CN103497258A - 小麦麸皮活性多糖的提取纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于小麦麸皮深加工技术领域，尤其涉及一种小麦麸皮活性多糖的提取纯化方法，其步骤包括：预处理、脱脂、多糖提取和粗多糖精制，最后对提取的粗品和纯化后组分的得率、化学组成以及免疫调节活性进行了分析。本发明小麦麸皮活性多糖的提取纯化方法，是利用水提醇沉法制得小麦麸皮多糖粗品，再利用琼脂糖凝胶柱纯化得到具有免疫调节活性的多糖，其提取方法简单，运行成本低，所得的小麦麸皮粗多糖其得率为5.0%，经过纯化小麦麸皮活性多糖其得率为5.6%，且具有较强的免疫调节活性。
Description
技术领域
本发明属于小麦麸皮深加工技术领域，尤其涉及一种小麦麸皮活性多糖的提取纯化方法。
背景技术
小麦麸皮是小麦制面粉过程中提取小麦粉和胚芽后的残留部分，是小麦面粉厂的主要加工副产品，以皮层为主(包括果皮、种皮、珠心层和糊粉层)，混入少量的胚芽和未剥刮干净的胚乳，通常占小麦重量的14%～19%，它含有非淀粉多糖、淀粉、脂肪、木质素、蛋白质、维生素、酚酸类化合物等多种成分。目前小麦麸皮除少许用于麦麸面筋、麦麸膳食纤维、木糖醇和阿魏酸提取外，主要用作饲料，经济效益不高，而小麦麸皮中非淀粉多糖含量约为46%，所以很有必要对从小麦麸皮中提取纯化多糖的方法进行研究，提高其经济利用价值。
经对现有技术的文献检索发现，中国专利CN200910237352.8公开了一种具有抗肿瘤与免疫调节活性的小麦麸皮多糖及其提取方法，它是以木聚糖酶酶解小麦麸皮，得到阿拉伯木聚糖(或称戊聚糖)为主的多糖产品，但利用酶提取成本高，不适合大规模生产应用，而且多糖没有经过纯化，粗品生物活性低。
发明内容
本发明旨在于克服现有技术的不足，提供了一种利用水提醇沉法制得小麦麸皮粗多糖，之后去除杂质，利用琼脂糖凝胶柱纯化得到具有免疫调节活性的小麦麸皮活性多糖的方法，提取方法简单，运行成本低，纯化得到的多糖生物活性高。
小麦麸皮活性多糖的提取纯化方法，步骤如下：
a、预处理：将小麦麸皮去除杂质后，55～65℃烘干，研磨至30～60目；
b、脱脂：
（1）乙醇脱脂：
将经a步骤处理的小麦麸皮粉浸入为其重量5～15倍、纯度为85%的乙醇中，在60～80℃加热回流搅拌1.5～3h，冷却至室温继续搅拌10～18h，去除液体，二次加入其重量5～15倍、纯度为85%的乙醇，室温搅拌3～7h，去除液体；
（2）丙酮脱脂：
将乙醇脱脂后的小麦麸皮中加入其重量2～8倍、纯度为99%的丙酮溶液，搅拌30min后去除液体，在室温自然挥发干燥12h，得到脱脂麸皮；
c、多糖提取：
将b步骤制得的脱脂麸皮加入其重量22～30倍的水，在70℃～90℃下加热回流搅拌2～6h，取其液体，在加热至50℃蒸发，至其浓缩为原体积的1/6～1/2止，再加入乙醇至乙醇浓度不低于75%，降温至3～6℃静置10～18h，后去除液体，在室温自然挥发干燥10～18h，制得小麦麸皮粗多糖；
d、小麦麸皮粗多糖精制：
（1）去蛋白：
将c步骤所得的小麦麸皮粗糖加入其重量8～20倍的水，再加入其体积份数为1/6～1/2的Sevage试剂，搅拌20min，去除下层液体及絮状沉淀物，在上层液体中加入乙醇至乙醇溶液浓度不小于75%，降温至3～6℃静置10～18h，去除液体，再分别用其重量25～45倍的无水乙醇、25～45倍的无水丙酮和25～45倍的无水乙醚逐次洗涤，再用0.45μm的滤膜过滤，将其沉淀物在自然挥发干燥10～18h，制得小麦麸皮去蛋白多糖；
（2）去低分子量杂质：
将（1）步骤所得的小麦麸皮去蛋白多糖溶于其重量8～20倍的水中，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，冻干制得除杂质小麦麸皮粗多糖；
（3）吸附纯化：
将（2）步骤得到的除杂质小麦麸皮粗多糖加入其重量为0.01～0.06倍的水、加热至60℃溶解，注入DEAE-琼脂糖凝胶柱中色谱分离，首先用蒸馏水控制流速1.5mL/min冲洗5h，再用0.5M NaCL以同样流速继续冲洗3h、同时开始收集解析液，2h后更换1.0M NaCL作为解析剂以同样的流速洗涤1小时以上，后停止收集，所得的收集液即为小麦麸皮活性多糖溶液；
（4）去盐：
将（3）步骤所得的小麦麸皮活性多糖溶液，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，冻干制得小麦麸皮活性多糖；
其中：Sevage是由氯仿和正丁醇按4～6∶1的体积比混合制成；
进一步优化小麦麸皮活性多糖的提取纯化方法，其步骤如下：
a、预处理：将小麦麸皮去除杂质后，60℃～65℃烘干，研磨至40～50目；
b、脱脂：
（1）乙醇脱脂：
将经a步骤处理的小麦麸皮粉浸入为其重量6～10倍、纯度为85%的乙醇中，在65℃～75℃加热回流搅拌2～2.5h，冷却至室温继续搅拌12～16h，去除液体，二次加入其重量10～13倍、纯度为85%的乙醇，室温搅拌4～6h，去除液体；
（2）丙酮脱脂：
将乙醇脱脂后的小麦麸皮中加入其重量3～6倍、纯度为99%的丙酮溶液，搅拌30min后去除液体，在室温自然挥发干燥12h，得到脱脂麸皮；
c、多糖提取：
将b步骤制得的脱脂麸皮加入其重量24～28倍的水，在80℃～90℃下加热回流搅拌3～5h，取其液体，在加热至50℃蒸发，至其浓缩为原体积的1/5～1/3止，再加入乙醇至乙醇浓度不低于75%，降温至4～5℃静置12～16h，后去除液体，在室温自然挥发干燥12h，制得小麦麸皮粗多糖；
d、小麦麸皮粗多糖精制：
（1）去蛋白：
将c步骤所得的小麦麸皮粗糖加入其重量10～15倍的水，再加入其体积份数为1/5～1/3的Sevage试剂，搅拌20min，去除下层液体及絮状沉淀物，在上层液体中加入乙醇至乙醇溶液浓度不小于75%，降温至4～5℃静置12～16h，去除液体，再分别用其重量30～40倍的无水乙醇、30～40倍的无水丙酮和30～40倍的无水乙醚逐次洗涤，再用0.45μm的滤膜过滤，将其沉淀物在自然挥发干燥12h，制得小麦麸皮去蛋白多糖；
（2）去低分子量杂质：
将（1）步骤所得的小麦麸皮去蛋白多糖溶于其重量10～20倍的水中，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，冻干制得除杂质小麦麸皮粗多糖；
（3）吸附纯化：
将（2）步骤得到的除杂质小麦麸皮粗多糖加入其重量为0.02～0.04倍的水、加热至60℃溶解，注入DEAE-琼脂糖凝胶柱中色谱分离，首先用蒸馏水控制流速1.5mL/min冲洗5h，再用0.5M NaCL以同样流速继续冲洗3h、同时开始收集解析液，2h后更换1.0M NaCL作为解析剂以同样的流速洗涤1小时，后停止收集，所得的收集液即为小麦麸皮活性多糖溶液；
（4）去盐：
将（3）步骤所得的小麦麸皮活性多糖溶液，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，冻干制得小麦麸皮活性多糖；
其中：Sevage是由氯仿和正丁醇按5～6∶1的体积比混合制成。
作为本发明的进一步优化，步骤c中，所述的待蒸发的液体为脱脂麸皮连续进行1次以上加热回流后合并的液体。
作为本发明的进一步优化，步骤d（1）中，所述的上层液体为2次以上经过加入Sevag试剂、搅拌并去除下层液体及絮状沉淀物后合并的液体。
本发明小麦麸皮活性多糖的提取纯化方法，是利用水提醇沉法制得小麦麸皮多糖粗品，再利用琼脂糖凝胶柱纯化得到具有免疫调节活性多糖的方法，提取方法简单，运行成本低，所得的小麦麸皮粗多糖其得率为5.0%，经过吸附纯化得到小麦麸皮活性多糖其得率为5.6%，具有较强的免疫调节活性。
附图说明
图1小麦麸皮粗多糖与小麦麸皮活性多糖激活巨噬细胞生产一氧化氮量；
图中，a,b,c代表同组内不同浓度处理间的差异性，相同字母表示无显著性差异，不同字母表示存在显著性差异（p<0.05）；
x,y,z代表不同组间相同浓度处理间的差异性，相同字母表示无显著性差异，不同字母表示存在显著性差异（p<0.05）。
具体实施方式
实施例1
小麦麸皮活性多糖的提取纯化方法，其进一步优化的操作步骤如下：
a、预处理：将小麦麸皮去除杂质后，60℃烘干，研磨至40～50目；
b、脱脂：
（1）乙醇脱脂：
将经a步骤处理的小麦麸皮粉浸入为其重量6倍、纯度为85%的乙醇中，在75℃加热回流搅拌2.5h，冷却至室温继续搅拌16h，去除液体，二次加入其重量10倍、纯度为85%的乙醇，室温搅拌6h，去除液体；
