维素水解的印迹仿生催化剂
CN104177547A (zh) * 2014-07-29 2014-12-03 江苏大学 一种纤维素复合多孔印迹吸附剂的制备方法
CN108929408A (zh) * 2018-07-20 2018-12-04 中北大学 一种甜菊糖印迹材料的制备方法及应用
CN110746559A (zh) * 2019-11-07 2020-02-04 东北林业大学 一种多孔碳基三嗪类分子印迹聚合物的制备方法及利用其对农产品中三嗪类农药萃取方法
CN111560365A (zh) * 2020-04-08 2020-08-21 浙江农林大学 一种碳纳米管基印迹固载酶的制备方法与应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015152964A1 (en) * 2014-03-31 2015-10-08 United Catalyst, LLC Catalyst for cellulose hydrolysis

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101516448A (zh) * 2006-09-19 2009-08-26 巴斯夫欧洲公司 基于分子印迹聚合物的化妆品制剂
CN102439066A (zh) * 2009-03-25 2012-05-02 宾夕法尼亚大学董事会 用于纤维素水解的印迹仿生催化剂
CN104177547A (zh) * 2014-07-29 2014-12-03 江苏大学 一种纤维素复合多孔印迹吸附剂的制备方法
CN108929408A (zh) * 2018-07-20 2018-12-04 中北大学 一种甜菊糖印迹材料的制备方法及应用
CN110746559A (zh) * 2019-11-07 2020-02-04 东北林业大学 一种多孔碳基三嗪类分子印迹聚合物的制备方法及利用其对农产品中三嗪类农药萃取方法
CN111560365A (zh) * 2020-04-08 2020-08-21 浙江农林大学 一种碳纳米管基印迹固载酶的制备方法与应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Molecular Imprinting: Synthesis of Polymer Particles with Antibody-like Binding Characteristics for Glucose Oxidase;Jun-ichi Anzai;Biochemical and Biophysical Research Communications;19961014;第227卷(第2期);419-422 *
Molecularly Imprinted Synthetic Glucosidase for the Hydrolysis of Cellulose in Aqueous and Nonaqueous Solutions;Xiaowei LI, 等;journal of the American Chemical Society;20210324;第143卷(第11期);5172-5181 *
分子印迹模拟酶的制备与应用研究;金东亮，等;化学通报;20190706;第82卷(第7期);579-584 *
葡聚糖内切印迹酶的构建及表征;金久煜;万方数据库;20230706;1-59 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114524911A (zh) 2022-05-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ahmed et al. Hydrolysis of cellulose using cellulase physically immobilized on highly stable zirconium based metal-organic frameworks
Limadinata et al. Temperature-responsive nanobiocatalysts with an upper critical solution temperature for high performance biotransformation and easy catalyst recycling: efficient hydrolysis of cellulose to glucose
CN107459656B (zh) 一种离子化共价有机框架材料及其制备方法和催化应用
Zhou et al. Development of functionalized metal–organic frameworks immobilized cellulase with enhanced tolerance of aqueous-ionic liquid media for in situ saccharification of bagasse
CN114524911B (zh) 一种葡聚糖内切印迹模拟酶、制备方法及其应用
CN107188849A (zh) 用于苯羟基化反应的介孔离子液体杂多酸盐催化剂及其制备方法和应用
CN114517308B (zh) 一种具有催化选择性的Bi-MOF材料电极及其制备方法
CN108855219A (zh) 一种蛋黄-蛋壳结构金属@空心共价有机框架笼复合材料及其制备和应用
CN112080484B (zh) 一种基于磁性COFs的固定化酶、合成方法及其在制备生物柴油中的应用
CN113318788A (zh) 一种Cu-NH2-MIL-125/TpPa-2复合材料的制备及光解水制氢
CN106008414A (zh) 5-羟甲基糠醛催化转移加氢制备2,5-二羟甲基呋喃的方法
CN106861754B (zh) 一种改性Pd/C直接催化碳水化合物制备2,5-二甲基呋喃的方法
CN106166499B (zh) 一种绿色溶剂体系中催化纤维素转化制备5-羟甲基糠醛的方法
Liu et al. Preparation of boronic acid and carboxyl‐modified molecularly imprinted polymer and application in a novel chromatography mediated hollow fiber membrane to selectively extract glucose from cellulose hydrolysis
CN107335472B (zh) 一种磁性氧化铁杂多酸催化剂及其合成方法
CN108435253A (zh) 一种C3N4载酸碱双功能MOFs基复合催化剂及其制备方法和用途
CN116162263B (zh) 一种醛基化木质素及其制备方法和应用
CN103464199B (zh) 氮参杂介孔炭-二氧化硅基强酸性多相离子液体催化材料的制备方法
CN116043591B (zh) 一种采用苯酚类低共熔溶剂分离木质纤维素的方法
CN115286665B (zh) 葡萄糖异构化制备果糖的方法
Zhao et al. Preparation of polyglycidylmethacrylate macropore beads and application in Candida species 99–125 lipase immobilization
CN109225321B (zh) 一种离子液体功能化的炭基固体酸催化剂、制备方法及其应用
Deng et al. One-pot synthesis of rod-like lignin@ zeolitic imidazolate framework-8 with enhanced immobilization of β-glucosidase
CN108727180A (zh) 一种表面胺化Sn-Beta分子筛催化糖类产乳酸的方法
CN104959116A (zh) 一种MOFs@纸浆纤维复合材料及其成型制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant