CN102115736B - 一种植物叶绿素酶的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物生物技术领域，公开了一种植物叶绿素酶的纯化方法。本发明以植物蛋白粗提液为材料，依次采用有机溶剂沉淀、离子交换色谱和非变性凝胶电泳方法，纯化叶绿素酶。利用本发明的植物叶绿素酶纯化方法，步骤简单、周期短、操作方便，克服了经典方法存在的步骤多、酶失活等缺陷。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物叶绿素酶的纯化方法，具体地，依次采用有机溶剂沉淀、离子交换层析和非变性凝胶电泳方法，简洁地从植物蛋白粗提液中分离得到纯化的叶绿素酶，属于植物生物技术领域。
背景技术
叶绿素酶(Chlorophyllase，EC 3.1.1.14)，催化叶绿素水解生成脱植醇叶绿素和植醇。1913年，Willstatter和Stoll首次报道了植物中存在叶绿素酶，其后，叶绿素酶的生理功能及其应用研究得到了迅速的发展，概括为：(1)叶绿素酶的生理功能；(2)细胞内分布；(3)酶的生化动力学特征；(4)基因克隆与诱导表达；(5)油脂加工的脱绿。
上述研究与应用的基础在于得到纯的叶绿素酶蛋白。目前，植物叶绿素酶的分离纯化主要是利用硫酸铵分级沉淀、疏水层析、离子交换、分子筛过滤等方法，过程复杂，酶收率低。例如Tsuchiya等(Tsuchiya T，et al.Purification and characterization of two isozymesof chlorophyllase from mature leaves of Chenopodium album.Plant CellPhysiology，1997，38(9)：1026-1031)在分离藜叶绿素酶的过程中采用硫酸铵沉淀、ToyopealHW-55疏水层析、Con A层析、Heparin层析、Mono Q离子交换色谱和Superdex 200分子筛过滤6步纯化，得到纯的叶绿素酶，但过多的纯化步骤，造成严重的酶活损失，仅Toyopeal HW-55一步，酶收率就降低了91.4％，最终收率只有0.24-0.51％。
Shioi等(Shioi Y，et al.A simple purification method for the preparation ofsolublized chlorophyllase from Chlorella protothecoides，AnalvticalBiochemistry，1980，105(1)：74-79)采用硫酸铵分级沉淀、Sepharose CL-6B和Sephadex G-200分子筛层析纯化小球藻的叶绿素酶，提高了酶的收率，简化了纯化程序，但是对于复杂的植物细胞体系，该方法所得酶的纯度达不到要求。
因此，改良植物叶绿素酶纯化的方法，简化纯化步骤，在保持酶活性的同时，达到纯度要求，具有一定的价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植物叶绿素酶的纯化方法，简化纯化步骤，在保持酶活性的同时达到叶绿素酶纯度的要求。
实现上述目的的技术方案如下：
(1)有机溶液沉淀
植物蛋白粗提液，在4℃下边搅拌边缓慢加入有机溶剂，有机溶剂可选用乙醇、甲醇或丙酮中的任一种，控制有机溶剂的体积比浓度为20-40％；随后10000-12000rpm离心沉淀，弃去上清液，向每1g沉淀中加入含有质量体积比浓度为0.24％的TritonX-100磷酸缓冲液(20mmol/L，pH7.0)10-15mL，于4℃下缓慢搅拌1h，随后10000-12000rpm离心，弃去沉淀，上清液即为酶液I。
(2)离子交换层析
将步骤(1)得到的酶液I上样于DEAE-Sephacel或DEAE-Sepharose CL-6B离子交换层析柱，然后用含有0-29.3g/L NaCl的磷酸缓冲液(20mmol/L，pH7.0)洗脱，收集具有叶绿素酶活性的组分，加入超滤浓缩离心管中，3000rpm，4℃离心，得到的浓缩液即为酶液II。
(3)非变性凝胶电泳
将步骤(2)中得到的酶液II与上样缓冲液(20mmol/L、pH6.8的Tris-HCl；质量体积比为10％的甘氨酸；质量体积比为0.1％的十二烷基磺酸钠)混合加样于丙烯酰胺质量浓度为5-6％的浓缩胶及丙烯酰胺质量浓度为12-14％的分离胶上，电泳。电泳后将分离胶每0.5cm横向割成条带，分别放入磷酸缓冲液(20mmol/L，pH7.0)中，37℃过夜浸出蛋白，收集有叶绿素酶活性的组分即为纯化的叶绿素酶液III。