（2）丙酮脱脂：
将乙醇脱脂后的小麦麸皮中加入其重量3倍、纯度为99%的丙酮溶液，搅拌30min后去除液体，在室温自然挥发干燥12h，得到脱脂麸皮；
c、多糖提取：
将b步骤制得的脱脂麸皮加入其重量24倍的水，在90℃下加热回流搅拌3h，取其液体，在加热至50℃蒸发，至其浓缩为原体积的1/5～1/3止，再加入乙醇至乙醇浓度不低于75%，降温至5℃静置12h，后去除液体，在室温自然挥发干燥12h，制得小麦麸皮粗多糖；
d、小麦麸皮粗多糖精制：
（1）去蛋白：
将c步骤所得的小麦麸皮粗糖加入其重量15倍的水，再加入其体积份数为1/5～1/3的Sevage试剂，搅拌20min，去除下层液体及絮状沉淀物，在上层液体中加入乙醇至乙醇溶液浓度不小于75%，降温至4～5℃静置12h，去除液体，再分别用其重量30倍的无水乙醇、40倍的无水丙酮和40倍的无水乙醚逐次洗涤，再用0.45μm的滤膜过滤，将其沉淀物在自然挥发干燥12h，制得小麦麸皮去蛋白多糖；
（2）去低分子量杂质：
将（1）步骤所得的小麦麸皮去蛋白多糖溶于其重量20倍的水中，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，冻干制得除杂质小麦麸皮粗多糖；
（3）吸附纯化：
将（2）步骤得到的除杂质小麦麸皮粗多糖加入其重量为0.04倍的水、加热至60℃溶解，注入DEAE-琼脂糖凝胶柱中色谱分离，首先用蒸馏水控制流速1.5mL/min冲洗5h，再用0.5M NaCL以同样流速继续冲洗3h、同时开始收集解析液，2h后更换1.0M NaCL作为解析剂以同样的流速洗涤1小时以上，后停止收集，收集液即为小麦麸皮活性多糖溶液；
（4）去盐：
将（3）步骤所得的小麦麸皮活性多糖溶液，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，冻干制得小麦麸皮活性多糖。
实施例2
小麦麸皮活性多糖的提取纯化方法，其进一步优化的操作步骤如下：
a、预处理：将小麦麸皮去除杂质后， 65℃烘干，研磨至40～50目；
b、脱脂：
（1）乙醇脱脂：
将经a步骤处理的小麦麸皮粉浸入为其重量10倍、纯度为85%的乙醇中，在65℃加热回流搅拌2h，冷却至室温继续搅拌12h，去除液体，二次加入其重量13倍、纯度为85%的乙醇，室温搅拌4h，去除液体；
（2）丙酮脱脂：
将乙醇脱脂后的小麦麸皮中加入其重量6倍、纯度为99%的丙酮溶液，搅拌30min后去除液体，在室温自然挥发干燥12h，得到脱脂麸皮；
c、多糖提取：
将b步骤制得的脱脂麸皮加入其重量28倍的水，在80℃下加热回流搅拌5h，取其液体，在加热至50℃蒸发，至其浓缩为原体积的1/5～1/3止，再加入乙醇至乙醇浓度不低于75%，降温至4℃静置16h，后去除液体，在室温自然挥发干燥12h，制得小麦麸皮粗多糖；
d、小麦麸皮粗多糖精制：
（1）去蛋白：
将c步骤所得的小麦麸皮粗糖加入其重量10倍的水，再加入其体积份数为1/5～1/3的Sevage试剂，搅拌20min，去除下层液体及絮状沉淀物，在上层液体中加入乙醇至乙醇溶液浓度不小于75%，降温至4～5℃静置16h，去除液体，再分别用其重量40倍的无水乙醇、30倍的无水丙酮和30倍的无水乙醚逐次洗涤，再用0.45μm的滤膜过滤，将其沉淀物在自然挥发干燥12h，制得小麦麸皮去蛋白多糖；
（2）去低分子量杂质：
将（1）步骤所得的小麦麸皮去蛋白多糖溶于其重量20倍的水中，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，冻干制得除杂质小麦麸皮粗多糖；
（3）吸附纯化：
将（2）步骤得到的除杂质小麦麸皮粗多糖加入其重量为0.02倍的水、加热至60℃溶解，注入DEAE-琼脂糖凝胶柱中色谱分离，首先用蒸馏水控制流速1.5mL/min冲洗5h，再用0.5M NaCL以同样流速继续冲洗3h、同时开始收集解析液，2h后更换1.0M NaCL作为解析剂以同样的流速洗涤1小时以上，后停止收集，收集液即为小麦麸皮活性多糖溶液；
（4）去盐：
将（3）步骤所得的小麦麸皮活性多糖溶液，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，冻干制得小麦麸皮活性多糖。
