CN102618601B - 利用生物发酵和固定化酶法制备蔗糖-6-乙酯的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用生物发酵和固定化酶法制备蔗糖-6-乙酯的方法，工艺步骤为：对巨大芽胞杆菌的发酵培养基加以改进；对枯草杆菌进行诱导培养，提取特异性果糖基转移酶并制成固定化果糖基转移酶；将炭黑曲霉制成固定化增殖细胞；固定化增殖细胞和固定化果糖基转移酶一起以葡萄糖-6-乙酯和蔗糖为底物，将葡萄糖-6-乙酯转化为蔗糖-6-乙酯；最后用色谱分离树脂柱纯化蔗糖-6-乙酯。用本发明方法生产葡萄糖-6-乙酯，产量从15g/L发酵液提高到55g/L，提供了可以重复使用的固定化酶，蔗糖-6-乙酯的产率能够提升到80％左右，并以色谱分离树脂柱代替制备型高效液相色谱法来纯化蔗糖-6-乙酯，大幅降低了成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备三氯蔗糖关键中间体蔗糖-6-乙酯的方法，尤其涉及一种利用生物发酵和固定化酶法制备蔗糖-6-乙酯的方法。
背景技术
三氯蔗糖(Sucralose) , 是蔗糖的氯化衍生物，是迄今为止人类开发的最完美、最具竞争力、性能稳定、甜感好、安全性高的一种高强度非营养型甜味剂。
目前，三氯蔗糖的合成方法不外乎化学法和酶法两大类。就化学法来说，传统的全基团保护法缺点在于合成路线冗长，工艺流程复杂，导致产品成本较高。之后公开的单基团保护法明显缩短了合成路线，但对反应条件和分离设备提出了更高的要求。因此在化学法的基础上，又发展了合成三氯蔗糖的生物酶法。
早在1958年，Duff R.B.等［见Biochem. Journal （生物化学杂志）1958年70卷520-528页］就发现巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium NCIB 8508 可利用葡萄糖为原料合成葡萄糖-6-乙酯（glucose-6-acetate，缩写为g-6-a）。之后USP 4617269和Jones D.等［见Biotechnology and Bioengineering（生物技术与生物工程）1992年39卷第 2期203-210页 ］用生物法合成了三氯蔗糖，首先利用葡萄糖为原料，通过巨大芽胞杆菌的发酵作用合成葡萄糖-6-乙酯 ，随后在枯草杆菌Bacillus subtilis NCIB 11871分泌的特异果糖基转移酶催化作用下，转移蔗糖分子中的果糖基至g-6-a上生成蔗糖-6-乙酯（sucrose-6-acetate，缩写为s-6-a）。s-6-a再经传统的氯化、醇解就可获得三氯蔗糖。由于氯化、醇解工艺已经十分成熟，没有技术障碍，因此，合成三氯蔗糖的关键中间体是蔗糖-6-乙酯(s-6-a)，它的制备是合成三氯蔗糖的重要瓶颈。
酶法合成s-6-a的最大优点在于其高效专一性，可以省去大量有机溶剂，省去化学法的复杂工艺，是化学法不可比拟的，它具有广阔的应用前景。但现有的技术存在四个缺陷：一、产g-6-a的菌株对发酵合成g-6-a的效率太低（最高产量只有15g/L发酵液）。二、产果糖转移酶的枯草杆菌Bacillus subtilis NCIB 11871还处于专利保护期，不能随意用于商业化生产。三、利用枯草杆菌NCIB 11871产生的果糖转移酶是游离酶，只能一次性使用，利用率低；而且该酶将g-6-a转化为s-6-a时，由于受副产物葡萄糖的抑制，得率只有50％左右。四、s-6-a产品的分离纯化采用制备型高效液相色谱法，其设备投资和运行成本太高，无法应用于生产实际。
鉴于现有技术的上述缺陷，有必要提供一种加以改进的制备蔗糖-6-乙酯的生物学方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种利用生物发酵和固定化酶法制备蔗糖-6-乙酯（s-6-a）的方法。
本发明以如下技术方案解决上述技术问题：
本发明的利用生物发酵和固定化酶法制备蔗糖-6-乙酯的方法工艺步骤为：
⑴ 对巨大芽胞杆菌Bacillus megaterium NCIM 2087发酵葡萄糖的发酵培养基加以改进，增加培养基中葡萄糖的含量，并添加了乙酸钠和氯化钴成分；
