CN103361394B

CN103361394B - 利用微生物转化制备9α-羟基-雄烯二酮的方法

Info

Publication number: CN103361394B
Application number: CN201310342583.1A
Authority: CN
Inventors: 张保国; 魏长龙; 曾俊华; 王珊; 史吉平; 姜标
Original assignee: Shanghai Advanced Research Institute of CAS
Current assignee: Shanghai Advanced Research Institute of CAS
Priority date: 2013-08-07
Filing date: 2013-08-07
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2033-08-07
Also published as: CN103361394A

Abstract

本发明公开了一种利用微生物转化制备9α‑羟基‑雄烯二酮的方法，包括：1）将红平红球菌作为生产菌种，并接种于种子培养基中，培养，得种子；2）将种子接种于转化培养基中，培养，得发酵液；3）在发酵液中投入雄烯二酮溶液，继续培养，得到转化液，并检测转化液中的9α‑羟基‑雄烯二酮含量；4）分离和提取转化液中的9α‑羟基‑雄烯二酮。本发明的方法具有高效专一、环保、投料浓度高、转化率高、产物纯度高、收率高、成本低等优点，而且整个制备过程简单，经济实用，具有广泛的应用前景，而且对于扩展甾体原料药物雄烯二酮的用途有着非常重要的意义。

Description

利用微生物转化制备9α-羟基-雄烯二酮的方法

技术领域

本发明涉及一种制备9α-羟基-雄烯二酮的方法，特别是涉及一种利用微生物转化制备9α-羟基-雄烯二酮的方法。

背景技术

9α-羟基-雄烯二酮（9α-OH-AD）是一种抗动情甾体工业化生产中的关键中间产物，在甾体工业化生产中起着重要作用。利用9α-羟基-雄烯二酮作为前体物可以合成氢化可的松、17α-OH黄体酮、依普利酮、β米松、地塞米松、可的松、氟美松、氟孕酮、氟氢松、特美肤、曲安西龙等多做种重要的甾体原料药，具有重要的商业价值。制备9α-羟基-雄烯二酮的关键是在雄烯二酮第9位健上加一个羟基。目前，国内外大多采用化学合成法，但是化学合成法不仅合成步骤多、收率低，而且生产过程中需要用到多种有毒化学试剂，环境污染非常严重。

3-甾酮-9α羟基化酶是甾体微生物代谢的一个关键酶，该酶在微生物中广泛存在，例如：红球菌属Rhodococcus、诺卡氏菌属Nocardia、节杆菌属Arthrobacte、分枝杆菌属Mycobacterium。3-甾酮-9α羟基化酶负责在甾体的多元环的第九位上引入一个9α羟基。因此，利用具有9α羟基化酶活性的微生物转化雄烯二酮为9α-羟基-雄烯二酮已成为近年来人们研究的热点。Mutafov及同事研究了具有9α羟基化酶活性的红球菌(Rhodococcus sp.)菌株转化雄烯二酮生成9α-羟基-雄烯二酮的能力，发现其转化率仅为25%左右【Process Biochemistry32(7),585-589(1997)】；Kieslich等研究了利用Corynespora cassicola菌转化雄烯二酮为9α-羟基-雄烯二酮的方法，虽然其转化率提高到80%左右，但是其底物投料浓度不到1%（参考美国专利4237220A）；Marsheck等对Nocardia canicruria转化雄烯二酮为9α-羟基-雄烯二酮也进行了报道，其转化效率可达90%左右，但是其投料浓度也非常低，不到1%（参考美国专利4397947A）。

综上所述，利用微生物法转化雄烯二酮为9α-羟基-雄烯二酮所面临的主要问题是底物投料浓度低、生物转化效率低、产物总收率小、生产成本高等一系列问题。因此，开发一种简单高效、经济实用的9α-羟基-雄烯二酮的制备方法是当务之急。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用微生物转化制备9α-羟基-雄烯二酮的方法。通过该方法，能克服现有技术中的投料浓度低、转化时间长、生产成本高等缺点。

为解决上述技术问题，本发明的利用微生物转化制备9α-羟基-雄烯二酮的方法，包括步骤：

1）一级种子培养

将红平红球菌（Rhodococcus erythropolis）作为生产菌种，并接种于含碳源和氮源的种子培养基中，在150～350rpm转速下，26～35℃培养12～30h，得适于接种的种子；