实施例3
小麦麸皮活性多糖的提取纯化方法，其进一步优化的操作步骤如下：
a、预处理：将小麦麸皮去除杂质后，60℃～65℃烘干，研磨至40～50目；
b、脱脂：
（1）乙醇脱脂：
将经a步骤处理的小麦麸皮粉浸入为其重量8倍、纯度为85%的乙醇中，在68℃～72℃加热回流搅拌2.3h，冷却至室温继续搅拌14h，去除液体，二次加入其重量12倍、纯度为85%的乙醇，室温搅拌5h，去除液体；
（2）丙酮脱脂：
将乙醇脱脂后的小麦麸皮中加入其重量5倍、纯度为99%的丙酮溶液，搅拌30min后去除液体，在室温自然挥发干燥12h，得到脱脂麸皮；
c、多糖提取：
将b步骤制得的脱脂麸皮加入其重量26倍的水，在80℃～90℃下加热回流搅拌4h，取其液体，在加热至50℃蒸发，至其浓缩为原体积的1/5～1/3止，再加入乙醇至乙醇浓度不低于75%，降温至5℃静置14h，后去除液体，在室温自然挥发干燥12h，制得小麦麸皮粗多糖；
d、小麦麸皮粗多糖精制：
（1）去蛋白：
将c步骤所得的小麦麸皮粗糖加入其重量12倍的水，再加入其体积份数为1/5～1/3的Sevage试剂，搅拌20min，去除下层液体及絮状沉淀物，在上层液体中加入乙醇至乙醇溶液浓度不小于75%，降温至5℃静置14h，去除液体，再分别用其重量35倍的无水乙醇、35倍的无水丙酮和35倍的无水乙醚逐次洗涤，再用0.45μm的滤膜过滤，将其沉淀物在自然挥发干燥12h，制得小麦麸皮去蛋白多糖；
（2）去低分子量杂质：
将（1）步骤所得的小麦麸皮去蛋白多糖溶于其重量15倍的水中，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，冻干制得除杂质小麦麸皮粗多糖；
（3）吸附纯化：
将（2）步骤得到的除杂质小麦麸皮粗多糖加入其重量为0.03倍的水、加热至60℃溶解，注入DEAE-琼脂糖凝胶柱中色谱分离，首先用蒸馏水控制流速1.5mL/min冲洗5h，再用0.5M NaCL以同样流速继续冲洗3h、同时开始收集解析液，2h后更换1.0M NaCL作为解析剂以同样的流速洗涤1小时以上，后停止收集，收集液即为小麦麸皮活性多糖溶液；
（4）去盐：
将（3）步骤所得的小麦麸皮活性多糖溶液，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，冻干制得小麦麸皮活性多糖。
实施例4
小麦麸皮活性多糖的提取纯化方法，具体实施步骤如下：
a、预处理：首先对小麦麸皮原料进行挑选除杂，去除异物，之后在烘箱中55℃烘干，研磨过30目筛；
b、脱脂：
（1）乙醇脱脂：
将经a步骤处理的小麦麸皮粉50g中加入250mL85%乙醇，60℃加热回流搅拌3h，冷却后室温搅拌10h。4000rpm离心20min，弃去乙醇，小麦麸皮中再加入250mL85%乙醇室温搅拌3小时，离心后弃去乙醇，得乙醇脱脂麸皮；
（2）丙酮脱脂：
将乙醇脱脂后的小麦麸皮中加入100mL丙酮搅拌30min，离心后收集沉淀放到锡箔纸上在通风橱中自然干燥，制得脱脂麸皮；
c、多糖提取：
取b步骤制得脱脂麸皮50g加入1100mL蒸馏水，70℃加热回流搅拌6h，离心后收集液体，残渣按照相同程序再提取一次，离心后合并两次液体，50℃真空旋转蒸发后浓缩到200mL，加入800mL无水乙醇，3℃沉淀10h，4000rpm离心10min，收集沉淀通风橱中干燥，得到小麦麸皮粗多糖；
d、小麦麸皮粗多糖精制：
（1）去蛋白：
将c步骤制得的小麦麸皮粗多糖 3g加入24mL蒸馏水，之后加入Sevage试剂4mL，磁力搅拌器上高速搅拌20min，静置10min后4000rpm离心20min，弃去下层有机相和沉淀蛋白，取上层多糖溶液再加入Sevge试剂重复三次，上层溶液加入80mL无水乙醇，3℃沉淀10h，离心后取沉淀，再分别用75ml无水乙醇、75ml无水丙酮和75ml无水乙醚逐次洗涤，再用0.45μm的滤膜过滤，沉淀在通风橱中干燥12h，制得小麦麸皮去蛋白多糖；
（2）去低分子量杂质：
将（1）步骤所得的小麦麸皮去蛋白多糖溶于24mL蒸馏水中，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，真空冷冻干燥制得除杂质小麦麸皮粗多糖；
（3）吸附纯化：