⑵ 对枯草杆菌Bacillus subtilis CGMCC 1.1467进行诱导培养，提取特异性果糖基转移酶EC 2.4.1.162，制成固定化果糖基转移酶；
⑶ 将炭黑曲霉Aspergillus carbonarius CGMCC 3.879制成固定化增殖细胞；
⑷ 将炭黑曲霉制成的固定化增殖细胞和枯草杆菌产出的固定化果糖基转移酶一起，以葡萄糖-6-乙酯和蔗糖为底物，将葡萄糖-6-乙酯转化为蔗糖-6-乙酯；
⑸ 最后用DTF-01色谱分离、用树脂柱纯化蔗糖-6-乙酯，可以获得85%纯度产品。
步骤⑴所述的巨大芽胞杆菌发酵葡萄糖的发酵培养基的质量百分比组成为：葡萄糖4.0%~10.0%，酵母粉0.1%~0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.05%，七水硫酸镁 0.05%，磷酸氢二铵 0.1% ，氯化钾0.02% ，七水硫酸亚铁0.002%，三水乙酸钠0.001%~0.002%，六水氯化钴0.001%~0.002%，碳酸钙0.5%。
步骤⑵所述的对枯草杆菌进行诱导培养的培养基中含有质量百分比组成为：蔗糖4.0%~10.0%、酵母粉0.3%~0.5%、氯化钾0.05%~0.1% 和六水氯化钴0.001%~0.003%，于30~32℃、摇床转速170~190 r/min和pH为6.5~7.0的培养条件下培养26～35h获得菌体，按常规方法提取特异性果糖基转移酶，再以壳聚糖凝胶为载体，以戊二醛为交联剂，按常规化学交联法制成固定化果糖基转移酶。
步骤⑶所述的将炭黑曲霉制成固定化增殖细胞，是按CGMCC推荐的该菌株培养基和培养条件培养而获得菌体后，取25~28g 湿菌体与50mL 去离子水配制成菌体悬浮液，加入阳离子聚丙烯酰胺（PAM ）质量百分比为0.2%~ 0.4%水溶液200ml，搅拌2~ 3min，再加入质量百分比为3%~3.5%海藻酸钠水溶液200ml，用磁力搅拌器搅拌混合均匀，用多头造粒器向搅拌下的浓度为0.1~0.2 mol/L 的无菌CaCl2 溶液滴注，冰箱4 ℃下固化24 h, 制得直径2.5~3.5mm 的珠型固定化细胞, 然后用去离子水洗3~5 遍；在无菌条件下移入含有250 ml培养基的500 ml三角瓶中培养30~32 h ，使菌株进一步增殖，制成固定化增殖细胞。
步骤⑷所述的将炭黑曲霉的固定化增殖细胞和固定化果糖基转移酶一起，以葡萄糖-6-乙酯和蔗糖为底物，将葡萄糖-6-乙酯转化为蔗糖-6-乙酯，是在500 ml三角瓶中，加入pH=6.0~6.5的磷酸盐缓冲液200ml，加入蔗糖20克和葡萄糖-6-乙酯 10克，在180~200 r/min摇床转速下升温至30~32℃；然后加入128~150单位u的固定化果糖基转移酶，同时按质量比为1:20的配比加入固定化增殖细胞，以及1.5~2克食品级碳酸钙粉末；在30~32℃下反应，于10~30 h 时间段内每隔一定时间取出反应液50 μl，离心取上清液按第一步的HPLC色谱法检测底物和产物的含量；当蔗糖-6-乙酯的含量达到最高值后，停止反应，过滤，滤液旋转减压蒸发，真空干燥得到蔗糖-6-乙酯粗品。
步骤⑸所述的用DTF-01色谱分离用树脂柱纯化蔗糖-6-乙酯，以树脂为填料，该树脂用无盐水溶胀后，用1～1.5mol/L的盐酸浸泡2h，水洗至中性；再用1～1.5mol/L的NaOH浸泡2h，水洗至中性；再用1～1.5mol/L的CaCl2浸泡2h，水洗至中性；将水除去，用丙酮浸泡2h，将丙酮除去；用70%丙酮水溶液平衡，得到处理好的色谱分离树脂；色谱柱的径高比为1:33~1:38，湿法装柱，用70%丙酮水溶液为洗脱液；蔗糖-6-乙酯粗品用少量洗脱液溶解后上柱，加样量为5.0~6.0g，洗脱速度为1.0ml/min~1.5ml/min，洗脱液用分流器按30:1分流，其中30份用自动部分收集仪收集，1份连接HPLC跟踪测定流出液的ELSD 信号，并记录对应的流出液体积（ml）；收集HPLC跟踪显示含蔗糖-6-乙酯的流出液部分，旋转减压蒸去溶剂，真空干燥得到蔗糖-6-乙酯产品，纯度达到85%以上。
与现有的技术比较，本发明的优点是：
⑴由于对巨大芽胞杆菌Bacillus megaterium NCIM 2087发酵葡萄糖的发酵培养基的改进，菌株发酵葡萄糖生产葡萄糖-6-乙酯，产量从15g/L（发酵液）提高到55g/L。
