CN101117641B

CN101117641B - 开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷的制备方法

Info

Publication number: CN101117641B
Application number: CN2007100123143A
Authority: CN
Inventors: 吴文忠; 张春枝; 徐维锋; 刘明; 李代; 王素馨; 刘毅; 王涛; 苟东凯
Original assignee: DALIAN INNOBIOACTIVES Co Ltd
Current assignee: Dalian promise biological Limited by Share Ltd
Priority date: 2007-07-27
Filing date: 2007-07-27
Publication date: 2011-05-11
Anticipated expiration: 2027-07-27
Also published as: CN101117641A

Abstract

本发明提供一种提高SDG产率的提取纯化方法，并且在此基础上建立SDG分级提取纯化方案。本发明的技术路线是在现有技术的基础上，在SDG提取纯化工艺中整合了微生物发酵、酶降解及无盐工艺的操作，大大提高了SDG的提取纯化效率，降低了生产成本。本发明还建立了SDG的分级纯化工艺，制备纯度分别为8～10％、20～40％、50～60％及90％的SDG产品。前两种产品不需柱层析分离，工艺操作简单安全，经济实用，适合工业化生产，可以满足功能食品配料和保健食品的需要；后两种产品技术成熟，工艺稳定，产品纯度高，可满足药理研究和药品开发的需要。

Description

开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷的制备方法

技术领域

本发明涉及从榨油后的亚麻籽皮或亚麻籽粕中提取及纯化开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷(SDG)的方法，尤其涉及微生物发酵及酶解的方法在该工艺过程中的应用。本发明还涉及一种分级纯化以获得期望浓度SDG产品的方法。

背景技术

开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷(Secoisolariciresinol Diglucoside，SDG)是木脂素的一种，是一类由苯丙素双分子聚合而成的天然成分，为一种天然植物雌激素。具有抗肿瘤生成作用、雌激素及抗雌激素效应、抗癌、抗动脉硬化、预防糖尿病、抑制芳香酶活性、抑制DNA和RNA合成、抗病毒、抗真菌等多种功效。在食品、临床医学和化妆品领域应用广泛。随着人类生活水平的提高和营养的变化，心血管疾病、癌症、糖尿病等与饮食习惯有关的疾病迅速上升，木脂素对预防与防治这一类疾病意义重大，同时化妆品也成为一大消费领域，以木脂素为主要原料的化妆品可以预防或治疗肌肤衰老。木脂素在亚麻籽中含量非常丰富，中国又是亚麻的生产大国，开发亚麻木脂素会产生巨大的经济和社会效益。

人类食物中木脂素的主要来源是谷物和其他富含纤维的产品，而亚麻籽是人和哺乳动物木脂素前体最丰富的来源。木脂素在谷物中的含量为2mg/kg～7mg/kg，而亚麻籽含木脂素为2mg/g～3mg/g，脱脂亚麻籽粕含木脂素为20mg/g。

从亚麻籽中提取分离SDG始于20世纪90年代，现代分离分析技术的发展为SDG的提取提供了多种可行的方案。现有技术中对SDG提取方法的改进多通过对新的分离技术、设备的应用来实现，比如应用超临界二氧化碳萃取及高效液相色谱(CN02803980.7，US5705618)。这些先进技术设备的应用可以实现高纯度SDG的制备，然而受处理量及经济条件的限制，这些方法在工业上的应用非常困难。

有研究表明，亚麻籽中的木脂素多以糖苷、低聚物的形式存在。工业生产中常常采用的是溶剂提取的方法，提取后往往需要将目的产物从其多种糖聚物中水解下来。水解方法则不尽一致，有酸性、碱性和水三种水解途径。碱催化的水解因其成本低廉，操作方便，效果显著得到广泛的应用，如专利US5705618所公开的技术方案，以碱催化的水解处理方法结合离子交换和C₁₈反相色谱串联纯化可得到质量百分含量为为90％的SDG产品。然而，现有技术中对催化用碱的选择以NaOH为主，虽然它廉价易得、使用方便，效果明显，但同时引入产品大量Na⁺。

考虑到现有技术中的上述问题，以及SDG仅仅在用于药理活性研究、药品开发或用作标准品时才需要高纯度产品，大部分用作功能食品配料、保健食品或化妆品添加剂的SDG产品对纯度要求并不高。因此，期望设计一种能提高SDG产率的提取纯化方法，并建立一套SDG分离纯化的系统方案，可以选择性地获得不同纯度的SDG产品。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高SDG产率的提取纯化方法，并且在此基础上建立SDG分级提取纯化方案。