将（2）步骤中得到的除杂质小麦麸皮粗多糖 250mg中加入2.5 mL蒸馏水中，加热至60℃溶解10min，注入DEAE-琼脂糖凝胶柱中色谱分离，首先用蒸馏水控制流速1.5mL/min冲洗5h，再用0.5M NaCL以同样流速继续冲洗3h、同时开始收集解析液，2h后更换1.0M NaCL作为解析剂以同样的流速洗涤1小时以上，后停止收集，所得的收集液即为小麦麸皮活性多糖溶液；
（4）去盐：
将（3）步骤所得的小麦麸皮活性多糖溶液，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，冻干制得小麦麸皮活性多糖；
其中：Sevage是由氯仿和正丁醇按4∶1的体积比混合制成。
实施例5
小麦麸皮活性多糖的提取纯化方法，具体实施步骤如下：
a、预处理：首先对小麦麸皮原料进行挑选除杂，去除异物，之后在烘箱中65℃烘干，研磨过60目筛；
b、脱脂：
（1）乙醇脱脂：
将经a步骤处理的小麦麸皮粉50g中加入750mL85%乙醇，80℃加热回流搅拌1.5h，冷却后室温搅拌18h。4000rpm离心20min，弃去乙醇，小麦麸皮中再加入750mL85%乙醇室温搅拌7小时，离心后弃去乙醇，得乙醇脱脂麸皮；
（2）丙酮脱脂：
将乙醇脱脂后的小麦麸皮中加入400mL丙酮搅拌30min，离心后收集沉淀放到锡箔纸上在通风橱中自然干燥，制得脱脂麸皮；
c、多糖提取：
取b步骤制得脱脂麸皮50g加入1500mL蒸馏水，90℃加热回流搅拌2h，离心后收集上清液，残渣按照相同程序再提取一次，离心后合并两次上清液，50℃真空旋转蒸发后浓缩到750mL，加入2.3L无水乙醇，6℃沉淀18h，4000rpm离心10min，收集沉淀通风橱中干燥，得到小麦麸皮粗多糖；；
d、小麦麸皮粗多糖精制：
（1）去蛋白：将c步骤制得的小麦麸皮粗多糖 3g加入到60mL蒸馏水中，之后加入Sevage试剂30mL，磁力搅拌器上高速搅拌20min，静置10min后4000rpm离心20min，弃去下层有机相和沉淀蛋白，取上层多糖溶液再加入Sevge试剂重复三次，上层溶液加入180mL无水乙醇，6℃沉淀18h，离心后取沉淀，再分别用135ml无水乙醇、135ml无水丙酮和135ml无水乙醚逐次洗涤，再用0.45μm的滤膜过滤，沉淀在通风橱中干燥12h，制得小麦麸皮去蛋白多糖；
（2）去低分子量杂质：
取（1）步骤所得的小麦麸皮去蛋白多糖溶于66mL蒸馏水，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，真空冷冻干燥制得除杂质小麦麸皮粗多糖；
（3）吸附纯化：
去d步骤中得到的除杂质小麦麸皮粗多糖 250mg中加入15 mL蒸馏水，加热至60℃溶解10min，注入DEAE-琼脂糖凝胶柱中色谱分离，首先用蒸馏水控制流速1.5mL/min冲洗5h，再用0.5M NaCL以同样流速继续冲洗3h、同时开始收集解析液，2h后更换1.0M NaCL作为解析剂以同样的流速洗涤1小时以上，后停止收集，所得的收集液即为小麦麸皮活性多糖溶液；
（4）去盐：
将（3）步骤所得的小麦麸皮活性多糖溶液，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，冻干制得小麦麸皮活性多糖；
其中：Sevage是由氯仿和正丁醇按6∶1的体积比混合制成。
实施例6
小麦麸皮活性多糖的提取纯化方法，具体实施步骤如下：
a、预处理：首先对小麦麸皮原料进行挑选除杂，去除异物，之后在烘箱中60℃烘干，研磨过40目筛；
b、脱脂：
（1）乙醇脱脂：
将经a步骤处理的小麦麸皮粉50g中加入300mL85%乙醇，65℃加热回流搅拌2.5h，冷却后室温搅拌12h。4000rpm离心20min，弃去乙醇，小麦麸皮中再加入500mL85%乙醇室温搅拌4小时，离心后弃去乙醇，得乙醇脱脂麸皮；
（2）丙酮脱脂：
将乙醇脱脂后的小麦麸皮中加入150mL丙酮搅拌30min，离心后收集沉淀放到锡箔纸上在通风橱中自然干燥，制得脱脂麸皮；
c、多糖提取：
取b步骤制得脱脂麸皮 50g加入1200mL蒸馏水，80℃加热回流搅拌5h。离心后收集液体，残渣按照相同程序再提取一次，离心后合并两次液体，50℃真空旋转蒸发后浓缩到400mL，加入1.6L无水乙醇，4℃沉淀12h，4000rpm离心10min，收集沉淀通风橱中干燥，得到小麦麸皮粗多糖；