2）二级发酵培养

将步骤1）所得种子接种于转化培养基中，在150～350rpm转速下，26～35℃培养12～30h，得发酵液；

3）底物雄烯二酮转化

在步骤2）所得的发酵液中投入雄烯二酮溶液，继续在150～350rpm转速下，26～35℃培养48～96h，得到转化液，并检测转化液中的9α-羟基-雄烯二酮含量；

4）分离和提取步骤3）所得的转化液中的9α-羟基-雄烯二酮。

所述步骤1）中，红平红球菌为红平红球菌ATCC14887；含碳源和氮源的种子培养基中，碳源选自葡萄糖、麦芽糖、甘油、可溶性淀粉或它们的组合，碳源的含量为0.5g/100mL～3g/100mL；氮源选自酵母膏、蛋白胨、玉米浆、大豆粉、蚕蛹粉或它们的组合，氮源的含量为1g/100mL～6g/100mL；种子培养基的pH优选范围为pH7.0～7.2。

所述步骤2）中，接种量为5～8vol%（体积百分比）；转化培养基的组分包括：碳源、氮源、无机盐和水；其中，碳源选自葡萄糖、麦芽糖、甘油、可溶性淀粉或它们的组合；碳源的含量为0.5g/100mL～3g/100mL；氮源选自酵母膏、蛋白胨、玉米浆、大豆粉、蚕蛹粉或它们的组合；氮源的含量为1g/100mL～6g/100mL；无机盐选自镁盐、磷酸盐、钠盐或它们的组合；无机盐的含量为0.001g/100mL～0.1g/100mL；镁盐包括：硫酸镁和氯化镁；磷酸盐包括：磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠；钠盐包括：氯化钠和硝酸钠。优选的转化培养基的配方为：水、葡萄糖0.5g/100mL～1.5g/100mL、蛋白胨0.2g/100mL～1g/100mL、玉米浆2.5g/100mL～5.0g/100mL、磷酸二氢钾0.02g/100mL～0.08g/100mL和硫酸镁0.01g/100mL～0.05g/100mL，pH为6.8～7.5。

所述步骤3）中，雄烯二酮溶液中的第一溶剂选自甲醇、DMSO（二甲基亚砜）、DMF（二甲基甲酰胺）或它们的组合；雄烯二酮的投入量为2.0～4.5%（即20～45g/L发酵液）；雄烯二酮溶液的投入方法为：用溶剂将雄烯二酮在80～90℃溶解后，在无菌条件下，投入至发酵液中；检测转化液中的9α-羟基-雄烯二酮含量的方法包括：通过薄层层析或高效液相色谱进行检测；另外，本步骤中，可以雄烯二酮转化成9α-羟基-雄烯二酮的转化率达到90%以上时作为转化终点。

所述步骤4）的具体步骤包括：

A、产品粗提

转化结束后，将转化液减压过滤，滤饼加入第二溶剂，加热回流至澄清；然后，过滤，保留滤液；

其中，第二溶剂包括：甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷或甲基异丁酮等；

另外，本步骤中的滤饼还能重复加入第二溶剂，以获得滤液，即滤饼还可重复以上步骤至滤液中基本没有产物，合并滤液备用；

B、脱色、结晶

在步骤A所得滤液中，加入相当于投料底物雄烯二酮10wt～15wt%（质量百分数）的活性碳，在55～105℃下搅拌脱色1～2h后，降至室温，过滤去除活性炭，得第一滤液，并用第二溶剂洗涤滤饼，得第二滤液（含第二溶剂的洗涤溶液），将第一滤液与第二滤液合并，然后，在40～60℃下减压浓缩、析晶、过滤、烘干，得9α-羟基-雄烯二酮（白色结晶产品）。

本发明中，底物雄烯二酮转化为9α-羟基-雄烯二酮的反应式如下：

本发明通过优化转化培养基成分及其他微生物转化参数，并通过底物雄烯二酮溶清投料方式，建了一种微生物转化制备雄烯二酮为9α-羟基-雄烯二酮的工艺方法。本发明的方法具有高效专一、环保、投料浓度高、转化率高（如90%以上）、产物9α-羟基-雄烯二酮的纯度高（如97%以上）、收率高、成本低等优点，而且整个制备过程简单（工艺简单），经济实用，具有广泛的应用前景，而且对于扩展甾体原料药物雄烯二酮的用途有着非常重要的意义。