本发明所述的SDG的制备方法包括现有技术中常用的溶剂提取和纯化的步骤，其特别之处在于在提取前加入对原料进行微生物发酵处理的步骤。

本发明的技术方案所采用的原料是含有SDG的植物原料，尤其是榨油残留的脱壳亚麻籽皮或亚麻籽粕。现有研究表明：亚麻籽中有大量的多糖类物质，这些是SDG分离过程中必须去除的成分之一。利用微生物发酵技术瓦解了植物细胞壁结构，使细胞内物质更容易溶出。同时微生物生长需要消耗糖类物质，因此，微生物发酵在提高SDG提取率的同时，为SDG的后续纯化奠定了基础。

发酵用微生物的选择可以选自霉菌、酵母菌和细菌中的一种或其中的2到3种微生物以任意比例组成的混合菌。鉴于对培养条件的有效控制，采用单一菌种发酵较多。以微生物的代谢能力及其对糖类物质的清除效力为标准，本领域的技术人员可以通过常用的微生物实验技术实现对微生物菌种的有效筛选以及发酵操作参数的确定。经过对多种微生物的考察，本发明的发明人发现：曲霉菌属的霉菌(Aspergillus)、酵母菌属的酵母菌(Saccharomyces)和芽孢杆菌属的细菌(Bacillus)均可有效地实现本发明的发明目的；所适宜的发酵温度为25～37℃，发酵时间24～72h。一般来讲，使用细菌发酵时，发酵温度较高；使用霉菌或酵母菌发酵时，适用温度较低。

具体来讲，上述SDG的制备方法包括如下具体步骤：

①以亚麻籽皮或亚麻籽粕为原料，采用低极性溶剂对原料脱脂，该低极性溶剂为石油醚、正己烷或6号溶剂；

②对脱脂后的原料进行微生物发酵处理：所使用的发酵微生物选自曲霉菌属霉菌(Aspergillus)、酵母菌属酵母菌(Saccharomyces)和芽孢杆菌属细菌(Bacillus)中的一种或其中的2到3种微生物以任意比例组成的混合菌，发酵温度25～37℃，发酵时间24～72h；

③提取：以体积百分比为50～70％的乙醇、甲醇、丙酮或二氧六环溶液为溶剂进行提取，每次提取加入原料体积5～8倍的溶剂，提取次数为2次以上，提取温度为20～60℃，提取时间为6～36h；

④提取物浓缩、干燥得SDG质量百分含量为8～10％的产品I。

上述步骤①中提到的6号溶剂为现成商品。

经过对比实验检测，采用微生物发酵处理可以将SDG粗品的提取率从7～10％提高至8～12％，SDG产品纯度由5～6％提高至8～10％，SDG平均收率从28～40％提高至43～80％。

对亚麻籽木脂素的研究表明：亚麻籽中的木脂素多以糖苷、低聚物的形式存在，提取物中还有大量的大分子物质存在，比如可溶性蛋白质、可溶性多糖，这些物质的存在会严重影响SDG的进一步纯化。为了进行有效的提取纯化，需要尽可能除去这些大分子物质，并且将目标产物从其多种糖聚物中水解下来。本发明解决这个问题所采用的技术方案是采用酶降解→酸沉淀→水洗涤→碱水解→中和→酶降解→干燥的操作流程。其中酶降解所用的酶选自果胶酶、纤维素酶、蛋白酶和蜗牛酶。

酶降解、酸沉淀及水洗涤的主要目的是去除亚麻籽提取物中含有的可溶性蛋白质、可溶性多糖(包括果胶、中等分子纤维素和淀粉)等大分子杂质。使用果胶酶、纤维素酶、蛋白酶、蜗牛酶等生物活性酶将上述杂质大分子降解为小分子物质，通过酸沉淀将亚麻籽提取物中主要以聚合状态存在的SDG沉淀下来，过滤得到含有大量SDG的滤饼，而上述酶降解后的小分子杂质则留在滤液中；继而通过水洗涤将滤饼中残留的小分子杂质尽量除去。本发明中，酶的优选使用量为降解原料质量的0.1～1％，优选反应条件包括：pH＝4～7，温度为40℃～50℃，反应时间2～4h。实验证明：技术路线图中若省掉酶降解过程，直接采用酸沉淀及以下工艺，所得SDG粗品纯度低于20％。