d、小麦麸皮粗多糖精制：
（1）去蛋白：将c步骤制得的小麦麸皮粗多糖 3g加入30mL蒸馏水，之后加入Sevage试剂5mL，磁力搅拌器上高速搅拌20min，静置10min后4000rpm离心20min，弃去下层有机相和沉淀蛋白，取上层多糖溶液再加入Sevge试剂重复三次。上层溶液加入90mL无水乙醇，3℃沉淀12h，离心后取沉淀，再分别用90ml无水乙醇、90ml无水丙酮和90ml无水乙醚洗涤后，再用0.45μm的滤膜过滤，沉淀在通风橱中干燥12h，制得小麦麸皮去蛋白多糖；
（2）去低分子量杂质：
将（1）步骤所得的小麦麸皮去蛋白多糖溶于30mL蒸馏水中，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，真空冷冻干燥制得除杂质小麦麸皮粗多糖；
（3）吸附纯化：
将（2）步骤中得到的除杂质小麦麸皮粗多糖250mg中加入5 mL蒸馏水，加热至60℃溶解10min，注入DEAE-琼脂糖凝胶柱中色谱分离，首先用蒸馏水控制流速1.5mL/min冲洗5h，再用0.5M NaCL以同样流速继续冲洗3h、同时开始收集解析液，2h后更换1.0M NaCL作为解析剂以同样的流速洗涤1小时以上，后停止收集，所得的收集液即为小麦麸皮活性多糖溶液；
（4）去盐：
将（3）步骤所得的小麦麸皮活性多糖溶液，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，冻干制得小麦麸皮活性多糖；
其中：Sevage是由氯仿和正丁醇按5∶1的体积比混合制成。
实施例7
小麦麸皮活性多糖的提取纯化方法，具体实施步骤如下：
a、预处理：首先对小麦麸皮原料进行挑选除杂，去除异物，之后在烘箱中65℃烘干，研磨过50目筛；
b、脱脂：
（1）乙醇脱脂：
将经a步骤处理的小麦麸皮粉50g加入到500mL85%乙醇中，75℃加热回流搅拌2 h，冷却后室温搅拌16h，4000rpm离心20min，弃去乙醇，小麦麸皮中再加入650mL85%乙醇室温搅拌7小时，离心后弃去乙醇，得乙醇脱脂麸皮；
（2）丙酮脱脂：
将乙醇脱脂后的小麦麸皮中加入300mL丙酮搅拌30min，离心后收集沉淀放到锡箔纸上在通风橱中自然干燥，制得脱脂麸皮；
c、多糖提取：
取b步骤制得物质A 50g加入到1400mL蒸馏水中，90℃加热回流搅拌3h。离心后收集液体，残渣按照相同程序再提取一次，离心后合并两次液体，50℃真空旋转蒸发后浓缩到280mL，加入1.0无水乙醇，5℃沉淀16h，4000rpm离心10min，收集沉淀通风橱中干燥，得到小麦麸皮粗多糖；
d、小麦麸皮粗多糖精制：
（1）去蛋白：将c步骤制得的小麦麸皮粗多糖 3g加入45mL蒸馏水，之后加入Sevage试剂23mL，磁力搅拌器上高速搅拌20min，静置10min后4000rpm离心20min，弃去下层有机相和沉淀蛋白，取上层多糖溶液再加入Sevge试剂重复三次，上层溶液加入180mL无水乙醇，6℃沉淀16h，离心后取沉淀，再分别用120ml无水乙醇、120ml无水丙酮和120ml无水乙醚洗涤后，再用0.45μm的滤膜过滤，沉淀在通风橱中干燥12h，制得小麦麸皮去蛋白多糖；
（2）去低分子量杂质：
将（1）步骤所得的小麦麸皮去蛋白多糖溶于60mL蒸馏水中，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，真空冷冻干燥制得除杂质小麦麸皮粗多糖；
（3）吸附纯化：
将（2）步骤中得到的除杂质小麦麸皮粗多糖250mg中加入10 mL蒸馏水，加热至60℃溶解10min，注入DEAE-琼脂糖凝胶柱中色谱分离，首先用蒸馏水控制流速1.5mL/min冲洗5h，再用0.5M NaCL以同样流速继续冲洗3h、同时开始收集解析液，2h后更换1.0M NaCL作为解析剂以同样的流速洗涤1小时以上，后停止收集，所得的收集液即为小麦麸皮活性多糖溶液；
（4）去盐：
将（3）步骤所得的小麦麸皮活性多糖溶液，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，冻干制得小麦麸皮活性多糖；