具体实施方式

以下采用的试剂如未特别说明，均为商业化产品。

另外，以下实施例中涉及转化液中的9α-羟基-雄烯二酮的检测分析方法为HPLC法，其具体检测分析方法如下：

1、样品制备：取转化液1mL，加入等体积乙酸乙酯，震荡均匀后，放置分层。取上层有机相约800μL，用有机膜（0.4μm）过滤后供HPLC检测。

2、色谱条件

1）色谱柱：Inertsil ODS-3,4.6mm×250mm×5μm或等同；

2）流动相：甲醇与水的体积比=70:30

3）检测波长：240nm

4）流速：1.0mL/min

5）柱温：30℃

实施例1

（1）一级种子培养

一级种子培养基：蛋白胨0.5g/100mL，酵母膏1.3g/100mL～1.4g/100mL，葡萄糖1.2g/100mL，水，调pH至7.0-7.2，并灭菌。

取一接种环红平红球菌（Rhodococcus erythropolis）ATCC14887至20mL一级种子培养基中，在旋转式摇床200rpm转速下，30℃培养18h，得适于接种的种子。

（2）二级发酵培养

转化培养基：葡萄糖0.5g/100mL、蛋白胨0.2g/100mL、玉米浆2.5g/100mL、磷酸氢二钾0.02g/100mL、硫酸镁0.01g/100mL、水，初始pH为6.8，并灭菌。

将步骤（1）所得种子5mL接种于95mL转化培养基中【接种量为5%（V/V）】，在200rpm转速下，28℃震荡培养18h，得发酵液。

（3）底物雄烯二酮转化

在80℃下，用3mL甲醇溶清2g雄烯二酮，在无菌条件下，投入步骤（2）所得约100mL发酵液中，继续在200rpm转速下，28℃震荡培养48h，得到转化液。

其中，转化培养结束后，经HPLC测得的雄烯二酮的转化率（雄烯二酮转化为9α-羟基-雄烯二酮）为93.5%。

（4）产物分离提取

转化结束后，将转化液减压过滤，固形物滤饼加入30mL甲醇，80℃加热回流至澄清；然后，趁热过滤，保留滤液；滤饼再加入30mL甲醇重复以上步骤，经过3次甲醇回流萃取后，滤饼中基本没有产物，合并滤液。

在上述滤液中，加入3g活性碳，在60℃下搅拌脱色2h后，温度降至室温后，过滤去除活性炭，用10mL甲醇洗涤滤饼，合并甲醇溶液，然后，在40℃下减压浓缩甲醇、析晶、过滤、烘干，得到1.5g9α-羟基-雄烯二酮产品，经HPLC检测其纯度为97%，产品总收率为75%。

实施例2

（1）一级种子培养

步骤如同实施例1，但培养的条件改为：在旋转式摇床150rpm转速下，35℃培养12h。

（2）二级发酵培养

二级转化培养基：葡萄糖1g/100mL、蛋白胨0.6g/100mL、玉米浆3.5g/100mL、磷酸氢二钾0.06g/100mL、硫酸镁0.03g/100mL、水，初始pH为7.0，并灭菌。

将步骤（1）所得种子5mL接种于95mL转化培养基中【接种量为5%（V/V）】，在250rpm转速下，30℃震荡培养20h，得发酵液。

（3）底物雄烯二酮转化

在90℃下，用3mL甲醇溶清3.5g雄烯二酮，在无菌条件下，投入步骤（2）所得约100mL发酵液中，继续在250rpm转速下，30℃震荡培养56h，得到转化液。

其中，转化培养结束后，经HPLC测得的雄烯二酮的转化率（雄烯二酮转化为9α-羟基-雄烯二酮）为92.2%。

（4）产物分离提取

转化结束后，将转化液减压过滤，固形物滤饼加入30mL甲醇，80℃加热回流至澄清；然后，趁热过滤，保留滤液；滤饼再加入35mL甲醇重复以上步骤，经过3次甲醇回流萃取后，滤饼中基本没有产物，合并滤液。

在上述滤液中，加入4g活性碳，在70℃下搅拌脱色1.5h后，温度降至室温后，过滤去除活性炭，用10mL甲醇洗涤滤饼，合并甲醇溶液；在50℃下减压浓缩甲醇、析晶、过滤、烘干，得到2.74g9α-羟基-雄烯二酮产品，经HPLC检测其纯度为97.4%，产品总收率为78.2%。