本发明中同样在产品纯化中整合了碱催化水解的步骤，水解用碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氧化钙。优选氢氧化钙或氧化钙。该工艺步骤的设计考虑了对产品中盐分的控制，降低Na⁺和Cl^-含量，即实现无盐工艺。现有技术中的碱催化水解常选用NaOH为催化剂，不可避免地引入Na⁺以及为中和碱而加入的酸根离子。本发明催化用碱选用氢氧化钙或氧化钙，并在中和时使用可与Ca⁺产生沉淀的酸，以除去Ca⁺而实现无盐。本发明中最常常选用的是磷酸，通过过滤去除生成的磷酸钙沉淀即可。

上述微生物发酵、酶降解以及水解用碱的选择三种操作的配合使用，将更有利于产品纯度、产率的提高。因此，本发明进一步要求保护整合了上述三种操作的SDG制备方法，具体来讲，该方法包括如下具体步骤：

④提取物浓缩；

⑤酶降解：所用的酶选自果胶酶、纤维素酶、蛋白酶和蜗牛酶，酶使用量为降解原料质量的0.1～1％，pH＝4～7，温度为40℃～50℃，反应时间2～4h；

⑥酸沉淀及水洗涤：沉淀用酸选自盐酸、硫酸和磷酸，pH＝1～3，静置8～24h后滤饼以水洗涤；

⑦滤饼碱水解：水解用碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氧化钙，碱用量为水解原料质量的5～20％，水解温度40℃～70℃，水解2～7h后加酸中和至pH＝6～7；然后过滤，滤饼水洗，采集滤液；

⑧酶降解：上述⑦所得滤液加入酶，所用的酶选自果胶酶、纤维素酶、蛋白酶和蜗牛酶，酶使用量为降解原料质量的0.1～1％，pH＝4～7，温度为40℃～50℃，反应时间2～4h；

⑨干燥得SDG质量百分含量为20～40％的产品II。

在上述技术路线中，已经阐述质量百分含量分别为8～10％及20～40％的SDG产品的制备方法，并且通过微生物发酵、酶降解、沉淀除盐等方法的综合应用有效地去除了产品中的多糖、盐等杂质，使进一步为了得到更高纯度的产品的操作仅需基于基本的技术和设备便可以有效进行，这些常用技术包括大孔树脂柱色谱、硅胶柱色谱、高效液相色谱等常用的分离纯化方法；减压浓缩等常用的常规的浓缩方法，以及常规的干燥方法比如冷冻干燥等。

本发明对后续的纯化步骤的设计是这样的：

第二次酶水解滤液上大孔吸附树脂柱吸附，体积浓度为10～60％的乙醇梯度洗脱，采集30～50％段洗脱液，减压浓缩，干燥得到质量百分含量为50～60％的SDG产品III。

SDG质量百分含量50～60％的SDG，上硅胶层析柱，氯仿—甲醇梯度洗脱，洗脱液减压浓缩，干燥，得质量百分含量为90％以上的SDG产品IV。从对现有技术的了解可知，进行到此步骤对原料的操作量已经非常小了，而现有技术中获得高纯度SDG的常规方法都可以在此处使用，比如液相制备色谱等。

对上述技术方案的整合处理，我们得到从亚麻籽中获得不同纯度SDG产品的分级纯化方案，该方案使用者可以根据所需产品的纯度要求选择纯化进行的程度。该方案的总的流程是这样的：

②对脱脂后的原料进行微生物发酵处理：所使用的发酵微生物选自霉菌、酵母菌和细菌中的一种或其中的2到3种微生物以任意比例组成的混合菌，发酵温度25～37℃，发酵时间24～72h；

④提取物浓缩；

⑤浓缩提取液加酶降解：所用的酶选自果胶酶、纤维素酶、蛋白酶和蜗牛酶，酶使用量为降解原料质量的0.1～1％，pH＝4～7，温度为40℃～50℃，反应时间2～4h；

⑦滤饼碱水解：水解用碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氧化钙，碱用量为水解原理质量的5～20％，水解温度40℃～70℃，水解2～7h后加酸中和至pH＝6～7；然后过滤，滤饼水洗，采集滤液；