⑵对枯草杆菌Bacillus subtilis CGMCC 1.1467进行诱导培养，代替受专利保护的Bacillus subtilis NCIB 11871，所生产的果糖基转移酶属于单糖专一性的果糖基转移酶（酶编号为EC 2.4.1.162），与Joan D.等（见Biotechnology and Bioengineering, 1992年39卷第 2期203-210页）报道的酶特性一致，但产酶菌株不同，更重要的是本发明将果糖基转移酶制成固定化酶，可以重复使用，提高了酶的使用率，可降低生产成本。本发明与毛多斌等(见《精细化工》2010年27卷第3期234-237页)所报道的米曲霉所产的果糖基转移酶不同，后者的酶编号为 EC 2.4.1.9，它要求大量的蔗糖参与反应，且易造成三糖、四糖等聚合产物，而本发明的产物只有s-6-a，没有三糖以上聚合物。
⑶本发明所用的炭黑曲霉Aspergillus carbonarius CGMCC 3.879是一株能同时产葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的菌株，当果糖基转移酶将蔗糖分子的果糖基转移到g-6-a而生成s-6-a时，副产物是葡萄糖，由于葡萄糖的抑制性竞争，影响了s-6-a的产率，所以在Joan D的报道中s-6-a的产率只有50%左右。而郑建仙等报道：“通过在反应体系中加入葡萄糖氧化酶来除去葡萄糖副产物以使反应正向进行，S-6-a 的得率也未增加。”（《冷饮与速冻食品工业》2002年8卷第3期7-16页），这是因为葡萄糖氧化酶在在氧化葡萄糖的过程中会产生H2O2，该体系中没有过氧化氢酶存在，所产生的H2O2很快会把葡萄糖氧化酶也杀灭掉，所以没有效果。本发明的反应体系中含有充足的过氧化氢酶，可以消除H2O2，保证葡萄糖氧化酶能把葡萄糖氧化成葡萄糖酸，在碳酸钙的存在下，生成葡萄糖酸钙沉淀，从体系中分离出来，因此，s-6-a的产率能够提升到80%左右。
⑷采用DTF-01色谱分离用树脂柱代替Joan D.报道的制备型高效液相色谱法来纯化s-6-a，并用HPLC跟踪测定流出液的ELSD 信号代替已公开的TLC法，具有投资成本和运行成本低廉、操作简便、分离高效的特点。
具体实施方式
本发明对巨大芽胞杆菌发酵葡萄糖的发酵培养基加以改进，使其生产g-6-a的产量从15g/L（发酵液）提高到55g/L；对枯草杆菌进行诱导培养，代替Bacillus subtilis NCIB 11871提取特异性果糖基转移酶（EC 2.4.1.162），制成固定化果糖基转移酶；将炭黑曲霉制成固定化增殖细胞；将固定化增殖细胞和固定化果糖基转移酶一起，以g-6-a和蔗糖为底物，将g-6-a转化为s-6-a；最后以DTF-01色谱分离用树脂柱代替制备型高效液相色谱法，纯化s-6-a，可以获得85%纯度的产品。
具体步骤如下：
第一步，改进培养基的组成，优化发酵条件，利用巨大芽孢杆菌菌株发酵葡萄糖生产葡萄糖- 6 -乙酯（g-6-a），提高产量。
出发菌株Bacillus megaterium NCIB 2087购于印度浦那国家化学实验室。
种子培养基：葡萄糖2~3 g, 蛋白胨1~1. 5 g , NaCl 0. 5g, 牛肉膏0. 05 g, 去离子水100 mL, pH 值7. 0。
改进发酵培养基的组成，通过提高葡萄糖的含量，添加适量乙酸钠和氯化钴等成分，可提高g-6-a的产量。该培养基的质量百分比组成为：葡萄糖4.0%~10.0%，酵母粉0.1%~0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.05%,，七水硫酸镁 0.05%,，磷酸氢二铵 0.1% ，氯化钾0.02% ，七水硫酸亚铁0.002%，三水乙酸钠0.001%~0.002%，六水氯化钴0.001%~0.002%，碳酸钙0.5%，用去离子水配制。
优化的培养条件为：28~30℃，摇床转速180~200 r/min，pH6.5~7.0。
巨大芽孢杆菌在上述以葡萄糖为主的发酵培养基中，于28~30℃、转速180～200 r/min的摇床中发酵4～7天。发酵液离心收集清液，旋转减压蒸发浓缩，真空干燥，用甲醇提取，提取液减压浓缩至干，得到g-6-a的粗提物。