上述酶的纯度可采用质量浓度为14％的丙烯酰胺，质量体积比为1％的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳缓冲液为25mmol/L Tris-甘氨酸(pH 8.3)，以考马斯亮蓝R-250染色，甲醇/冰醋酸/蒸馏水(1∶1∶8)脱色。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明依次采用有机溶剂沉淀、离子交换层析、非变性凝胶电泳方法纯化植物叶绿素酶，与现有的植物叶绿素酶纯化方法相比，纯化步骤少。将本发明纯化的酶液按所述检测方法检测，结果为单一条带，表明产物纯度高。
具体实施方式
实施例1
利用本发明的方法纯化银杏叶绿素酶，具体为：
(1)有机溶剂沉淀
将银杏叶蛋白粗提液在4℃下，边搅拌边缓慢加入丙酮，丙酮的体积百分比浓度为40％，10000rpm离心后倾去上清液，收集沉淀部分，向每1g沉淀加入含有质量体积比为0.24％的TritonX-100磷酸缓冲液(20mmol/L，pH7.0)10mL，于4℃下缓慢搅拌1h，随后10000rpm离心，收集上清液，弃去沉淀，上清液为银杏叶绿素酶液I；此步酶的回收率为20.5％。
(2)离子交换层析
将步骤(1)的酶液I上样于DEAE-Sephacel，用含14.6g/L NaCl的磷酸缓冲液(20mmol/L，pH7.0)洗脱，收集含有叶绿素酶活性的组分，加入超滤浓缩离心管中，3000rpm，4℃离心，得到浓缩液，浓缩液即为银杏叶绿素酶液II；此步酶的回收率为10.8％。
(3)非变性凝胶电泳
将步骤(2)中的酶液I I与上样缓冲液(20mmol/L、pH6.8的Tris-HCl；质量体积比为10％的甘氨酸；质量体积比为0.1％的十二烷基磺酸钠)混合加样于丙烯酰胺质量浓度为5％的浓缩胶和丙烯酰胺质量浓度为14％的分离胶上，电泳。电泳后将分离胶每0.5cm横向割成条带，分别放入磷酸缓冲液(20mmol/L，pH7.0)中37℃过夜浸出蛋白，收集合有叶绿素酶活性的组分即为纯化的银杏叶绿素酶液III，此步得到的叶绿素酶液III经质量浓度为14％的丙烯酰胺，质量体积比为1％的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为单一蛋白条带。
实施例2
与实施例1基本相同，其不同之处在于
使用的植物材料为菜椒；
步骤(1)中使用的有机溶剂为乙醇，体积百分比浓度为30％；
步骤(2)中的离子交换介质为DEAE-Sepharose CL-6B。
实施例3
与实施例1基本相同，其不同之处在于
使用的植物材料为豌豆叶；
步骤(3)中浓缩胶的丙烯酰胺质量浓度为6％，分离胶的丙烯酰胺质量浓度为12.5％。
Claims (3)
1.一种植物叶绿素酶的纯化方法，其特征在于，具体操作步骤如下：
(1)有机溶剂沉淀：植物蛋白粗提液，在4℃下边搅拌边缓慢加入有机溶剂，控制有机溶剂的体积比浓度为20-40％；随后10000-12000rpm离心沉淀，弃去上清液，向每1g沉淀中加入含有质量体积比浓度为0.24％TritonX-100的20mmol/L、pH7.0的磷酸缓冲液10-15mL，于4℃下缓慢搅拌1h，随后10000-12000rpm离心，弃去沉淀，上清液即为酶液I；
(2)离子交换层析：将步骤(1)得到的酶液I上样于离子交换层析柱，然后用含有0-29.3g/L NaCl的20mmol/L、pH7.0磷酸缓冲液洗脱，收集具有叶绿素酶活性的组分，加入超滤浓缩离心管中，3000rpm，4℃离心，得到的浓缩液即为酶液II；
(3)非变性凝胶电泳：将步骤(2)中得到的酶液II与含有20mmol/L、pH6.8的Tris-HCl、质量体积比为10％的甘氨酸、质量体积比为0.1％的十二烷基磺酸钠的上样缓冲液混合，加样于丙烯酰胺质量浓度为5-6％的浓缩胶及丙烯酰胺质量浓度为12-14％的分离胶上，电泳；电泳后将分离胶每0.5cm横向割成条带，分别放入20mmol/L、pH7.0磷酸缓冲液中，37℃过夜浸出蛋白，收集有叶绿素酶活性的组分即为纯化的叶绿素酶。
2.根据权利要求1所述植物叶绿素酶的纯化方法，其特征在于，有机溶剂选用丙酮、甲醇、乙醇中的任一种。
3.根据权利要求1所述植物叶绿素酶的纯化方法，其特征在于，所述离子交换介质为DEAE-Sephacel或DEAE-Sepharose CL-6B。
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| CN102115736A (zh) | 2011-07-06 |
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