⑨酶降解后滤液上大孔吸附树脂柱吸附，体积浓度为10～60％的乙醇梯度洗脱，洗脱液减压浓缩，干燥得到质量百分含量为50～60％的SDG产品III；

⑩质量百分含量为50～60％的SDG产品III上硅胶层析柱，氯仿—甲醇梯度洗脱，洗脱液减压浓缩，干燥，得质量百分含量为90％以上的SDG产品IV。

上述操作过程中，如果停止于步骤④，并将浓缩后的提取物干燥，得到质量百分含量为8～10％的SDG产品I；如果止步于步骤⑧，并将酶降解后的滤液干燥，可得到质量百分含量为20～40％的SDG产品II。

如无特殊说明，本发明中对SDG产品纯度的检测均采用HPLC法，检测条件为：

检测设备：Agilent 1100 series

色谱柱：Supelco C₁₈，250mm×4.6mm，5μm

检测波长：280nm

进样量：20μl

流速：1.2ml/min

洗脱溶剂：流动相A：0.1％醋酸水溶液

流动相B：乙腈

梯度洗脱：0min 90％A+10％B

20min 60％A+40％B

21min 10％A+90％B

26min 10％A+90％B

27min 90％A+10％B

37min 90％A+10％B

本发明引入了微生物发酵技术，大大提高了SDG的提取率，降低了生产成本；引入了酶水解技术，提高了纯化效率。并且建立了SDG的分级纯化工艺，提供纯度分别为8～10％、20～40％、50～60％及90％的SDG产品。前两种产品不需柱层析分离，工艺操作简单安全，经济实用，适合工业化生产，可以满足功能食品配料和保健食品的需要；后两种产品技术成熟，工艺稳定，产品纯度高，可满足药理研究和药品开发的需要。

附图说明

本发明附图1幅：

图1即本发明的技术路线示意图。

具体实施方式

实施例1：

将100kg脱脂亚麻籽饼加水润湿，接入酵母菌，25±1℃发酵48h；加入800L体积浓度为60％的乙醇溶液，60℃回流提取6h，同样方法提取2次，并以提取溶剂洗涤滤饼1次；回收溶剂，干燥得到SDG质量百分含量为9.5％的产品8.0kg；

对比组采取与上述完全相同的方法提取及干燥处理，但提取前不进行微生物发酵处理，最后得到SDG质量百分含量为5.3％的产品7.2kg。

实施例2：

将100kg脱脂亚麻籽饼加水润湿，接入芽孢杆菌，37±1℃发酵24h；加入800L体积浓度为70％的乙醇溶液，60℃回流提取6h，同样方法提取2次，并以提取溶剂洗涤滤饼1次；回收溶剂，干燥得到SDG质量百分含量为8.9％的产品8.8kg。

对比组采取与上述完全相同的方法提取及干燥处理，但提取前不进行微生物发酵处理，最后得到SDG质量百分含量为6.0％的产品8.0kg。

实施例3：

将100kg脱脂亚麻籽饼加水润湿，接入霉菌，28±1℃发酵48h；加入800L体积浓度为70％的乙醇溶液，60℃回流提取6h，同样方法提取2次，并以提取溶剂洗涤滤饼1次；回收溶剂，干燥得到SDG质量百分含量为9.8％的产品10.5kg。

对比组采取与上述完全相同的方法提取及干燥处理，但提取前不进行微生物发酵处理，最后得到SDG质量百分含量为5.5％的产品7.6kg。

实施例4：

将100kg脱脂亚麻籽饼加水润湿，接入酵母菌，27±1℃发酵72h；加入800L体积浓度为60％的乙醇溶液，60℃回流提取6h，同样方法提取2次，并以提取溶剂洗涤滤饼1次；回收溶剂，干燥得到SDG质量百分含量为9.5％的产品11.2kg。

对比组采取与上述完全相同的方法提取及干燥处理，但提取前不进行微生物发酵处理，最后得到SDG质量百分含量为5.1％的产品9.1kg。

实施例5：

本实施例中对SDG的提取步骤同实施例1，获得提取液后不经干燥，而是减压浓缩至40～50L；

向浓缩液中加入50g纤维素酶，40℃，pH＝5搅拌3h，加入浓盐酸至pH＝2，静置24h，过滤，滤饼用5倍水洗涤3次，过滤，得到的滤饼中包含目标成分SDG；向滤饼中加入0.1倍滤饼质量的氢氧化钠和5倍的水，在60℃搅拌4h后，加入磷酸中和至pH＝6～7，过滤，滤饼用水洗涤2次，合并滤液；滤液中加入8g纤维素酶，40℃，pH＝5搅拌3h，浓缩干燥得到产品692g，SDG纯度为30.8％。