g-6-a粗提物用色谱柱纯化：填料采用苏青DTF-01色谱分离用树脂，玻璃外壳的柱子，径高比为1:33~1:40，以70%甲醇水溶液为洗脱剂，洗脱速度为1.0 ml/min~1.5 ml/min。洗脱液用分流器按30:1分流，其中30份用自动部分收集仪收集，1份连接HPLC跟踪测定流出液的蒸发光散射检测器(ELSD )信号，并记录对应的流出液体积（ml）。收集HPLC跟踪显示只含g-6-a的流出液部分，旋转减压蒸发浓缩得g-6-a，经HPLC检测g-6-a含量后，供下一步制备s-6-a用。
用于检测葡萄糖、蔗糖、g-6-a和s-6-a含量的HPLC色谱法: 采用配置蒸发光散射检测器(ELSD)的HPLC系统，色谱条件为：Diamonsil C18柱，柱温25 ℃，流动相为乙腈/水（75:25,V / V），进样量10μL，以1 ml/min的流速，在蒸发光散射检测器于100℃下分析，氮气流速为2.5 ml/min。以葡萄糖、蔗糖、g-6-a和s-6-a的标准品（或对照品）定性，用峰面积归一化法作定量分析。
第二步，对枯草杆菌进行诱导培养，提取果糖基转移酶（fructosyltransferase，EC 2.4.1.162），并用化学交联法制备固定化果糖基转移酶。
出发菌株枯草杆菌Bacillus subtilis CGMCC 1.1467购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）。
斜面和种子培养基按CGMCC推荐的32号培养基，以葡萄糖为碳源，以蛋白胨、酵母提取物为氮源，以氯化钠为无机盐。对发酵培养基加以改进：蔗糖为碳源，酵母粉为氮源，氯化钾和氯化钴为无机盐。其组成质量百分比是：蔗糖4.0%~10.0%，酵母粉0.3%~0.5%，氯化钾0.05%~0.1% ，六水氯化钴0.001%~0.003%。试验证明，在蔗糖为碳源的培养基中，该菌株对果糖基转移酶有底物诱导物作用，能促进果糖基转移酶的分泌。
培养条件：30~32℃，摇床转速170~190 r/min，pH6.5~7.0。
上述提取果糖基转移酶的方法是：枯草杆菌菌株在上述发酵培养基培养26～35h获得菌体。发酵液用滤布过滤，洗涤，收集菌体，用超声波破碎仪破碎细胞，9000 r/min离心，去除细胞碎片，得到粗酶液。再用截留分子量30KD的超滤装置超滤粗酶液，浓缩液经HPLC测定酶活力后供固定化之用。
上述化学交联法制备固定化果糖基转移酶的方法，是以壳聚糖凝胶为载体，以戊二醛为交联剂，采用化学偶联法将果糖基转移酶固定在载体上。由于交联剂戊二醛带有两个醛基，而壳聚糖和酶蛋白分别含有氨基（-NH2），因此可以利用戊二醛与氨基的Schiff反应将壳聚糖和果糖基转移酶交联起来，达到固定化的目的。固定化操作是果糖基转移酶提取液经超滤浓缩后，用HPLC测定其酶活力，按每克载体需酶20～160u的比例，加入壳聚糖凝胶，混合，加入戊二醛使其终浓度为0.05～0.3%（质量百分比），在p H 6.0～7.0、25～40℃的条件下，交联反应4～12 h，充分洗涤，离心甩干，可得固定化果糖基转移酶，于0～5℃保存。
果糖基转移酶酶的酶活定义是：在40℃，pH6.0磷酸盐缓冲溶液条件下，每小时转化1 μmol的 g-6-a所需的酶质量为1个活力单位（u）。
第三步，将炭黑曲霉制成固定化增殖细胞。
出发菌株Aspergillus carbonarius CGMCC 3.879购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）。
种子培养基和发酵培养基：去离子水1000 g，葡萄糖30 g，硝酸钠3 g，蛋白胨5 g，七水硫酸镁0.5 g,氯化钾0.5 g，四水硫酸亚铁0.01 g，碳酸钙3 g。
发酵条件：菌种加入发酵培养基后， 在0～24小时内发酵温度为30~32℃，然后添加50g葡萄糖，在25～31小时内将发酵温度降至28℃。发酵结束后，收集菌丝体，并用水洗将可溶性无机盐和糖分洗去，置冰箱保存，供制备固定化细胞之用。