其中：Sevage是由氯仿和正丁醇按6∶1的体积比混合制成。
实施例8
小麦麸皮活性多糖的提取纯化方法，具体实施步骤如下：
a、预处理：首先对小麦麸皮原料进行挑选除杂，去除异物，之后在烘箱中60℃烘干，研磨过40目筛；
b、脱脂：
（1）乙醇脱脂：
将经a步骤处理的小麦麸皮粉50g加入到500mL85%乙醇中，70℃加热回流搅拌2小时，冷却后室温搅拌过夜。4000rpm离心20min，弃去乙醇，小麦麸皮中再加入500mL85%乙醇室温搅拌5小时，离心后弃去乙醇，得乙醇脱脂麸皮；
（2）丙酮脱脂：
将乙醇脱脂后的小麦麸皮中加入200mL丙酮搅拌30min，离心后收集沉淀放到锡箔纸上在通风橱中自然干燥，制得脱脂麸皮；
c、多糖提取：
取b步骤制得脱脂麸皮50g中加入1250mL蒸馏水，90℃加热回流搅拌4h，离心后收集液体，残渣按照相同程序再提取一次，离心后合并两次液体，50℃真空旋转蒸发后浓缩到400mL，加入1.6L无水乙醇，4℃沉淀12h，4000rpm离心10min，收集沉淀通风橱中干燥，得到小麦麸皮粗多糖；
d、小麦麸皮粗多糖精制：
（1）去蛋白：
将c步骤制得的小麦麸皮粗多糖3g加入30mL蒸馏水，之后加入Sevage试剂6mL，，磁力搅拌器上高速搅拌20min，静置10min后4000rpm离心20min，弃去下层有机相和沉淀蛋白，取上层多糖溶液再加入Sevge试剂重复三次，上层溶液加入120mL无水乙醇，4℃沉淀12h，离心后取沉淀，再分别用100 mL无水乙醇、100 mL无水丙酮和100 mL无水乙醚逐次洗涤，再用0.45μm的滤膜过滤，沉淀在通风橱中干燥12h，制得小麦麸皮去蛋白多糖；
（2）去低分子量杂质：
将（1）步骤所得的小麦麸皮去蛋白多糖溶于溶于50mL蒸馏水中，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，真空冷冻干燥制得除杂质小麦麸皮粗多糖；
（3）吸附纯化：
将（2）步骤中得到的除杂质小麦麸皮粗多糖250mg中加入10mL蒸馏水，加热至60℃溶解10min注入DEAE-琼脂糖凝胶柱中色谱分离，首先用蒸馏水控制流速1.5mL/min冲洗5h，再用0.5M NaCL以同样流速继续冲洗3h、同时开始收集解析液，2h后更换1.0M NaCL作为解析剂以同样的流速洗涤1小时以上，后停止收集，所得的收集液即为小麦麸皮活性多糖溶液；
（4）去盐：
将（3）步骤所得的小麦麸皮活性多糖溶液，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，冻干制得小麦麸皮活性多糖；其中：Sevage是由氯仿和正丁醇按5∶1的体积比混合制成。
利用上述提取方法，其小麦麸皮活性多糖的得率及总糖量如表1所示，其小麦麸皮活性多糖的组成如表2所示：
表1 小麦麸皮粗多糖与小麦麸皮活性多糖得率
表2小麦麸皮粗多糖与小麦麸皮活性多糖的化学组成
表1、表2中，a得率=(多糖粗品重量/ 麸皮重量)×100 ，
b得率= (分离组分重量/注入分离柱多糖粗品的重量)×100。
Claims (4)
1.小麦麸皮活性多糖的提取纯化方法，其步骤如下：
a、预处理：将小麦麸皮去除杂质后，55～65℃烘干，研磨至30～60目；
b、脱脂：
（1）乙醇脱脂：
将经a步骤处理的小麦麸皮粉浸入为其重量5～15倍、纯度为85%的乙醇中，在60～80℃加热回流搅拌1.5～3h，冷却至室温继续搅拌10～18h，去除液体，二次加入其重量5～15倍、纯度为85%的乙醇，室温搅拌3～7h，去除液体；
（2）丙酮脱脂：
将乙醇脱脂后的小麦麸皮中加入其重量2～8倍、纯度为99%的丙酮溶液，搅拌30min后去除液体，在室温自然挥发干燥12h，得到脱脂麸皮；
c、多糖提取：
将b步骤制得的脱脂麸皮加入其重量22～30倍的水，在70℃～90℃下加热回流搅拌2～6h，取其液体，在加热至50℃蒸发，至其浓缩为原体积的1/6～1/2止，再加入乙醇至乙醇浓度不低于75%，降温至3～6℃静置10～18h后去除液体，在室温自然挥发干燥10～18h，制得小麦麸皮粗多糖；
d、小麦麸皮粗多糖精制：
（1）去蛋白：