实施例3

（1）一级种子培养

步骤如同实施例1，但培养的条件改为：在旋转式摇床180rpm转速下，26℃培养15h。

（2）二级发酵培养

二级转化培养基：葡萄糖1.5g/100mL、蛋白胨1g/100mL、玉米浆5.0g/100mL、磷酸氢二钾0.08g/100mL、硫酸镁0.05g/100mL、水，初始pH为7.5，并灭菌。

将步骤（1）所得种子5mL接种于95mL转化培养基中【接种量为5%（V/V）】，在280rpm转速下，32℃震荡培养16h，得发酵液。

（3）底物雄烯二酮转化

在85℃下，用5mL甲醇溶清4.5g雄烯二酮，在无菌条件下，投入步骤（2）所得约100mL发酵液中，继续在280rpm转速下，32℃震荡培养72h，得到转化液。

其中，转化培养结束后，经HPLC测得的雄烯二酮的转化率（雄烯二酮转化为9α-羟基-雄烯二酮）为90.5%。

（4）产物分离提取

转化结束后，将转化液减压过滤，固形物滤饼加入50mL丙酮，80℃加热回流至澄清；然后，趁热过滤，保留滤液；滤饼再加入50mL丙酮重复以上步骤，经过3次丙酮回流萃取后，滤饼中基本没有产物，合并滤液；

在上述滤液中，加入6g活性碳，在80℃下搅拌脱色2h后，温度降至室温后，过滤去除活性炭，用15mL丙酮洗涤滤饼，合并丙酮溶液；在60℃下减压浓缩丙酮、析晶、过滤、烘干，得到3.5g9α-羟基-雄烯二酮产品，经HPLC检测其纯度为97.8%，产品总收率为77.8%。

Claims

1.一种利用微生物转化制备9α-羟基-雄烯二酮的方法，其特征在于，包括步骤：

1)将红平红球菌作为生产菌种，并接种于含碳源和氮源的种子培养基中，在150～350rpm转速下，26～35℃培养12～30h，得适于接种的种子；

其中，红平红球菌为红平红球菌ATCC 14887；

2)将步骤1)所得种子接种于转化培养基中，在150～350rpm转速下，26～35℃培养12～30h，得发酵液；

所述转化培养基的配方为：水、葡萄糖0.5g/100mL～1.5g/100mL、蛋白胨0.2g/100mL～1g/100mL、玉米浆2.5g/100mL～5.0g/100mL、磷酸二氢钾0.02g/100mL～0.08g/100mL和硫酸镁0.01g/100mL～0.05g/100mL；

3)在步骤2)所得的发酵液中投入雄烯二酮溶液，继续在150～350rpm转速下，26～35℃培养48～96h，得到转化液，并检测转化液中的9α-羟基-雄烯二酮含量；

其中，雄烯二酮溶液中的第一溶剂选自甲醇、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺或它们的组合；

雄烯二酮的投入量为20～45g/L发酵液；

4)分离和提取步骤3)所得的转化液中的9α-羟基-雄烯二酮；

其中，步骤4)的具体步骤包括：

A、转化结束后，将转化液减压过滤，滤饼加入第二溶剂，加热回流至澄清；然后，过滤，保留滤液；

其中，第二溶剂包括：甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷或甲基异丁酮；

B、在步骤A所得滤液中，加入相当于投料底物雄烯二酮10wt～15wt％的活性碳，在55～105℃下搅拌脱色1～2h后，降至室温，过滤去除活性炭，得第一滤液，并用第二溶剂洗涤滤饼，得第二滤液，将第一滤液与第二滤液合并，然后，在40～60℃下减压浓缩、析晶、过滤、烘干，得9α-羟基-雄烯二酮。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，含碳源和氮源的种子培养基中，碳源为葡萄糖1.2g/100mL；氮源为蛋白胨0.5g/100mL，酵母膏1.3g/100mL～1.4g/100mL；种子培养基的pH为7.0～7.2。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，接种量为5～8vol％。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述转化培养基的pH为6.8～7.5。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，雄烯二酮的投入量为20～45g/L发酵液；雄烯二酮溶液的投入方法为：用溶剂将雄烯二酮在80～90℃溶解后，在无菌条件下，投入至发酵液中；

检测转化液中的9α-羟基-雄烯二酮含量的方法包括：通过薄层层析或高效液相色谱进行检测。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，以雄烯二酮转化成9α-羟基-雄烯二酮的转化率达到90％以上时作为转化终点。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤A中，滤饼还能重复加入第二溶剂，以获得滤液。