以上所述将将炭黑曲霉制成固定化增殖细胞的方法是：取阳离子聚丙烯酰胺(polyacrylamide，PAM)用去离子水配成质量百分数为0.2%~ 0.4% 的PAM溶液。取海藻酸钠用去离子水配制成质量百分数为3%~3.5%海藻酸钠溶液。取25~28g 湿菌体与50mL 去离子水配制成菌体悬浮液，加入上述 PAM溶液200ml，搅拌2~ 3min，再加入上述海藻酸钠溶液200ml，用磁力搅拌器搅拌混合均匀，用多头造粒器向搅拌下的浓度为0.1~0.2 mol/L 的无菌CaCl2 溶液滴注，冰箱4 ℃下固化24 h, 制得直径2.5~3.5mm 的珠型固定化细胞, 然后用去离子水洗3~5 遍。在无菌条件下移入含有250 ml上述发酵培养基的500 ml三角瓶中, 按上述发酵条件培养30~32 h ，使菌株进一步增殖，制成固定化增殖细胞。
第四步，固定化果糖基转移酶和固定化增殖细胞一起，以g-6-a和蔗糖为底物，将g-6-a转化为s-6-a。
在500 ml三角瓶中，加入pH=6.0~6.5的磷酸盐缓冲液200ml，加入蔗糖20克和g-6-a 10克，置于摇床中，在180~200 r/min转速下升温至30~32℃。然后加入128~150单位（u）的固定化果糖基转移酶，同时按质量比为1:20的配比加入固定化增殖细胞，以及1.5~2克食品级碳酸钙粉末。在30~32℃下反应，于10~30 h 时间段内每隔一定时间取出反应液50 μl，离心取上清液按第一步的HPLC色谱法检测底物和产物的含量。当s-6-a的含量达到最高值后，停止反应，用滤布抽滤，滤液旋转减压蒸发，真空干燥得到s-6-a粗品，供色谱树脂柱纯化s-6-a用，滤渣置冰箱保存供下次反应用。该固定化果糖基转移酶和固定化增殖细胞可以重复使用10次以上。
第五步，用DTF-01色谱分离用树脂柱纯化s-6-a产品。
以DTF-01色谱分离用树脂为填料，装于玻璃柱中制成色谱分离柱，并以70%丙酮水溶液为洗脱液，用自动部分收集器收集流出液，HPLC跟踪测定流出液的ELSD 信号，收集HPLC跟踪显示含s-6-a的流出液部分，可得到纯化的s-6-a。
树脂处理：用无盐水溶胀后的色谱分离用树脂，用1～1.5mol/L的盐酸浸泡2h，水洗至中性；再用1～1.5mol/L的NaOH浸泡2h，水洗至中性；再用1～1.5mol/L的CaCl2浸泡2h，水洗至中性。将水除去，用乙醇浸泡2h，将乙醇除去。用70%丙酮水溶液平衡，得到处理好的色谱分离树脂。
色谱柱的径高比为1:33~1:38，湿法装柱，并用洗脱液平衡。第四步所得s-6-a粗品用少量洗脱液溶解后上柱，加样量为5.0~6.0g，用70%丙酮水溶液洗脱，洗脱速度为1.0ml/min~1.5ml/min，洗脱液用分流器按30:1分流，其中30份用自动部分收集仪收集，1份连接HPLC跟踪测定流出液的ELSD 信号，并记录对应的流出液体积（ml）。收集HPLC跟踪显示含s-6-a的流出液部分，旋转减压蒸去溶剂，真空干燥得到s-6-a产品。不纯的部分，但尚含s-6-a的洗脱液经旋转减压蒸发浓缩后待下次继续上柱分离。
实施例1
1、葡萄糖- 6 -乙酯（g-6-a）的制备
出发菌株巨大芽孢杆菌菌株Bacillus megaterium NCIB 2087原购于印度浦那国家化学实验室。
发酵培养基：葡萄糖8%，酵母粉0.2%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.05%,，七水硫酸镁 0.05%,，磷酸氢二铵 0.1% ，氯化钾0.02% ，七水硫酸亚铁0.002%，三水乙酸钠0.0015%，六水氯化钴0.0012%，碳酸钙0.5%，用去离子水配制。培养条件： 30℃，摇床转速180r/min，pH7.0。
巨大芽孢杆菌菌株在上述以葡萄糖为主的发酵培养液中发酵，在30℃、转速180 r/min的摇床中发酵5天。发酵液离心收集清液，旋转减压蒸发浓缩，真空干燥，用甲醇提取，提取液减压浓缩至干，得到g-6-a的粗提物。g-6-a粗提物用苏青DTF-01色谱分离用树脂为填料的色谱柱纯化，径高比为1:33，以70%甲醇水溶液为洗脱剂，洗脱速度为1.0 ml/min。洗脱液用分流器按30:1分流，其中30份用自动部分收集仪收集，1份连接HPLC跟踪测定流出液的蒸发光散射检测器(ELSD )信号，并记录对应的流出液体积（ml）。收集HPLC跟踪显示只含g-6-a的流出液部分，旋转减压蒸发浓缩得g-6-a，经HPLC检测g-6-a含量后，供下一步制备s-6-a用。
2、果糖基转移酶的提取和固定化果糖基转移酶的制备：