对比组采取与上述相同的方法处理，但纯化过程去除两次酶降解的步骤，直接采用酸沉淀、水洗涤、碱水解及中和的处理流程，得到SDG纯度15.6％

实施例6：

向浓缩液中加入50g果胶酶，40℃，pH＝5搅拌3h，加入浓盐酸至pH＝2，静置24h，过滤，滤饼用5倍水洗涤3次，过滤，得到的滤饼中包含目标成分SDG；向滤饼中加入0.1倍滤饼质量的氢氧化钙和5倍水，在60℃搅拌4h，加入磷酸中和至pH＝6～7，过滤，滤饼用水洗涤2次，合并滤液；滤液加入8g果胶酶，40℃，pH＝5搅拌3h，浓缩干燥得到产品685g，SDG纯度为31.6％。

实施例7：

将5kg脱脂亚麻籽饼加水润湿，接入曲霉菌，27±1℃发酵24h；加入40L体积浓度为60％的乙醇溶液，60℃回流提取6h，同样方法提取2次，并以提取溶剂洗涤滤饼1次；回收溶剂，浓缩至2～3L；

向浓缩液中加入75g氢氧化钙，60℃搅拌4h，磷酸中和至pH＝6～7，过滤，滤饼用5倍水洗涤2次，合并滤液，滤液加入0.6g果胶酶，40℃，pH＝5搅拌3h。过滤后滤液上AB-8大孔吸附树脂柱，水洗除杂后，10～60％乙醇梯度洗脱。收集30～50％洗脱组分，回收溶剂，经干燥得到产品30.8g，SDG纯度为51.0％。

实施例8：

取10g按照实施例4方法得到的纯度为51％的SDG干法上硅胶柱，氯仿-甲醇梯度洗脱(氯仿∶甲醇为9.5∶1，9∶1，8.5∶1，8∶1，8∶2)，收集洗脱组分，回收溶剂，经干燥得到产品1.6g，SDG纯度为90.4％。

Claims

1.一种开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷的制备方法，包括提取和纯化的步骤，其特征在于：提取前对原料进行微生物发酵处理，该步所使用的发酵微生物选自曲霉菌属霉菌(Aspergillus)、酵母菌属酵母菌(Saccharomyces)和芽孢杆菌属细菌(Bacillus)。

2.根据权利要求1所述的开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷的制备方法，其特征在于该方法包括如下具体步骤：

②对脱脂后的原料进行微生物发酵处理：所使用的发酵微生物选自曲霉菌属霉菌(Aspergillus)、酵母菌属酵母菌(Saccharomyces)和芽孢杆菌属细菌(Bacillus)，发酵温度25～37℃，发酵时间24～72h；

④提取物浓缩、干燥得开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷质量百分含量为8～10％的产品I。

3.根据权利要求1所述的开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷的制备方法，其特征在于所述的纯化步骤包括酶降解→酸沉淀→水洗涤→碱水解→中和→酶降解→干燥的具体操作流程，其中酶降解所用的酶选自果胶酶、纤维素酶、蛋白酶和蜗牛酶。

4.根据权利要求2所述的开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷的制备方法，其特征在于所述的沉淀用酸选自盐酸、硫酸和磷酸，水解用碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氧化钙。

5.根据权利要求3所述的开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷的制备方法，其特征在于所述的沉淀用酸为磷酸，水解用碱为氢氧化钙或氧化钙。

6.根据权利要求3所述的开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷的制备方法，其特征在于该方法包括如下具体步骤：

④提取物浓缩；

⑨干燥得开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷质量百分含量为20～40％的产品II。

7.一种开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷的分级纯化方法，其特征在于该方法包括：

①第一级纯化：按照权利要求2的步骤①～④，制得开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷质量百分含量为8～10％的产品I；

②第二级纯化：按照权利要求2的步骤①～④操作，所得提取液浓缩后以所得浓缩液为原料进行权利要求6的步骤⑤～⑨操作，制得开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷质量百分含量为20～40％的产品II；

③第三级纯化：第二级纯化进行到权利要求6所述的步骤⑧，然后将酶解后产物通过大孔树脂柱层析分离，产物减压浓缩、干燥得到开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷质量百分含量为50～60％的产品III；

④第四级纯化：第三级纯化得到的产品再以硅胶柱层析进行分离，洗脱液减压浓缩、干燥得到开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷质量百分含量90％以上的产品IV。