将c步骤所得的小麦麸皮粗糖加入其重量8～20倍的水，再加入其体积份数为1/6～1/2的Sevage试剂，搅拌20min，去除下层液体及絮状沉淀物，在上层液体中加入乙醇至乙醇溶液浓度不小于75%，降温至3～6℃静置10～18h，去除液体，再分别用其重量25～45倍的无水乙醇、25～45倍的无水丙酮和25～45倍的无水乙醚逐次洗涤，再用0.45μm的滤膜过滤，将其沉淀物在自然挥发干燥10～18h，制得小麦麸皮去蛋白多糖；
（2）去低分子量杂质：
将（1）步骤所得的小麦麸皮去蛋白多糖溶于其重量8～20倍的水中，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，冻干制得除杂质小麦麸皮粗多糖；
（3）吸附纯化：
将（2）步骤得到的除杂质小麦麸皮粗多糖加入其重量为0.01～0.06倍的水、加热至60℃溶解，注入DEAE-琼脂糖凝胶柱中色谱分离，首先用蒸馏水控制流速1.5mL/min冲洗5h，再用0.5M NaCL以同样流速继续冲洗3h，同时开始收集解析液，2h后更换1.0M NaCL作为解析剂以同样的流速洗涤1小时以上，后停止收集，收集液即为小麦麸皮活性多糖溶液；
（4）去盐：
将（3）步骤所得的小麦麸皮活性多糖溶液，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，冻干制得小麦麸皮活性多糖。
2.根据权利要求1所述的小麦麸皮活性多糖的提取纯化方法，其特征在于操作步骤如下：
a、预处理：将小麦麸皮去除杂质后，60℃～65℃烘干，研磨至40～50目；
b、脱脂：
（1）乙醇脱脂：
将经a步骤处理的小麦麸皮粉浸入为其重量6～10倍、纯度为85%的乙醇中，在65℃～75℃加热回流搅拌2～2.5h，冷却至室温继续搅拌12～16h，去除液体，二次加入其重量10～13倍、纯度为85%的乙醇，室温搅拌4～6h，去除液体；
（2）丙酮脱脂：
将乙醇脱脂后的小麦麸皮中加入其重量3～6倍、纯度为99%的丙酮溶液，搅拌30min后去除液体，在室温自然挥发干燥12h，得到脱脂麸皮；
c、多糖提取：
将b步骤制得的脱脂麸皮加入其重量24～28倍的水，在80℃～90℃下加热回流搅拌3～5h，取其液体，在加热至50℃蒸发，至其浓缩为原体积的1/5～1/3止，再加入乙醇至乙醇浓度不低于75%，降温至4～5℃静置12～16h，后去除液体，在室温自然挥发干燥12h，制得小麦麸皮粗多糖；
d、小麦麸皮粗多糖精制：
（1）去蛋白：
将c步骤所得的小麦麸皮粗糖加入其重量10～15倍的水，再加入其体积份数为1/5～1/3的Sevage试剂，搅拌20min，去除下层液体及絮状沉淀物，在上层液体中加入乙醇至乙醇溶液浓度不小于75%，降温至4～5℃静置12～16h，去除液体，再分别用其重量30～40倍的无水乙醇、30～40倍的无水丙酮和30～40倍的无水乙醚逐次洗涤，再用0.45μm的滤膜过滤，将其沉淀物在自然挥发干燥12h，制得小麦麸皮去蛋白多糖；
（2）去低分子量杂质：
将（1）步骤所得的小麦麸皮去蛋白多糖溶于其重量10～20倍的水中，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，冻干制得除杂质小麦麸皮粗多糖；
（3）吸附纯化：
将（2）步骤得到的除杂质小麦麸皮粗多糖加入其重量为0.02～0.04倍的水、加热至60℃溶解，注入DEAE-琼脂糖凝胶柱中色谱分离，首先用蒸馏水控制流速1.5mL/min冲洗5h，再用0.5M NaCL以同样流速继续冲洗3h、同时开始收集解析液，2h后更换1.0M NaCL作为解析剂以同样的流速洗涤1小时以上，后停止收集，收集液即为小麦麸皮活性多糖溶液；
（4）去盐：
将（3）步骤所得的小麦麸皮活性多糖溶液，用3500Da透析膜透析3天，取其分子量大于3500Da的透析液，冻干制得小麦麸皮活性多糖。
3.根据权利要求1或2所述的小麦麸皮活性多糖的提取纯化方法，其特征在于：步骤c中，所述的待蒸发的液体为脱脂麸皮连续进行1次以上加热回流后合并的液体。
4.根据权利要求1或2所述的小麦麸皮活性多糖的提取纯化方法，其特征在于：步骤d（1）中，所述的上层液体为2次以上经过加入Sevag试剂、搅拌并去除下层液体及絮状沉淀物后合并的液体。
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