枯草杆菌Bacillus subtilis CGMCC 1.1467在蔗糖为碳源的培养基中进行诱导培养：蔗糖4.0%，酵母粉0.4%，氯化钾0.06%，六水氯化钴0.001%。培养条件是30℃、摇床转速180 r/min、pH7.0。培养32～35h获得菌体。发酵液用滤布过滤，洗涤，收集菌体，用超声波破碎仪破碎细胞，9000 r/min离心，去除细胞碎片，得到粗酶液。再用截留分子量30KD的超滤装置超滤粗酶液，浓缩液经HPLC测定酶活力后按每克载体需酶160u的比例，加入壳聚糖凝胶，混合，加入戊二醛使其终浓度为0.03%，在p H7.0、25℃的条件下，交联反应5 h，充分洗涤，离心甩干，得固定化果糖基转移酶，于0～5℃保存。
3、炭黑曲霉A.carbonarius CGMCC 3.879制成固定化增殖细胞：
A.carbonarius CGMCC 3.87的发酵培养基：去离子水1000 g，葡萄糖30 g，硝酸钠3 g，蛋白胨5 g，七水硫酸镁0.5 g，氯化钾0.5 g，四水硫酸亚铁0.01 g，碳酸钙3 g。菌种加入上述发酵培养基后，在24h内发酵温度为30℃，然后添加50g葡萄糖， 24h以后将发酵温度降至28℃。发酵结束后，收集菌丝体，并用水洗将可溶性无机盐和糖分洗去，置冰箱备用。
取阳离子聚丙烯酰胺用去离子水配成质量百分比为0.25% 的PAM溶液。取海藻酸钠用去离子水配制成质量百分比为3%的海藻酸钠溶液。取25g 湿菌体与50mL 去离子水配制成菌体悬浮液，加入上述 PAM溶液200ml，搅拌2~ 3min，再加入上述海藻酸钠溶液200ml，用磁力搅拌器搅拌混合均匀，用多头造粒器向搅拌下的浓度为0.1mol/L 的无菌CaCl2 溶液滴注，冰箱4 ℃下固化24 h, 制得直径2.5~3.5mm 的珠型固定化细胞, 然后用去离子水洗5遍。在无菌条件下移入含有250 ml上述发酵培养基的500 ml三角瓶中, 按上述发酵条件培养30 h ，使菌株进一步增殖，制成固定化增殖细胞。
4、固定化果糖基转移酶和固定化增殖细胞一起，以g-6-a和蔗糖为底物，将g-6-a转化为s-6-a：
在500 ml三角瓶中，加入pH=6.0的磷酸盐缓冲液200ml，加入蔗糖20克和g-6-a 10克，置于摇床中，在180 r/min转速下升温至30℃。然后加入130单位（u）的固定化果糖基转移酶，同时按质量比为1:20的配比加入固定化增殖细胞，以及1.5克食品级碳酸钙粉末。在30℃下反应，于10~30 h 时间段内每隔一定时间取出反应液50 μl，离心取上清液按第一步的HPLC色谱法检测底物和产物的含量。当s-6-a的含量达到最高值后，停止反应，用滤布抽滤，滤液旋转减压蒸发，真空干燥得到s-6-a粗品。
5、用色谱树脂柱纯化s-6-a产品：
DTF-01色谱分离用树脂的处理：用无盐水溶胀后的，用1.0mol/L的盐酸浸泡2h，水洗至中性；再用1.0mol/L的NaOH浸泡2h，水洗至中性；再用1.0mol/L的CaCl2浸泡2h，水洗至中性。将水除去，用丙酮浸泡2h，将丙酮除去。用70%丙酮水溶液平衡，得到处理好的色谱分离树脂。
以DTF-01树脂为填料，装于玻璃柱中，径高比为1:33，湿法装柱，并用70%丙酮水溶液平衡。s-6-a粗品用少量70%丙酮水溶液溶解后上柱，加样量为5.0g，用70%丙酮水溶液洗脱，洗脱速度为1.0ml/min。洗脱液用分流器按30:1分流，其中30份用自动部分收集仪收集，1份连接HPLC跟踪测定流出液的ELSD 信号，并记录对应的流出液体积（ml）。收集HPLC跟踪显示含s-6-a的流出液部分，旋转减压蒸去溶剂，真空干燥得到s-6-a产品。不纯的部分，但尚含s-6-a的洗脱液经旋转减压蒸发浓缩后待下次继续上柱分离。
实施例2
1、葡萄糖- 6 -乙酯（g-6-a）的制备
出发菌株同实施例1。
发酵培养基：葡萄糖6%，酵母粉0.25%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.05%,，七水硫酸镁 0.05%,，磷酸氢二铵 0.1% ，氯化钾0.02% ，七水硫酸亚铁0.002%，三水乙酸钠0.0018%，六水氯化钴0.0012%，碳酸钙0.5%，用去离子水配制。培养条件： 31℃，摇床转速200r/min，pH7.0。
巨大芽孢杆菌菌株在上述以葡萄糖为主的发酵培养液中发酵，在31℃、转速200 r/min的摇床中发酵4天。发酵液离心收集清液，旋转减压蒸发浓缩，真空干燥，用甲醇提取，提取液减压浓缩至干，得到g-6-a粗提物。g-6-a粗提物用苏青DTF-01色谱分离用树脂为填料的色谱柱纯化，径高比为1:35，以70%甲醇水溶液为洗脱剂，洗脱速度为1.5ml/min。洗脱液用分流器按30:1分流，其中30份用自动部分收集仪收集，1份连接HPLC跟踪测定流出液的蒸发光散射检测器(ELSD )信号，并记录对应的流出液体积（ml）。收集HPLC跟踪显示只含g-6-a的流出液部分，旋转减压蒸发浓缩得g-6-a，经HPLC检测g-6-a含量后，供下一步制备s-6-a用。
2、果糖基转移酶的提取和固定化果糖基转移酶的制备
枯草杆菌B. subtilis CGMCC 1.1467在蔗糖为碳源的培养基中进行诱导培养：蔗糖5.0%，酵母粉0.35%，氯化钾0.06%，六水氯化钴0.001%。培养条件是31℃、摇床转速200 r/min、pH7.0。培养32h获得菌体。发酵液用滤布过滤，洗涤，收集菌体，用超声波破碎仪破碎细胞，9000 r/min离心，去除细胞碎片，得到粗酶液。再用截留分子量30KD的超滤装置超滤粗酶液，浓缩液经HPLC测定酶活力后按每克载体需酶150u的比例，加入壳聚糖凝胶，混合，加入戊二醛使其终浓度为0.05%，在p H6.8、20℃的条件下，交联反应5 h，充分洗涤，离心甩干，得固定化果糖基转移酶，于0～5℃保存。
3、炭黑曲霉A.carbonarius CGMCC 3.879制成固定化增殖细胞
炭黑曲霉的发酵培养基：去离子水1000g，葡萄糖35 g，硝酸钠3 g，蛋白胨5 g，七水硫酸镁0.5 g，氯化钾0.5 g，四水硫酸亚铁0.01 g，碳酸钙3 g。菌种加入上述发酵培养基后，在24h内发酵温度为31℃，然后添加50g葡萄糖， 24h以后将发酵温度降至29℃。发酵结束后，收集菌丝体，并用水洗将可溶性无机盐和糖分洗去，置冰箱备用。
取阳离子聚丙烯酰胺用去离子水配成质量百分比为0.3% 的PAM溶液。取海藻酸钠用去离子水配制成3.5%海藻酸钠溶液。取26g 湿菌体与50mL 去离子水配制成菌体悬浮液，加入上述 PAM溶液200ml，搅拌2~ 3min，再加入上述海藻酸钠溶液200ml，用磁力搅拌器搅拌混合均匀，用多头造粒器向搅拌下的浓度为0.2mol/L 的无菌CaCl2 溶液滴注，冰箱4 ℃下固化24 h, 制得直径2.5~3.5mm 的珠型固定化细胞, 然后用去离子水洗3 遍。在无菌条件下移入含有250 ml上述发酵培养基的500 ml三角瓶中, 按上述发酵条件培养32 h ，使菌株进一步增殖，制成固定化增殖细胞。
4、固定化果糖基转移酶和固定化增殖细胞一起，以g-6-a和蔗糖为底物，将g-6-a转化为s-6-a
在500 ml三角瓶中，加入pH=6.0的磷酸盐缓冲液200ml，加入蔗糖24克和g-6-a 10克，置于摇床中，在200 r/min转速下升温至30℃。然后加入150单位（u）的固定化果糖基转移酶，同时按质量比为1:20的配比加入固定化增殖细胞，以及2.0克食品级碳酸钙粉末。在30℃下反应，于10~30 h 时间段内每隔一定时间取出反应液50 μl，离心取上清液按第一步的HPLC色谱法检测底物和产物的含量。当s-6-a的含量达到最高值后，停止反应，用滤布抽滤，滤液旋转减压蒸发，真空干燥得到s-6-a粗品。
5、谱树脂柱纯化s-6-a产品
DTF-01色谱分离用树脂的处理：用无盐水溶胀后的，用1.5mol/L的盐酸浸泡2h，水洗至中性；再用1.5mol/L的NaOH浸泡2h，水洗至中性；再用1.5mol/L的CaCl2浸泡2h，水洗至中性。将水除去，用丙酮浸泡2h，将丙酮除去。用70%丙酮水溶液平衡，得到处理好的色谱分离树脂。
以DTF-01树脂为填料，装于玻璃柱中，径高比为1:35，湿法装柱，并用70%丙酮水溶液平衡。s-6-a粗品用少量70%丙酮水溶液溶解后上柱，加样量为5.2g，用70%丙酮水溶液洗脱，洗脱速度为1.2ml/min。洗脱液用分流器按30:1分流，其中30份用自动部分收集仪收集，1份连接HPLC跟踪测定流出液的ELSD 信号，并记录对应的流出液体积（ml）。收集HPLC跟踪显示含s-6-a的流出液部分，旋转减压蒸去溶剂，真空干燥得到s-6-a产品。
Claims (1)
1.一种利用生物发酵和固定化酶法制备蔗糖-6-乙酯的方法，其特征是工艺步骤为：
⑴对巨大芽胞杆菌Bacillus megaterium NCIM2087发酵葡萄糖的发酵培养基加以改进，增加培养基中葡萄糖的含量，并添加乙酸钠和氯化钴；巨大芽胞杆菌发酵葡萄糖的发酵培养基的质量百分比组成为：葡萄糖4.0%～10.0%，酵母粉0.1%～0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.05%，七水硫酸镁0.05%，磷酸氢二铵0.1%，氯化钾0.02%，七水硫酸亚铁0.002%，三水乙酸钠0.001%～0.002%，六水氯化钴0.001%～0.002%，碳酸钙0.5%；
⑵对枯草杆菌Bacillus subtilis CGMCC1.1467进行诱导培养，提取特异性果糖基转移酶EC2.4.1.162，并制成固定化果糖基转移酶；对枯草杆菌进行诱导培养的培养基中含有质量百分比组成为：蔗糖4.0%～10.0%、酵母粉0.3%～0.5%、氯化钾0.05%～0.1%和六水氯化钴0.001%～0.003%，于30～32℃、摇床转速170～190r/min和pH为6.5～7.0的培养条件下培养26～35h获得菌体，按常规方法提取特异性果糖基转移酶，再以壳聚糖凝胶为载体，以戊二醛为交联剂，按常规化学交联法制成固定化果糖基转移酶；
⑶将炭黑曲霉Aspergillus carbonarius CGMCC3.879制成固定化增殖细胞：该菌株按CGMCC推荐的培养基和培养条件培养而获得菌体后，取25～28g湿菌体与50mL去离子水配制成菌体悬浮液，加入阳离子聚丙烯酰胺PAM质量百分比为0.2%～0.4%水溶液200ml，搅拌2～3min，再加入质量百分比为3%～3.5%海藻酸钠水溶液200ml，用磁力搅拌器搅拌混合均匀，用多头造粒器向搅拌下的浓度为0.1～0.2mol/L的无菌CaCl2溶液滴注，冰箱4℃下固化24h,制得直径2.5～3.5mm的珠型固定化细胞,然后用去离子水洗3～5遍；在无菌条件下移入含有250ml培养基的500ml三角瓶中培养30～32h，使菌株进一步增殖，制成固定化增殖细胞；
⑷将炭黑曲霉制成的固定化增殖细胞和枯草杆菌产出的固定化果糖基转移酶一起，以葡萄糖-6-乙酯和蔗糖为底物，将葡萄糖-6-乙酯转化为蔗糖-6-乙酯：在500ml三角瓶中，加入pH=6.0～6.5的磷酸盐缓冲液200ml，加入蔗糖20克和葡萄糖-6-乙酯10克，在180～200r/min摇床转速下升温至30～32℃；然后加入128～150单位u的固定化果糖基转移酶，同时按质量比为1:20的配比加入固定化增殖细胞，以及1.5～2克食品级碳酸钙粉末；在30～32℃下反应，于10～30h时间段内每隔一定时间取出反应液50μl，离心取上清液按HPLC色谱法检测底物和产物的含量；当蔗糖-6-乙酯的含量达到最高值后，停止反应，过滤，滤液旋转减压蒸发，真空干燥得到蔗糖-6-乙酯粗品；
所述的用于检测的HPLC色谱法:采用配置蒸发光散射检测器ELSD的HPLC系统，色谱条件为：Diamonsil C18柱，柱温25℃，流动相为乙腈/水体积比为75:25，进样量10μL，以1ml/min的流速，在蒸发光散射检测器于100℃下分析，氮气流速为2.5ml/min；以标准品或对照品定性，用峰面积归一化法作定量分析；
⑸最后用DTF-01色谱分离用树脂柱纯化蔗糖-6-乙酯，获得85%纯度产品：以DTF-01树脂为填料，该树脂用无盐水溶胀后，用1～1.5mol/L的盐酸浸泡2h，水洗至中性；再用1～1.5mol/L的NaOH浸泡2h，水洗至中性；再用1～1.5mol/L的CaCl2浸泡2h，水洗至中性；将水除去，用丙酮浸泡2h，将丙酮除去；用70%丙酮水溶液平衡，得到处理好的色谱分离树脂；色谱柱的径高比为1:33～1:38，湿法装柱，用70%丙酮水溶液为洗脱液；蔗糖-6-乙酯粗品用少量洗脱液溶解后上柱，加样量为5.0～6.0g，洗脱速度为1.0ml/min～1.5ml/min，洗脱液用分流器按30:1分流，其中30份用自动部分收集仪收集，1份连接HPLC跟踪测定流出液的ELSD信号，并记录对应的流出液体积ml；收集HPLC跟踪显示含蔗糖-6-乙酯的流出液部分，旋转减压蒸去溶剂，真空干燥得到蔗糖-6-乙酯产品，纯度达到85%以上。
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